吳 香，李新福，李 聰，楊 婷，周 輝，杜先鋒，徐寶才,4,

（1.安徽農業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036；2.肉品加工與質量控制國家重點實驗室，江蘇雨潤肉食品有限公司，江蘇 南京 211806；3.合肥師范學院電子信息與電氣工程學院，安徽 合肥 230601；4.合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230036）

玉米淀粉產量大、且經濟實惠，被廣泛用于食品、制藥和化工等行業(yè)[1-2]。但玉米淀粉存在析水易老化、耐機械性差等缺陷，對其更進一步的應用帶來影響[3]。變性淀粉具有較好的吸水膨脹性、透明性[4-5]和糊化溫度低等特點，使得變性淀粉在食品應用中有著獨特的 優(yōu)勢[6-7]。肌原纖維蛋白是肌肉中的主要蛋白[8]，作為功能性蛋白質，除了可以維持肌纖維形態(tài)、參與肌肉收縮外，也是形成凝膠最重要的蛋白質[9]。蛋白質與淀粉多糖之間的相互作用形成的混合凝膠，賦予共混體系一些獨特的性質，使得淀粉-蛋白共混體系不僅可以改善蛋白的流變學特性[10-11]，而且對改進肉制品的硬度、彈性[12]和出品率也有著緊密的作用[13]。

夏秀芳等[14]研究馬鈴薯淀粉對鯉魚肌原纖維蛋白功能特性影響，發(fā)現馬鈴薯淀粉可提高肌原纖維蛋白的硬度、彈性、保水性及乳化穩(wěn)定性。Sun Fengyuan等[15]在肌原纖維蛋白中加入木薯淀粉和木薯變性淀粉，發(fā)現添加木薯淀粉可有效提高淀粉-蛋白復合物的保水性、質構特性，且添加量增大可顯著提高蛋白網絡的聚集性。然而目前對不同變性淀粉-蛋白復合物熱誘導凝膠的流變性、水分遷移情況以及淀粉與蛋白相互作用機制的基礎研究不透徹。

本實驗通過將不同變性淀粉添加到肌原纖維蛋白中（以玉米原淀粉為對照），通過對流變特性、質構特性、持水性和水分遷移等指標變化規(guī)律的分析，闡釋淀粉對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響機理，為玉米變性淀粉和木薯變性淀粉在肉制品中的進一步應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉 江蘇雨潤肉食品有限公司；玉米淀粉（native corn starch，NCS） 河北玉峰淀粉糖業(yè)有限公司；玉米乙?；矸哿姿狨ィ╝cetylated distarch phosphate，ADP） 嘉吉投資（中國）有限公司；木薯乙?；p淀粉己二酸酯淀粉（acetylated distarch adipate，ADA）、木薯醋酸酯變性淀粉（starch acetate，SA） 廣西農墾明陽生化集團；K2HPO4、Na2HPO4上海凌峰化學試劑有限公司；NaCl、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、MgCl2、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA） 濟寧百川化工有限公司；HCl、NaOH、CuSO4、酒石酸鉀鈉 國藥集團藥業(yè)股份有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA25高速分散乳化機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；CR21GIII型高速冷凍離心機 日本Hitachi Koki 公司；PHS-3C數字pH計 天津市盛邦科學儀器技術公司； 分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；MCR302流變儀 奧地利安東帕有限公司；TA.XT.Plus物性儀 英國SMS公司；MicroMR微型核磁共振成像儀 上海紐邁電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

參考伍夢婷[16]和Doerscher[17]等的方法并作修改，剔除雞胸肉結締組織和脂肪，切成小塊。在原料肉中加入4 倍體積提取液（10 mmol/L K2HPO4、0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EDTA，pH 7.0），用高速分散機勻漿（12 000 r/min，1 min，冰?。频玫膽腋∫褐糜诟咚倮鋬鲭x心機中離心（3 500h g，15 min，4 ℃），棄去上清液，取沉淀重復提取2 次，得到粗提的肌原纖維蛋白。

在粗提的肌原纖維蛋白中加入4 倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液，冰浴條件下12 000 r/min勻漿1 min，4 ℃、4 000h g離心15 min，重復提取1 次，取沉淀加入4 倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液，勻漿1 min，過40 目篩，用0.1 mol/L HCl溶液調節(jié)pH值至6.0，4 ℃、3 500h g離心15 min。棄去上清液，沉淀為提純的肌原纖維蛋白。蛋白質濃度采用雙縮脲法測定，以BSA為標準蛋白，最終繪制標準曲線為y=0.049 6x＋0.002 7，R2=0.999 8，所提取的蛋白在4 ℃冰箱保存，3 d內用完。

1.3.2 肌原纖維蛋白凝膠制備[18]

將肌原纖維蛋白溶于磷酸緩沖液（0.6 mol/L NaCl，50 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 6.5），蛋白質量濃度調整到70 mg/mL，分別加入肌原纖維蛋白溶液總量的0%、4%、6%、8%、10%、12%的淀粉，混合均勻后，量取20 mL蛋白于平底玻璃瓶中并封口（內徑36 mm，高60 mm），置于水浴鍋中以1 ℃/min的速率升溫到80 ℃，保溫50 min。然后取出放在0～4 ℃條件下冷藏12 h后進行測試。

1.3.3 肌原纖維蛋白流變特性測定

肌原纖維蛋白溶于磷酸緩沖液（0.6 mol/L NaCl、50 mmol/L Na2HPO4，pH 6.5），將蛋白質量濃度調整到20 mg/mL，分別加入肌原纖維蛋白溶液總量的0%、4%、6%、8%、10%、12%的淀粉，混合均勻。流變儀測試條件：夾具為50 mm平板，上下板夾縫1 mm，頻率0.1 Hz，應變?yōu)?%，從30 ℃以0.05 ℃/s升溫到80 ℃，板外加蓋防止溶液蒸發(fā)，儲能模量（G’）和相變角正切（tanδ）流變性指標隨溫度變化自動記錄，每個樣品測定5 個平行。

1.3.4 質構特性測定

采用質構分析儀進行凝膠強度測定。質構儀參數設定：測前探頭下降速率1 mm/s，測試速率5 mm/s，測后探頭上升速率5 mm/s，壓縮比50%；負載類型：Auto-5 g；探頭：P0.5R。每個樣品測定5 個平行。

1.3.5 復合凝膠保水性測定

參照Foegeding等[19]的方法進行參數設定。蛋白質量濃度調節(jié)至40 mg/mL，分別加入肌原纖維蛋白溶液總量的0%、4%、6%、8%、10%、12%的淀粉，混合均勻。制備成熱誘導凝膠后，于4 ℃冷藏24 h后8 000 r/min離心20 min，棄離心出液體并計算前后樣品質量差，每個樣品測定5 個平行。按下式計算凝膠保水性：

式中：m為離心管質量/g；m1為離心前凝膠和離心管總質量/g；m2為離心后凝膠和離心管總質量/g。

1.3.6 低場核磁共振自旋-自旋弛豫時間（T2）測定

將蛋白質量濃度調節(jié)至40 mg/mL，分別加入肌原纖維蛋白溶液總量的0%、4%、6%、8%、10%、12%的淀粉，混合均勻。取2 g樣品凝膠于15 mm玻璃小管中以1 ℃/min 的速率升溫到80 ℃后保溫30 min，再冷卻至室溫，所得凝膠置于4 ℃保存12 h后，進行核磁共振實驗。測試條件：質子共振頻率22 MHz，測量溫度32 ℃。T2弛豫時間用CPMG序列測量。參數設置：τ值設為250 μs，重復掃描次數為32，得到16 000 個回波。每個樣品測定5 個平行，得到指數衰減圖形后用儀器自帶的Multi Exp Inv Analysis 軟件進行反演，得到T2值以及弛豫幅值。

1.4 數據統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0軟件進行相關性分析和方差分析，方差顯著性分析用Duncan multiple-range test進行多重比較（P＜0.05），采用Origin 8.0軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 淀粉對肌原纖維蛋白流變特性的影響

圖 1 淀粉及添加量對肌原纖維蛋白流變性的影響Fig. 1 Effects of the type and amount of starches on rheological properties of MP

通過測定試樣G’和tanδ反映凝膠體的黏彈性變化[20]，能反映蛋白結構解折疊和聚集的不同階段及凝膠性能的強弱。由圖1A可知，各實驗組均在40～55 ℃之間，混合樣的G’逐步上升，在55～60 ℃間G’開始下降，在65 ℃后G’再次上升。與CK（40 ℃）相比，NCS、ADP、ADA和SA混合樣分別于42、43、44 ℃和46 ℃時G’開始上升，且G’于53 ℃左右達到峰值，G’分別為173、220、225 Pa和200 Pa。與CK組相比，淀粉的加入可延遲肌原纖維蛋白的變性溫度，添加變性淀粉比NCS的變性溫度延遲1～4 ℃，這說明淀粉的添加延緩了蛋白質分子變性，增強了蛋白在受熱過程中的熱穩(wěn)定性，這歸因于淀粉與肌原纖維蛋白之間的相互作用，且乙?；矸叟c蛋白間的相互作用更強[21]。在40 ℃左右時G’的增大來自于肌球蛋白頭部的接合，肌球蛋白尾部會隨著溫度的升高逐漸展開，導致肌球蛋白的頭部結合瓦解，致使G’下降；在溫度超過60 ℃后，隨著蛋白的變性伴隨著淀粉的糊化，二硫鍵的形成促進凝膠網絡交聯，使得G’持續(xù)增加，這與Egelandsdal等[22]在熱誘導肌球蛋白凝膠的動態(tài)流變學研究中結果基本一致。

tanδ值大于1時，表明樣品的黏性大于彈性，為黏性流體；小于1時，表明樣品的彈性大于黏性，為溶膠或凝膠。由圖1B可以看出，tanδ始終小于1，并且在30～45 ℃間呈上升趨勢，45～47 ℃略微平衡的狀態(tài)，從47 ℃之后逐步開始下降，55 ℃之后持續(xù)上升，在60 ℃達到最高。說明添加淀粉的肌原纖維蛋白在45 ℃之前隨著溫度的升高蛋白結構膨脹呈現出黏性溶膠的狀態(tài)，在45～47 ℃開始從溶膠向凝膠轉變，在47 ℃之后二硫鍵交聯加速彈性網絡的形成使得tanδ下降，當溫度升高至55 ℃，蛋白尾部的展開使得tanδ再次上升。

從圖1C～F可知，淀粉添加量對肌原纖維蛋白G’的總體變化趨勢影響不顯著，均呈現先上升后下降再上升的趨勢。G’隨淀粉添加量增加而增大，其中NCS添加量為8%，ADP、ADA和SA添加量為12%時蛋白質變性時G’達到最高且添加變性淀粉的G’高于原淀粉，但在 50～55 ℃淀粉添加量超過8%時蛋白變性G’峰值差異性不顯著（P＞0.05），說明變性淀粉添加量小于10%對肌原纖維蛋白流變特性有促進作用。這歸因于變性淀粉糊化溫度接近于蛋白質熱凝膠形成溫度，隨著溫度升高變性淀粉顆粒逐漸溶脹吸水并占據更多空間，從而混合物結構更緊湊；另外，隨著溫度的升高蛋白質結構發(fā)生 變化[23]，蛋白質分子開始凝膠化并析水，變性淀粉吸水膨脹后黏彈性高于NCS，從而導致變性淀粉蛋白混合樣發(fā)生變性時的G’更高。

2.2 淀粉對肌原纖維蛋白凝膠強度的影響

圖 2 淀粉及添加量對肌原纖維蛋白凝膠強度的影響Fig. 2 Effects of the type and amount of starches on gel strength of MP

由圖2 可知，C K 組（0%）肌原纖維蛋白的凝膠強度顯著低于添加淀粉的肌原纖維蛋白凝膠強度 （P＜0.05）。添加6%～12%的NCS對肌原纖維蛋白的凝膠強度影響不顯著（P＞0.05）；添加ADP、ADA和SA對淀粉-蛋白復合物的凝膠強度均呈現先增大后減小的趨勢，ADP、ADA和SA均在添加8%時凝膠強度最高，但3 種變性淀粉的添加量對凝膠強度的增加程度有所差異（ADA＞ADP＞SA＞NCS），其中添加8%的ADA的凝膠強度達193.90 g。這表明淀粉種類和添加量對淀粉-蛋白復合物凝膠強度有直接影響，添加0%～8%變性淀粉對其凝膠強度有促進作用。有研究表明淀粉糊化溫度越低，對蛋白的支撐效應越強[24]。根據之前的研究結果ADA、SA和ADP糊化溫度顯著低于原淀粉，其中ADA糊化溫度最低，其混合物凝膠強度顯著高于其他組。另外，變性淀粉與肌原纖維蛋白中的一些反應基團， 如—NH2、—OH和—SH相互作用，參與蛋白質內的交聯反應，并與其他生物分子群體相互作用，起到很好的膠黏作用，使得淀粉-蛋白復合物在外界壓力下不會輕易破裂，該結果與呂振磊等[25]研究結果一致。另有研究報道稱凝膠強度的增加是基于肌原纖維蛋白凝膠網絡內的糊化淀粉顆粒的“充填效應”[26]，從而淀粉顆粒內部吸水膨脹產生抗凝膠網絡束縛的一種內在壓力。因此，淀粉對于復合凝膠的充填效應與溫度和淀粉顆粒大小有顯著的相關性，淀粉顆粒越大，形成凝膠溫度與淀粉糊化溫度越接近，淀粉對凝膠的支撐效應越好，從而復合凝膠的強度越大。另外，隨著添加量的增加，淀粉糊化需要吸收更多的水分，而肌原纖維蛋白體系中可利用的游離水分減少，淀粉不能充分糊化，導致凝膠強度降低。所以添加適量的淀粉可對淀粉-肌原纖維蛋白體系的凝膠強度起到促進作用，而當變性淀粉添加量大于8%時，過多的淀粉存在則會阻礙肌原纖維蛋白自身凝膠的形成，從而降低了整個體系的凝膠強度。

2.3 淀粉對肌原纖維蛋白保水性的影響

圖 3 淀粉及添加量對肌原纖維蛋白保水性的影響Fig. 3 Effects of the type and amount of starches on water-holding capacity of MP

由圖3可知，復合凝膠保水性隨著淀粉添加量的增大呈先增大后平緩的趨勢；淀粉添加量為4%時，SA與ADA保水性顯著高于NCS（P＜0.05）；淀粉添加量達8%時淀粉-蛋白復合物保水性趨于穩(wěn)定（P＞0.05），變性淀粉保水性比NCS的保水性高約15%～18% （P＜0.05）。結果表明，添加淀粉可顯著提高肌原纖維蛋白的保水性，添加變性淀粉對保水性增強作用更佳，但淀粉添加量過高對肌原纖維蛋白保水性無顯著促進作用，這與凝膠強度結果一致。這主要是因為ADP中均含有磷酸酯基團，可有效增加淀粉的膨潤率[27]，充分吸收蛋白脫水縮合出的水分，對復合蛋白凝膠體系起到支撐作用，Tong Qunyi等[28]也有類似的報道；ADA通過乙?；冃砸胍阴；x予淀粉產品更好的親水性能，交聯處理能增加淀粉顆粒分子內部和分子間的聯系，增加了淀粉結構中交聯的密度，促進了凝膠強度，從而提高了肌原纖維蛋白的保水性；SA中含有親水性更強的羥基，在肌原纖維蛋白加熱過程中，會吸收更多的水分，從而提高了吸水率。但添加量越大，蛋白變性后可供淀粉顆粒糊化吸收的水分減少，從而導致添加量越大，保水性無顯著差異。另外，變性淀粉的糊化溫度較原淀粉低，且淀粉結構顯著不同，經升溫加熱后形成的淀粉-蛋白復合物結構也存在差異，從而導致水分子進入結構內部的難易程度不同，造成保水性不同。

2.4 淀粉種類對肌原纖維蛋白水分遷移的影響

圖 4 淀粉及添加量對肌原纖維蛋白水分遷移的影響Fig. 4 Effects of the type and amount of starches on moisture migration of MP

如圖4所示，T2弛豫時間反映水分的自由度，各狀態(tài)下水分的結合狀態(tài)和自由移動程度。從圖4A可以看出，CK組T23（自由水）含量顯著高于淀粉組，T23對應的水流動性較大，是位于高度組織化蛋白質結構內部的水以及存在于細胞間隙中能自由流動的水。添加淀粉后T22向慢弛豫時間上移動，弛豫速度降低，峰面積百分數逐漸增加；添加NCS的T22弛豫時間比添加變性淀粉弛豫時間長，但峰面積顯著低于變性淀粉，添加ADA和SA的肌原纖維蛋白T22差異性不顯著。T22向慢弛豫時間方向上移動是由于加入淀粉后經過加熱保溫而形成的凝膠網絡限制了水分子的移動，從而往T22這部分的水移動性下降，加熱后熱誘導凝膠強度增大，從而限制了水分的移動，導致T22弛豫時間降低。另外，隨著溫度的升高，淀粉與蛋白質功能基團以離子鍵或氫鍵結合，吸取極性基團附近的水分，其中變性淀粉中含有的親水性的乙酰基和羥基基團更易吸取水分，避免了氫鍵連接點的直接暴露，從而增強了鄰近多肽非極性片段的疏水相互作用，進而穩(wěn)定蛋白質的高級結構。此外，蛋白質內部各亞基疏水基團暴露與淀粉的疏水端結合，各亞基之前重新相互作用使得蛋白凝膠三維網絡得以形成并束住水分[29]。

從圖4B～E可以看出，淀粉添加量對肌原纖維蛋白水分遷移影響顯著，隨著添加量增加，ADP和ADA的T22值呈逐漸增大的趨勢，在添加量為12%時達到最大值；而NCS和SA呈先增大后減小再增大的趨勢，NCS和SA分別在添加量為12%和10%時達到最大值。T22峰面積隨著添加量的增加而增大，說明自由水向不易流動水遷移，使得復合凝膠保水性提高，這可能是因為肌原纖維蛋白的正電荷和負電荷數量增大，形成較多與周圍水分子結合的氫鍵結合位點，靜電荷的增加也會造成肌絲的相互排斥，從而使肌原纖維蛋白膨脹，使得其中保留更多的水分。另外，弛豫時間受淀粉種類及添加量的作用影響較大，與NCS相比，添加變性淀粉可顯著降低淀粉-蛋白復合物中水分的T2弛豫時間，ADA和SA的T2弛豫時間比ADP降低的更為顯著。這歸因于ADA和SA中的己二酸酯和羥基基團與肌原纖維蛋白中的功能基團相互作用較強，它們與分區(qū)表面的生物大分子相互作用的差異使其弛豫性質差異很大[15,30]。Brownstein等[31]認為水和大分子快速交換時，水大分子的距離決定了弛豫速度，距離增加使弛豫時間延長。因此，經加熱后蛋白質聚集會降低水質子的弛豫時間，偶極子之間的相互作用會變弱，從而生物大分子阻礙了水分子的移動。

3 結 論

淀粉種類及添加量對肌原纖維蛋白的流變特性、凝膠強度、保水性和水分分布狀態(tài)有顯著影響。添加變性淀粉可顯著提高肌原纖維蛋白變性的G’，可延遲肌原纖維蛋白變性溫度1～4 ℃，添加ADA蛋白變性溫度延長最大。添加小于10%的變性淀粉可顯著提高淀粉-蛋白復合物的凝膠強度，原淀粉的添加量對肌原纖維蛋白的凝膠強度影響不顯著，添加8% ADA的淀粉-蛋白復合物凝膠強度顯著高于其他實驗組。變性淀粉-蛋白復合物的保水性優(yōu)于原淀粉，SA-蛋白復合物與ADA-蛋白復合物保水性較好。當淀粉添加量超過6%時，添加量對肌原纖維蛋白的保水性無顯著影響。另外，變性淀粉可降低肌原纖維蛋白水分子的弛豫時間和移動性。因為變性淀粉于肌原纖維蛋白中經加熱可使蛋白質分子展開、聚集，正負電荷數量增大，形成較多的與周圍水分子結合的氫鍵結合位點，使得多肽鏈之間的氫鍵更佳穩(wěn)定，促進形成更穩(wěn)定的三維網絡結構，肌原纖維蛋白的膨脹，從而保留了更多的水分。