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焦磷酸鈉對(duì)氧化豬肉肌原纖維蛋白的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶交聯(lián)反應(yīng)及凝膠性能的影響

2020-02-10 15:33耿曉茜張?jiān)骆?/span>趙虹霏李春強(qiáng)
食品科學(xué) 2020年2期
關(guān)鍵詞:肌原纖維羰基巰基

孫 悅,耿曉茜,張?jiān)骆?,?石,石 蕊,趙虹霏,李春強(qiáng)

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110866)

微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶( m i c r o b i a l transglutaminase,MTG)在肉制品中應(yīng)用廣泛,可以催化谷氨酰胺與賴氨酸殘基發(fā)生?;D(zhuǎn)移反應(yīng)使蛋白之間交聯(lián),形成高黏性的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),以穩(wěn)定的包裹肉制品中的水分和脂肪球,改善肉制品的凝膠性能。MTG催化交聯(lián)反應(yīng)除了受溫度、pH值、金屬離子等因素影響外,還與可利用的谷氨酰胺和賴氨酸殘基含量密切相關(guān)[1], 肌原纖維蛋白由于含有豐富且充分暴露的可利用的氨基酸底物[2],是良好的MTG交聯(lián)底物。然而,肌肉蛋白富含脂質(zhì)、金屬離子和血紅素類化合物等促氧化物質(zhì),在冷凍、貯藏、運(yùn)輸和加工過(guò)程中易被氧化,導(dǎo)致肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[3]。李春強(qiáng)[4]研究表明,輕度氧化引起的肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)展開,可暴露更多的谷氨酰胺和賴氨酸殘基,從而促進(jìn)MTG交聯(lián),而深度氧化造成的氨基酸修飾以及蛋白聚集,會(huì)遮蔽MTG底物氨基酸,從而抑制MTG交聯(lián)。由于磷酸鹽是肉制品中常用的食品添加劑,且可引起肌球蛋白構(gòu)象、活性氨基酸殘基和肌動(dòng)球蛋白解離等變化[5],而且還會(huì)改變肌原纖維蛋白的氧化模式[6],故磷酸鹽可能會(huì)影響MTG交聯(lián)反應(yīng),進(jìn)而改變蛋白凝膠特性。本實(shí)驗(yàn)以豬外脊肉提取的肌原纖維蛋白為研究對(duì)象,以羥自由基氧化系統(tǒng)為模型,研究焦磷酸鈉(sodium pyrophosphate,TSPP)對(duì)天然和氧化肌原纖維蛋白的MTG交聯(lián)程度和蛋白凝膠性能的影響,以期闡明TSPP、氧化、MTG交聯(lián)和蛋白凝膠性能之間的關(guān)系,為MTG及其他相似的交聯(lián)酶類在肉制品中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷鮮豬外脊肉購(gòu)于沈陽(yáng)興隆大家庭超市,豬品種為大白豬,其具有體型大、繁殖能力強(qiáng)、屠宰率高等特點(diǎn)。

M T G(1 0 0 U/g) 江蘇一鳴生物制藥有限公司;水溶性V E(T r o l o x) 上海麥克林生化科技有限公司;H2O2、T S P P、乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt, E D T A-N a2) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;哌嗪-N,N’-(2-乙磺酸)(piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid),PIPES)、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME) 美國(guó)Genview生化試劑公司;沒(méi)食子酸丙酯(propyl gallate,PG) 上海瑞永生物科技有限公司;N-乙基馬來(lái)酰亞胺(N-ethylmaleimide,NEM) 百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AUY120電子分析天平 日本島津公司;Cary 50紫外-可見光分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司;5804R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;GE-250電泳儀、AI600(UV)超靈敏多功能成像儀 美國(guó)GE公司;DHR-1流變儀 美國(guó)TA公司;CT3 10K質(zhì)構(gòu)分析儀 美國(guó)Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

參考Park等[7]的方法,并加以調(diào)整。在最后一次離心前,用3 層100 目絹布過(guò)濾,并將其pH值調(diào)到6.25,離心所得沉淀即為肌原纖維蛋白。提取出的肌原纖維蛋白存于冰盒中(0 ℃),并在18 h內(nèi)用完。蛋白含量測(cè)定采用雙縮脲法。

1.3.2 TSPP處理及氧化模型的構(gòu)建

參考Xiong Youling等[8]的方法,將30 mg/mL肌原纖維蛋白分散于1 mmol/L TSPP、2 mmol/L MgCl2、 0.6 mol/L NaCl的15 mmol/L PIPES緩沖液(pH 6.25),處理2 h。添加氧化劑(0.01 mmol/L FeC13,0.1 mmol/L抗壞血酸,1、5、10、20 mmol/L H2O2)于4 ℃氧化2 h。通過(guò)添加PG-Trolox-EDTA-Na2(1 mmol/L)終止氧化反應(yīng)。未加氧化劑但含有PG-Trolox-EDTA-Na2的蛋白溶液作為對(duì)照。

1.3.3 MTG處理

在氧化和未氧化的肌原纖維蛋白中加入MTG(酶∶底物=1∶20)于4 ℃交聯(lián)2 h,用0.1% NEM終止反應(yīng)。

1.3.4 羰基含量測(cè)定

參考Levine等[9]的方法采用2,4-二硝基苯肼法測(cè)定羰基含量。處理后的樣品在波長(zhǎng)370 nm處測(cè)定吸光度(羰基含量),于波長(zhǎng)280 nm處測(cè)定吸光度(蛋白含量)。用最大吸光度以消光系數(shù)為22 000 L/(mol?cm)計(jì)算每克蛋白質(zhì)羰基含量。

1.3.5 巰基含量測(cè)定

按照Liu Gang等[10]的方法測(cè)定。蛋白溶液與5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)反應(yīng),在波長(zhǎng)412 nm處測(cè)定吸光度,巰基含量根據(jù)摩爾消光系數(shù)13 600 L/(molg cm)計(jì)算。

1.3.6 自由氨基含量測(cè)定

MTG交聯(lián)前后的樣品分別與2,4,6-三硝基苯磺酸反應(yīng)測(cè)定自由氨基含量[11]。同時(shí)以一系列濃度的L-亮氨酸在相同條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,樣品自由氨基含量依據(jù)所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線確定。

1.3.7 SDS-PAGE的測(cè)定

參考Park等[7]的方法,采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)測(cè)定。分離膠12%、濃縮膠4%,還原劑為β-ME,用GE的AI600超靈敏多功能成像儀成像及分析。

1.3.8 動(dòng)態(tài)流變學(xué)測(cè)定

使用流變儀測(cè)定肌原纖維蛋白在程序升溫過(guò)程中凝膠形成所產(chǎn)生的力學(xué)變化[12]。30 mg/mL肌原纖維蛋白溶液(800h g,1 min,4 ℃去除氣泡)均勻涂布于流變儀的下平板上,將40 mm上平板降至1 mm時(shí)去除其周圍多余的樣品,并在邊緣涂上硅油以防水分流失。采用振蕩模式以1 ℃/min的速率進(jìn)行升溫(20→75 ℃)。振蕩頻率為0.1 Hz,控制最大應(yīng)力為0.02。凝膠性能通過(guò)儲(chǔ)存模量(G’)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.9 凝膠強(qiáng)度測(cè)定

取5 g 30 mg/mL的蛋白液,放入15 mmh 40 mm密封的玻璃瓶中,保持膠面水平放入水浴鍋中,以 1.2 ℃/min的升溫速率,從20 ℃加熱至75 ℃。達(dá)到75 ℃后,立即將樣品放入冰水中冷卻,并置于4 ℃過(guò)夜。凝膠強(qiáng)度測(cè)定前,將凝膠樣品放在室溫下平衡1 h,利用美國(guó)Brookfield CT3質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定凝膠強(qiáng)度。采用TA5探頭,測(cè)試速率為0.3 mm/s。

1.3.10 持水性測(cè)定

將小玻璃瓶中的凝膠轉(zhuǎn)移至離心管中,記錄原始凝膠質(zhì)量。然后10 000h g離心15 min,去除上清液,將離心管倒置于鋪有濾紙的桌面上,10 min后稱量離心后凝膠沉淀質(zhì)量。持水性按下式計(jì)算:

式中:m0為離心管質(zhì)量/g;m1為離心前離心管和凝膠質(zhì)量/g;m2為離心后離心管和凝膠質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)的平均值。數(shù)據(jù)處理使用Statistix 9軟件進(jìn)行方差分析和顯著性分析(LSD法),不同顯著性數(shù)據(jù)用不同字母標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 TSPP對(duì)肌原纖維蛋白氧化程度的影響

2.1.1 羰基含量分析

圖 1 TSPP對(duì)肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig. 1 Effect of TSPP on carbonyl content of myofibrillar protein

當(dāng)肌原纖維蛋白暴露于氧化環(huán)境時(shí),蛋白中許多氨基酸殘基的側(cè)鏈易被修飾,并且發(fā)生肽鍵裂解,導(dǎo)致羰基化合物的產(chǎn)生[13],因此,羰基是蛋白質(zhì)氧化的標(biāo)志性產(chǎn)物。由圖1可知,未氧化肌原纖維蛋白的羰基含量為1.51 μmol/g,此結(jié)果與前期報(bào)道相近[10]。蛋白質(zhì)羰基含量與H2O2濃度呈正相關(guān),隨著H2O2濃度的增加,羰基含量顯著增加(P<0.05)。當(dāng)H2O2濃度為20 mmol/L時(shí),羰基含量比未氧化樣品增加60.07%。

經(jīng)+TSPP所有樣品的羰基含量均低于-TSPP樣品,特別當(dāng)H2O2溶液濃度為1~10 mmol/L時(shí),+TSPP樣品的羰基含量顯著低于-TSPP樣品??傮w來(lái)看,隨著H2O2溶液濃度的增加,+TSPP樣品增幅稍緩于-TSPP樣品。這與 陸玉芹[14]和張杰等[15]的研究結(jié)果相符,可能是由于TSPP螯合肌原纖維蛋白氧化體系中促氧化的金屬離子,從而抑制肌原纖維蛋白氧化。

2.1.2 巰基含量分析

圖 2 TSPP對(duì)肌原纖維蛋白巰基含量的影響Fig. 2 Effect of TSPP on sulfhydryl group content of myofibrillar protein

半胱氨酸殘基中含有大量的巰基,這些巰基很容易受到羥自由基的攻擊而轉(zhuǎn)化成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵[16]。 因此,巰基含量下降是評(píng)估蛋白質(zhì)氧化程度的重要依據(jù)。如圖2所示,無(wú)論是否添加TSPP,隨著H2O2溶液濃度的增加,巰基含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì),當(dāng)H2O2溶液濃度大于10 mmol/L時(shí),巰基含量顯著下降(P<0.05),且+T S P P 樣品的巰基含量顯著高于-T S P P 樣品 (P<0.05)。當(dāng)H2O2溶液濃度達(dá)到20 mmol/L時(shí), -TSPP處理樣品的巰基含量下降了65.94%,+TSPP處理的蛋白樣品下降57.74%,可見TSPP對(duì)肌原纖維蛋白氧化具有一定的保護(hù)作用。

劉澤龍[6]采用0.5 mmol/L H2O2溶液羥基生成系統(tǒng)在4 ℃氧化含焦磷酸鈉的肌球蛋白12 h或者24 h,發(fā)現(xiàn)焦磷酸對(duì)肌球蛋白S1和S2部位的氧化具有保護(hù)作用。從本研究的羰基和巰基結(jié)果可以看出,TSPP對(duì)肌原纖維蛋白氧化具有一定的保護(hù)作用,這與劉澤龍[6]的報(bào)道相符。但是對(duì)比劉澤龍結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn)TSPP對(duì)肌原纖維蛋白的保護(hù)效果小于對(duì)肌球蛋白的保護(hù)效果。這可能是由于在肌原纖維蛋白中,部分肌球蛋白的S1仍與肌動(dòng)蛋白結(jié)合,形成了空間阻礙作用[17-18]。

2.2 TSPP對(duì)肌原纖維蛋白交聯(lián)程度的影響

2.2.1 自由氨基含量分析

如圖3所示,肌原纖維蛋白的自由氨基含量隨著H2O2溶液濃度的增加而顯著降低(P<0.05),這是因?yàn)橘嚢彼岬摩?NH2基團(tuán)非常容易受到羥自由基攻擊轉(zhuǎn)化為羰基,而新生成的羰基又可能與NH2共價(jià)結(jié)合進(jìn)一步降低自由氨基的含量[8],所以自由氨基含量的變化在一定程度上也可反映蛋白氧化程度。由圖3還可看出,所有+TSPP氧化樣品(H2O2溶液濃度為1~20 mmol/L)的自由氨基的降低幅度顯著小于-TSPP樣品(P<0.05),這可能是因?yàn)門SPP對(duì)肌原纖維蛋白氧化起到保護(hù)作用,這與羰基 (圖1)和巰基(圖2)的結(jié)果相符。

圖 3 TSPP和MTG處理后肌原纖維蛋白自由氨基含量的變化Fig. 3 Change in free amine content of myofibrillar protein treated with TSPP and then cross-linked with MTG

表 1 MTG引起的自由氨基、凝膠強(qiáng)度、持水性的相對(duì)變化量Table 1 Percent variations in free amine content, gel strength, and water-holding capacity caused by MTG cross-linking%

賴氨酸的?-氨基是MTG交聯(lián)的一個(gè)反應(yīng)底物,因此自由氨基的降低量可以間接反映MTG交聯(lián)反應(yīng)的程度[19-20]。 如圖3所示,經(jīng)MTG處理后,所有樣品的自由氨基含量均顯著下降(P<0.05)。為了排除氧化的影響且只觀察MTG交聯(lián)程度,通過(guò)計(jì)算相同氧化條件下MTG交聯(lián)前后自由氨基的相對(duì)降低量(表1),可見自由氨基相對(duì)降低量隨著H2O2溶液濃度增大出現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì),在H2O2溶液濃度為10 mmol/L時(shí)達(dá)到最大,特別是+TSPP樣品自由氨基降幅高達(dá)43.60%??傮w來(lái)說(shuō),MTG交聯(lián)后, +TSPP氧化樣品的自由氨基相對(duì)降低量高于-TSPP氧化樣品,說(shuō)明TSPP處理有利于MTG交聯(lián)。這可能與TSPP引起的蛋白結(jié)構(gòu)變化有關(guān):其一,TSPP解離肌原纖維中的肌動(dòng)球蛋白,產(chǎn)生更多自由的肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白,降低了空間位阻,暴露更多可利用的谷氨酰胺和賴氨酸殘基;其二,TSPP與肌球蛋白頭部活性部位結(jié)合時(shí)改變了肌球蛋白空間結(jié)構(gòu)[5],使肌球蛋白中的谷氨酰胺和賴氨酸殘基更易于MTG接近。然而,只有在H2O2溶液濃度為1~5 mmol/L時(shí)+TSPP氧化樣品的自由氨基相對(duì)降低量才顯著高于-TSPP氧化樣品(P<0.05),而當(dāng)H2O2溶液濃度為10~20 mmol/L時(shí)二者差異不顯著,這說(shuō)明過(guò)度氧化時(shí)TSPP促進(jìn)MTG交聯(lián)的作用被大大削弱了,可能與過(guò)度氧化引起的蛋白聚集物所形成的空間位阻有關(guān),也可能與谷氨酰胺和賴氨酸殘基被過(guò)度氧化修飾有關(guān)。

2.2.2 SDS-PAGE測(cè)定結(jié)果

圖 4 TSPP和MTG處理后肌原纖維蛋白的SDS-PAGE模式Fig. 4 SDS-PAGE patterns of myofibrillar protein treated with TSPP and then cross-linked with MTG

由圖4a可知,無(wú)論是否添加TSPP,隨著H2O2溶液濃度增加,樣品中肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC)逐漸減少,肌動(dòng)蛋白條帶變化不大。同時(shí),濃縮膠上方有聚集體出現(xiàn)。當(dāng)添加β-ME還原后(圖4b),聚集體大部分消失,并且減少的MHC條帶大多能夠恢復(fù)到氧化前接近的水平,說(shuō)明這些條帶的減少主要是通過(guò)二硫鍵生成了蛋白聚集物,而少量沒(méi)有恢復(fù)的部分,很可能是肌原纖維蛋白提取過(guò)程中或氧化過(guò)程中通過(guò)其他共價(jià)鍵生成的聚集物,如羰基-氨基、酪氨酸-酪氨酸、賴氨酸-脂肪氧化產(chǎn)物(如丙二醛)-賴氨酸等反應(yīng)形成的共價(jià)鍵[21-23]。 對(duì)比TSPP處理前后的電泳圖(圖4a),發(fā)現(xiàn)當(dāng)H2O2溶液濃度小于5 mmol/L時(shí),+TSPP樣品的MHC條帶相對(duì)較粗,說(shuō)明TSPP對(duì)蛋白氧化具有一定抑制作用,這與羰基(圖1)、巰基(圖2)和自由氨基(圖3)的結(jié)果相符。然而,當(dāng)H2O2溶液濃度達(dá)到10~20 mmol/L,-TSPP樣品的MHC條帶反而比相同氧化條件下+TSPP樣品的粗 (圖4a),加入β-ME后(圖4b),+TSPP樣品的MHC條帶強(qiáng)度小于-TSPP樣品的MHC條帶強(qiáng)度,且濃縮膠上部的大分子聚集物反而比-TSPP樣品的多,這可能是由于在TSPP條件下,重度氧化蛋白除了通過(guò)二硫鍵進(jìn)行交聯(lián)外,還更傾向于通過(guò)其他的共價(jià)鍵進(jìn)行交聯(lián)。

對(duì)比圖4a、c發(fā)現(xiàn),MTG交聯(lián)后,所有樣品的MHC顯著減少,且濃縮膠頂部的大分子聚集物濃度增加。添加β-ME后,圖4d中濃縮膠頂部的聚集物也明顯比圖4b中多,可見這些聚集體是由MTG催化形成的異肽鍵 ε(γ-谷氨基)-賴氨酸連接在一起的、不含二硫鍵的巨大分子[24]。對(duì)比圖4b、d還發(fā)現(xiàn),+TSPP樣品的MHC和肌動(dòng)蛋白條帶明顯比相同氧化條件下-TSPP樣品的條帶細(xì),說(shuō)明TSPP處理后,肌原纖維蛋白更容易發(fā)生MTG交聯(lián)。這也正好印證了自由氨基的結(jié)果(圖3)。

2.3 TSPP對(duì)肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

2.3.1 動(dòng)態(tài)流變學(xué)分析

G’通常用來(lái)描述凝膠的彈性性狀,G’越高,凝膠彈性越好[25]。如圖5A所示,隨著溫度升高,G’增長(zhǎng)緩慢,此時(shí)肌原纖維蛋白間相互作用較弱。當(dāng)溫度升到40 ℃以后G’迅速增大,這是由于加熱使肌原纖維蛋白變性,結(jié)構(gòu)開始展開。未氧化樣品的G’在46 ℃出現(xiàn)一個(gè)峰值,這是由于加熱使肌原纖維蛋白間發(fā)生交聯(lián),尤其是肌球蛋白頭部交聯(lián),呈現(xiàn)出彈性較好的結(jié)構(gòu)[26-27]。G’達(dá)到峰值后便逐漸下降,這很可能與肌球蛋白尾部解螺旋有關(guān),導(dǎo)致蛋白流動(dòng)性增加[28]。而隨著溫度繼續(xù)升高,蛋白質(zhì)在二硫鍵、疏水作用、氫鍵等作用下重新相互作用加強(qiáng),逐步形成不可逆的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),因此G’繼續(xù)升高。當(dāng)溫度接近75 ℃時(shí),G’趨于穩(wěn)定,這是由于肌原纖維蛋白逐漸形成了穩(wěn)定的凝膠體系[29]。

圖 5 未經(jīng)TSPP處理(A)和TSPP處理(B)的肌原纖維蛋白流變Fig. 5 Rheograms of myofibrillar protein not treated with TSPP (A) and treated with TSPP (B)

如圖5A所示,當(dāng)肌原纖維蛋白在無(wú)TSPP條件下氧化時(shí),隨著H2O2溶液濃度從1 mmol/L升至20 mmol/L,G’峰位置向溫度低的方向偏移,且峰值逐漸降低,這可能是由于氧化破壞蛋白的空間結(jié)構(gòu),使疏水結(jié)構(gòu)暴露,進(jìn)而導(dǎo)致G’峰位置和峰值發(fā)生變化[30]。隨著溫度逐漸升至75 ℃時(shí),所有樣品的G’也呈逐漸上升的趨勢(shì)。加入MTG交聯(lián)后,G’峰值進(jìn)一步增加,峰位置向溫度低的方向偏移,這與MTG催化肌原纖維蛋白交聯(lián)導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。相對(duì)于未交聯(lián)樣品,溫度升至75 ℃時(shí),G’顯著增加。為了觀察MTG交聯(lián)作用對(duì)肌原纖維蛋白凝膠性能的影響,計(jì)算由MTG交聯(lián)引起的G’增幅,發(fā)現(xiàn)其與氧化程度相關(guān),即隨著H2O2溶液濃度升高(1~20 mmol/L),G’增幅反而從30.32%逐漸降至14.07%,可見在無(wú)TSPP條件下MTG催化所引起的凝膠性能提高與氧化程度相關(guān),即蛋白氧化抑制MTG交聯(lián)所引起的凝膠性能的提高。

相對(duì)于-TSPP條件(圖5A),在TSPP條件下,未氧化樣品的G’峰位置向溫度高的方向移動(dòng),出現(xiàn)在48.1 ℃,且峰值增大(圖5B),這可能是由TSPP對(duì)S1部位氧化具有保護(hù)作用,抑制起始階段蛋白的聚集,使變形溫度升高約2 ℃。隨著H2O2溶液濃度從1 mmol/L升至20 mmol/L, G’峰位置繼續(xù)向溫度低的方向偏移。MTG交聯(lián)后,TSPP處理肌原纖維蛋白的峰值顯著增大(P<0.05),這與Lesiow等[31]結(jié)論相符。加熱至75 ℃時(shí),+TSPP樣品(圖5B)的G’明顯高于-TSPP樣品(圖5A),可以看出,TSPP可以提高肌原纖維蛋白凝膠性能。但若扣除氧化所引起的凝膠性能變化,只觀察在TSPP條件下MTG交聯(lián)所引起的凝膠性能變化,發(fā)現(xiàn)在TSPP條件下隨著H2O2溶液濃度升高(1~20 mmol/L),由MTG交聯(lián)引起的G’增幅從75.19%逐漸降低至2.47%,變化十分劇烈。由此可見,相對(duì)于-TSPP樣品,TSPP處理使蛋白氧化對(duì)MTG交聯(lián)引起的凝膠性能提高具有更強(qiáng)的抑制作用。

2.3.2 凝膠強(qiáng)度分析

圖 6 TSPP和MTG處理后肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度的變化Fig. 6 Change in gel strength of myofibrillar protein treated with TSPP and then cross-linked with MTG

如圖6所示,所有蛋白凝膠樣品隨著H2O2溶液濃度的增加,凝膠強(qiáng)度均逐漸降低。這說(shuō)明,氧化造成的肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)變化,特別是大分子聚集物的生成,使凝膠空隙加大、結(jié)構(gòu)松散,進(jìn)而降低了肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度[32]。整體而言,+TSPP樣品的凝膠強(qiáng)度顯著高于 -TSPP樣品(P<0.05),可見TSPP處理會(huì)提高天然和氧化肌原纖維蛋白的凝膠性能。

MTG可催化蛋白間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),改善蛋白凝膠特性。添加MTG后,所有樣品的凝膠強(qiáng)度均顯著增加 (P<0.05),且+TSPP樣品的凝膠強(qiáng)度顯著高于 -TSPP樣品(P<0.05)。但是,由MTG交聯(lián)引起的凝膠強(qiáng)度增幅不同,計(jì)算-TSPP以及+TSPP兩種條件下,MTG交聯(lián)樣品相對(duì)于未交聯(lián)樣品的相對(duì)增加量 (表1),可以看出在-TSPP和+TSPP兩種條件下由MTG交聯(lián)引起的凝膠強(qiáng)度增幅均隨H2O2溶液濃度增加逐漸降低(P<0.05),雖然在+TSPP條件下,未氧化樣品的凝膠強(qiáng)度增幅高于-TSPP樣品,但隨著氧化程度增加反而降低速度更快,這與動(dòng)態(tài)流變學(xué)結(jié)果(圖5)相符。由此可推斷,在-TSPP和+TSPP兩種條件下,蛋白氧化抑制MTG交聯(lián)所引起的凝膠性能的提高,且在TSPP條件下抑制作用更劇烈。造成這種現(xiàn)象的原因可能有二:其一,雖然+TSPP條件下,MTG交聯(lián)程度更高,但是蛋白交聯(lián)過(guò)度,反而不利于凝膠形成。Li Chunqiang等[33]也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象,在高鹽條件下,MTG交聯(lián)程度高的樣品形成的凝膠強(qiáng)度并不是最高的。其二,可能是TSPP、氧化和MTG交聯(lián)均改變了肌原纖維蛋白的空間結(jié)構(gòu),且形成高分子質(zhì)量聚集物,三者的疊加效應(yīng)可能導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成模式發(fā)生變化。

2.3.3 持水性分析

圖 7 TSPP和MTG處理后肌原纖維蛋白持水性的變化Fig. 7 Change in water-holding capacity of myofibrillar protein treated with TSPP and then cross-linked with MTG

肌原纖維蛋白凝膠持水性主要表現(xiàn)為對(duì)存在于凝膠致密的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的不易流動(dòng)水和凝膠空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)外部自由水的保持能力。由圖7可知,氧化蛋白凝膠的持水性隨著H2O2溶液濃度增加而逐漸降低。有研究表明,氧化造成的肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)變化(大分子聚集、組織松散等)會(huì)導(dǎo)致蛋白凝膠的持水性下降[34]。 +TSPP蛋白凝膠的持水性顯著高于同條件下-TSPP樣品 (P<0.05),這與磷酸鹽可以提高肌肉持水性的報(bào)道相符[35],機(jī)制可能與磷酸鹽使蛋白的pH值偏離等電點(diǎn)、解離肌動(dòng)球蛋白等有關(guān)。然而,隨著H2O2溶液濃度增加, +TSPP樣品的持水性與-TSPP樣品之間的差異越來(lái)越小,可見氧化會(huì)減弱TSPP提高凝膠持水性的作用。

M T G 交聯(lián)后,所有凝膠持水性均顯著增加 (P<0.05)。由MTG交聯(lián)引起的持水性相對(duì)增加量 (表1),可見-TSPP樣品的持水性相對(duì)增加量隨著H2O2溶液濃度增加逐漸減?。≒<0.05),而+TSPP氧化樣品的持水性相對(duì)增加量明顯高于未氧化樣品 (P<0.05),這表明TSPP和氧化共同作用反而有利于提高M(jìn)TG交聯(lián)后蛋白凝膠的持水性。

3 結(jié) 論

TSPP對(duì)肌原纖維蛋白氧化具有一定的抑制作用,但對(duì)MTG交聯(lián)反應(yīng)起到積極作用,且與氧化程度相關(guān),這可能與TSPP改變肌球蛋白結(jié)構(gòu),進(jìn)而改變MTG交聯(lián)模式有關(guān)??偟膩?lái)說(shuō),無(wú)論添加TSPP與否,氧化會(huì)導(dǎo)致肌原纖維蛋白凝膠性能下降,而MTG交聯(lián)后均有所回升,其上升幅度與氧化程度和TSPP處理相關(guān):在+TSPP和 -TSPP條件下,由MTG交聯(lián)引起的凝膠性能增幅隨著氧化程度的增加均降低,但在+TSPP條件下降低速度更快。由此可知,相對(duì)于-TSPP樣品,在氧化脅迫條件下TSPP對(duì)MTG交聯(lián)引起的凝膠性能提高具有更強(qiáng)的抑制作用??傊琓SPP、氧化和MTG三者對(duì)肌原纖維蛋白凝膠性能的影響復(fù)雜,作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。磷酸鹽與MTG是肉制品中常見添加劑,探究二者的相互作用對(duì)肉制品加工及產(chǎn)品品質(zhì)提高具有重要理論意義。

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