鞠夢楠，祝 鋼，陳紅宇，蘭 天，董亞博，溫家煜，江連洲，隋曉楠

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

由兩種不相溶相制備的乳液在食品、藥品和化妝品行業(yè)中起著至關(guān)重要的作用[1]。由于經(jīng)水油部分潤濕的固體膠體顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液在熱力學(xué)上的不穩(wěn)定性，在制備Pickering乳液的過程中通常加入小分子的表面活性劑或者表面活性聚合物，譬如多糖和脂肪[2]。Shao Ping等[3]成功制備了由芋頭淀粉納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液，并研究了其包封茶多酚的潛在價值。Sarkar等[4]研究乳鐵蛋白和菊粉制備的納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液，發(fā)現(xiàn)其不容易被胃蛋白酶降解，同時可以延緩食物在胃內(nèi)的消化。Schroder等[5]研究了在交叉流動微流體裝置內(nèi)，膠體脂質(zhì)顆粒穩(wěn)定乳液的形成過程和聚結(jié)穩(wěn)定性。此外蛋白顆粒具有很強(qiáng)的界面穩(wěn)定性，環(huán)保且無毒，因此由蛋白質(zhì)顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液具有很大的實際意義。Burgos-Díaz等[6]采用羽扇豆蛋白質(zhì)分離物開發(fā)食品級Pickering乳液穩(wěn)定劑，研究了Pickering乳液的乳化指數(shù)、微觀結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)。Jiao Bo等[7]發(fā)現(xiàn)通過改變花生蛋白制備的高內(nèi)相Pickering乳液內(nèi)相比組成，可得到不同潛在應(yīng)用的Pickering乳液。然而，很少有人研究大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）與小分子多酚共價復(fù)合物作為穩(wěn)定劑制備Pickering乳液。

大豆蛋白是一種全價蛋白，主要由β-伴大豆球蛋白（7S）和大豆球蛋白（11S）組成，而SPI又以蛋白質(zhì)含量高達(dá)90%以上被廣泛應(yīng)用在食品行業(yè)中。大豆球蛋白主要通過氫鍵和二硫鍵穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，具有較低的分子靈活性[8]，并且SPI通過降低水-油界面張力促進(jìn)乳液的形成，同時在水-油界面處形成膜結(jié)構(gòu)，從而避免乳液聚集絮凝[9]。作為植物次級代謝產(chǎn)物的多酚類物質(zhì)是植物界中數(shù)量最多的物質(zhì)之一，而作為單體多酚的花青素（anthocyanin，ACN）可在食物體系中穩(wěn)定其分子結(jié)構(gòu)，極大的保留其功能活性[10]。根據(jù)美國水果和蔬菜的攝入量估算，人類飲食中ACN的攝入量約為12.5 mg/d[11]， 這表明ACN是人類飲食的重要組成部分。ACN作為小分子物質(zhì)，通過滲透到蛋白微原纖維中，與多肽鏈形成多種交聯(lián)點[12]。研究表明，蛋白與ACN共價交聯(lián)后，可形成較強(qiáng)的共價鍵并引起蛋白結(jié)構(gòu)的解折疊從而影響二者的特性[13]。盡管以往的研究對多酚類物質(zhì)與植物蛋白共價作用進(jìn)行了積極探索，但共價作用的確切機(jī)制及其對Pickering乳液特性及微觀結(jié)構(gòu)的影響尚不清楚。

因此，在本研究中，通過ACN與SPI共價復(fù)合制備納米顆粒，破壞SPI中的二硫鍵，使二者之間形成共價鍵，進(jìn)而改善其分子間柔性較低的狀態(tài)。通過流變性質(zhì)，冷凍電鏡與激光共聚焦顯微鏡分析，對比有無ACN對SPI穩(wěn)定Pickering乳液的影響，這將為健康、高營養(yǎng)的Pickering乳液設(shè)計提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆粉末 禹王有限公司；黑米、九三非轉(zhuǎn)基因大豆油（市售）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

C J J-6 磁力攪拌器 納麗雅（N a l i y a）有限公司；5424R冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司； P H S-2 5 數(shù)顯臺式酸度計 上海雷磁公司；R 2 5 0旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士B ü c h i 公司；H H 4 2 0 水浴鍋 光合有限公司；2500C高速研磨機(jī) 艾澤拉有限公司；Fluor光度計 日本Hitachi公司；乳化機(jī) 德國IKA 公司；7 2 2 N 紫外分光光度計 上海菁華公司；HAAKE Rheostress RS600旋轉(zhuǎn)黏度計 德國Thermo Electron公司；LSM 880共焦顯微鏡 德國Zeiss公司；CT1500 HR低溫系統(tǒng)、XL30場發(fā)射掃描電子顯微鏡 荷蘭Philips公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

根據(jù)Huang Liurong等[14]的方法稍加修改。將大豆粉末以1∶15的質(zhì)量比溶于去離子水中，用2 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)節(jié)至8.0，并將所得漿液在25 ℃機(jī)械攪拌2 h，在4 000h g離心15 min后收集上清液，并用 2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)至pH 4.5，然后4 000h g離心15 min。將獲得的沉淀物溶于去離子水中，用2 mol/L NaOH溶液中和至pH 7.0，在4 ℃用去離子水透析24 h后冷凍干燥以獲得SPI粉末。

1.3.2 ACN的提純與定量

將未拋光的黑米粒在40 ℃干燥，用高速研磨機(jī)研磨并通過80 目篩網(wǎng)。根據(jù)Prior等[15]描述的提取方法稍作修改，將干燥的黑米粉用乙醇-水-鹽酸（50∶50∶0.5，V/V）以固液比（1∶10）在30 ℃萃取2 h。合并所有提取物并通過布氏漏斗過濾，將收集的濾液在35 ℃真空蒸發(fā)以除去乙醇。將濃縮的提取物加載到AB-8樹脂柱上以除去雜質(zhì)。然后用體積分?jǐn)?shù)1%的鹽酸洗滌，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液（含有體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸）回收。35 ℃真空蒸發(fā)除去乙醇，得到富含ACN的黑米提取物。

使用矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線作為量化黑米提取物中ACN的參考曲線[16]。將ACN儲備液用10%甲酸溶液稀釋至1、2、5、10、20、50、125 μg/mL。用Waters HPLC系統(tǒng)分析標(biāo)準(zhǔn)溶液和適當(dāng)質(zhì)量濃度的提取物。將二極管陣列檢測器設(shè)定檢測波長為520 nm。ACN通過C18反相柱，流速為1 mL/min。流動相由體積分?jǐn)?shù)100%甲醇（A）和10%甲酸（B）組成，具有以下梯度洗脫：0～5 min，10% A；5～20 min，10%～60% A；20～30 min，60% A。進(jìn)樣體積為20 μL。將峰面積作為橫坐標(biāo)繪制為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的函數(shù)。用矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其質(zhì)量濃度為53.8 mg/mL。

1.3.3 SPI-ACN共價復(fù)合納米顆粒的制備

根據(jù)Zhu Xuefeng等[17]的方法稍作修改。稱取SPI溶于0.01 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）中，配制成質(zhì)量濃度60 mg/mL SPI溶液，磁力攪拌2 h，在4 ℃過夜儲存以使溶液完全水合。隨后將溶液pH值調(diào)節(jié)至9.0，將ACN按不同體積分?jǐn)?shù)（0.05%、0.10%、0.15%分別表示為NAC1、NAC2、NAC3）加入蛋白溶液中，并在25 ℃混合攪拌16 h，以得到二者共價復(fù)合物。未經(jīng)過共價復(fù)合的蛋白溶液作為對照組（NSPI）。并用0.5 mol/L NaOH或 0.5 mol/L HCl溶液將pH值精確調(diào)節(jié)至7.0。將所有樣品在95 ℃的水浴中加熱15 min，并立即在冰浴中冷卻至25 ℃。

1.3.4 顆粒表面疏水性（H0）測定

根據(jù)Liu Fu等[18]的方法稍加修改。使用熒光探針8-苯胺-1-萘磺酸鈉（8-anilino-1-naphthalenesulfonte， ANS-Na）測定蛋白質(zhì)的表面疏水性。用0.01 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）稀釋樣品，使最終質(zhì)量濃度為0.04～0.2 mg/mL；同時使用相同的磷酸緩沖溶液配制ANS－儲備液（8.0 mmol/L）。將20 μL ANS－溶液與4 mL各稀釋樣品振蕩混合均勻，使用Fluor光度計在激發(fā)波長370 nm、發(fā)射波長470 nm測量混合物的熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度曲線的初始斜率（通過線性回歸分析計算）用作表面疏水性數(shù)值。

1.3.5 乳液制備

根據(jù)Zhu Xuefeng等[17]的方法進(jìn)行修改。將大豆油加入各個蛋白溶液中，直至油相體積比為1∶5，使用IKA乳化機(jī)10 000 r/min均化2 min，獲得新鮮乳液（分別用ESPI、EAC1、EAC2、EAC3表示）。

1.3.6 乳化活性性及乳化穩(wěn)定性的測定

根據(jù)Sui Xiaonan等[19]的方法稍加修改。用0.1%十二烷基硫酸鈉將乳液樣品稀釋至0.05 mg/mL，使用紫外分光光度計在500 nm波長處測定初始狀態(tài)的吸光度（A0）和放置30 min后的吸光度（A30）。乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsion stability index，ESI）根據(jù)下式計算：

式中：N為樣品稀釋倍數(shù)；C為SPI質(zhì)量濃度/（g/mL）； Φ為油相比；A0為初始狀態(tài)吸光度；A30為靜置30 min后的吸光度。

1.3.7 乳液流變測量

根據(jù)Dokic等[20]的方法稍加修改，使用旋轉(zhuǎn)黏度計來測量乳液的流變行為。該實驗使用錐板C60/1Ti傳感器（錐板間隙為0.052 mm），測量在（25f 0.1）℃進(jìn)行。該方法主要為磁滯回線測試，在前180 s內(nèi)，剪切速率由0 s－1增加至500 s－1，隨后使剪切速率在500 s－1維持120 s，最后使剪切速率在180 s內(nèi)減少至0 s－1。為了確定黏彈性區(qū)域，振蕩應(yīng)變掃描實驗測量的振蕩應(yīng)變范圍為0.01%～100%，頻率為1 Hz。振幅測試條件如下：頻率0.1～10 Hz，應(yīng)變0.2%。由應(yīng)變響應(yīng)計算彈性模量（G’）和黏性模量（G”）。通過Power-Law模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合：

式中：τ 為表觀黏度/（P a g s）；K 為稠度指 數(shù)/（Pag sn）；γ為剪切速率/s－1；n為流動行為指數(shù)。

在黏彈性數(shù)據(jù)比較穩(wěn)定的頻率（0.5 Hz）下計算黏彈性比值tanδ評估SPI-ACN共價復(fù)合Pickering乳液的損失正切值。

1.3.8 乳液微觀觀察

采用激光共聚焦掃描顯微鏡和冷凍電鏡研究樣品的微觀結(jié)構(gòu)。根據(jù)Liu Fu等[21]的方法稍加修改，對樣品進(jìn)行激光共聚焦微觀結(jié)構(gòu)觀察，染色方法為：40 μL尼羅藍(lán)和尼羅紅混合熒光染料與1 mL樣品避光混合染色30 min，將樣品放置在載玻片上并蓋上蓋玻片。使用共焦顯微鏡對乳液進(jìn)行觀察。

參考Whitby等[22]的方法稍加修改，使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡拍攝乳液微觀結(jié)構(gòu)的冷凍掃描電子顯微鏡圖。將乳液滴在位于支架上的低溫掃描電子顯微鏡短管中并在氮氣中冷凍。隨后，將短管轉(zhuǎn)移到超真空低溫室中，在－95 ℃將乳液破碎蝕刻60 s。在鉑中對破碎的表面進(jìn)行涂覆，然后轉(zhuǎn)移到掃描電子顯微鏡的冷凍階段（－170 ℃）并使用顯微鏡控制軟件拍攝圖像。

1.4 統(tǒng)計分析

每組實驗至少重復(fù)3 次，使用SPSS 15.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，P＜0.05，差異顯著。使用Origin 8.5進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 顆粒表面疏水性分析

圖 1 納米顆粒表面疏水性Fig. 1 Surface hydrophobicity of nanoparticles

H0是影響其表面相關(guān)功能的重要參數(shù)[18]。如圖1所示，以ACN體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)作為表面疏水性的函數(shù)并用ANS－作為熒光探針。隨著ACN添加量的增大，顆粒表面疏水性逐漸減小，當(dāng)ACN體積分?jǐn)?shù)由0%增加到0.15%時，納米顆粒的H0由18 174降低到8 945。Wei Zihao等[23]研究發(fā)現(xiàn)，牛奶蛋白與茶多酚共價復(fù)合后致使牛奶蛋白表面疏水性降低，與本研究結(jié)果一致。Karaca等[24]的研究表明在中性pH值下SPI的表面疏水性值為55.32。本研究的SPI納米顆粒的H0明顯高于其他研究，其原因可能為熱處理誘導(dǎo)SPI去折疊，導(dǎo)致更多疏水性基團(tuán)遷移到分子外部[25]。此外，隨著ACN含量的增加，納米顆粒的H0逐漸降低，這可能是由于ACN的添加導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面的負(fù)電荷基團(tuán)與ANS－的有機(jī)磺酸鹽基團(tuán)之間的靜電排斥增加，從而致使ANS－與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合減少[28]。

2.2 EAI及ESI分析

圖 2 EAI及ESI分析Fig. 2 EAI and ESI of Pickering emulsions

由圖2可知，Pickering乳液的EAI與ESI隨著ACN的添加逐漸增大，當(dāng)ACN含量增大0.15 倍時，乳液的EAI增大了將近2 倍；乳液的ESI增大了將近1 倍。Liu Fuguo等[27]得出了類似的結(jié)論，共價復(fù)合后的蛋白與多酚形成的乳液，隨著多酚量的添加，EAI和ESI逐漸增加。影響Pickering乳液共價復(fù)合體系的影響因素有很多，諸如蛋白質(zhì)分子質(zhì)量，蛋白與多酚共價復(fù)合后的結(jié)合率等[28]。由于Pickering乳液制備過程中需要加熱，由此可以推斷，蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)在加熱條件下發(fā)生改變，從而使油水界面處的分子重排，增加了蛋白的兩親性，進(jìn)而使得乳化性能增強(qiáng)[29]。Jiang Lianzhou等[30]研究表明，當(dāng)?shù)鞍着cACN復(fù)合后形成的乳液在油水界面處會形成兩層乳化膜。第1層被二者的復(fù)合物占據(jù)，第2層為蛋白質(zhì)暴露的疏水基團(tuán)通過疏水相互作用與ACN形成的乳化膜，由此增加了Pickering乳液的ESI。

2.3 乳液流變分析

2.3.1 乳液靜態(tài)流變分析

由圖3A可知，所有乳液在剪切速率為0.01～100 s－1時，隨著剪切速率的增大黏度逐漸下降，表現(xiàn)出典型非牛頓假塑性行為（剪切稀化）。Pickering乳液顯著的剪切稀化行為是典型的弱締合相互作用，Tzoumaki等[31]曾報道過相似的結(jié)論，疏水性植物糖原納米顆粒穩(wěn)定的乳液中形成弱的液滴網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。此外，在相同剪切速率下，ACN體積分?jǐn)?shù)越高，Pickering乳液的黏度越大。這些結(jié)果與用SPI-ACN共價復(fù)合納米顆粒穩(wěn)定Pickering乳液的剪切應(yīng)力-剪切速率一致（圖3B）。SPI-ACN納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液的剪切應(yīng)力-剪切速率是非線性的，符合非牛頓流體的剪切稀化行為。這種行為可以通過在剪切過程中破壞纏結(jié)的聚合物網(wǎng)絡(luò)來解釋，其中破壞的分子間纏結(jié)速率大于重整的分子間纏結(jié)速率，導(dǎo)致分子間流動阻力較小和表觀黏度較低[32]。圖3B中較高的相關(guān)系數(shù)值證實了SPI-ACN Pickering乳液參數(shù)的可靠性 （R2＞0.97）。此外，Pickering乳液中ACN含量的增加導(dǎo)致K值的增加，這與圖3A中表觀黏度數(shù)據(jù)相符。同時可知n值均小于1，這證實了乳液為非牛頓假塑性 流體[33]。Pickering乳液中ACN體積分?jǐn)?shù)的增加導(dǎo)致n值的降低，因此牛頓行為的偏差增加。Dokic等[20]得到相似的結(jié)論，由于辛烯基琥珀酸酐淀粉濃度以及分散相體積分?jǐn)?shù)的增加，導(dǎo)致了乳液的表觀黏度和假塑性特征增加。

圖 3 SPI-ACN共價復(fù)合納米顆粒穩(wěn)定Pickering靜態(tài)流變分析和 Power-Law模型數(shù)據(jù)擬合Fig. 3 Static rheological analysis of Pickering emulsions stabilized by SPI-ACN and data fitting by power law model

2.3.2 乳液動態(tài)流變分析

圖 4 SPI-ACN Pickering乳液動態(tài)流變分析Fig. 4 Dynamic frequency sweep curves of Pickering emulsions stabilized by SPI-ACN

由SPI與ACN共價復(fù)合穩(wěn)定的Pickering乳液的動態(tài)流變分析如圖4所示。隨著頻率的增大，Pickering乳液的彈性模量和黏性模量逐漸增大，并且彈性模量大于黏性模量；在同一頻率下，隨著ACN添加量的增大，彈性模量與黏性模量逐漸增大。由此證實SPI-ACN Pickering乳液為彈性凝膠乳液，并且彈性模量的變化與頻率變化無關(guān)[34]。Ye Fan等[1]的研究得到相似的結(jié)果，隨著疏水性植物糖原濃度的增大，其穩(wěn)定的Pickering乳液彈性模量和黏性模量逐漸增大并且彈性模量大于其黏性模量。這是由于穩(wěn)定劑濃度在Pickering乳液液滴網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生的作用[35]。由圖4c可知，在同一剪切頻率下，隨著ACN添加量的增大tanδ逐漸增大并且始終小于1，這說明該Pickering乳液的彈性模量始終小于黏性模量，乳液呈現(xiàn)類固體特性。隨著ACN體積分?jǐn)?shù)的增大，tanδ值明顯增大，這說明黏性模量上升幅度大于彈性模量，在此濃度范圍內(nèi)Pickering乳液的黏性比例逐漸增大，這也與圖4a、b結(jié)果相一致。

2.4 乳液冷凍電鏡分析

冷凍電鏡分析有助于更清晰直觀地了解乳液的微觀結(jié)構(gòu)。由于乳液在氮氣淤漿中以相對緩慢的速率冷凍，因此當(dāng)液體凍結(jié)時油結(jié)晶，暴露在冷凍乳液樣品中的油滴由大晶體組成，如圖5所示。隨著ACN添加量的增加，蛋白顆粒大小逐漸均一密集；由蛋白顆粒自組裝而成的Pickering乳液液滴逐漸減小，油滴表面附著致密的蛋白顆粒。這一結(jié)果與Wang Pengjie等[36]的研究一致，由酪蛋白穩(wěn)定的Pickering乳液在油滴表面上形成致密顆粒層。由圖5可知，隨著ACN添加量的增大，乳液界面由光滑變?yōu)榫W(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，這可能是因為ACN與蛋白共價復(fù)合后促進(jìn)了蛋白發(fā)生有序聚集，同時瓦解復(fù)合物中蛋白結(jié)構(gòu)，使得蛋白肽鏈展開。

圖 5 Pickering乳液冷凍電鏡分析Fig. 5 Cryo-scanning electron microscopic analysis of Pickering emulsions

2.5 乳液激光共聚焦分析

圖 6 乳液激光共聚焦分析圖Fig. 6 Laser scanning confocal microscopic analysis of Pickering emulsions

使用激光共聚焦技術(shù)可以評估ACN體積分?jǐn)?shù)增加對蛋白和脂滴分布的影響，如圖6所示（油滴被尼羅紅染為紅色，蛋白被尼羅藍(lán)染為綠色），隨著ACN添加量的增大，蛋白分布逐漸呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)；脂滴逐漸減小，分布更加均一。該結(jié)果與2.4節(jié)冷凍電鏡結(jié)果一致，這說明隨著ACN的加入蛋白與脂滴在運動中受到限制，其分布形態(tài)與方式變得更加有序。這表明在高ACN體積分?jǐn)?shù)下增強(qiáng)的液滴間相互作用很大程度上促進(jìn)了網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)的形成[37]。同時，由明場圖片可以看出SPI-ACN納米顆粒完全吸附穩(wěn)定油滴界面，針對于出現(xiàn)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可能是形成了橋接乳液。由于ACN與SPI共價復(fù)合后使蛋白的肽鏈展開，致使乳液中兩個單獨的脂滴共用一層SPI-ACN顆粒層。橋接乳液的出現(xiàn)將顯著促進(jìn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，同時促進(jìn)聚集顆粒凝膠的形成（構(gòu)建蛋白質(zhì)穩(wěn)定乳液的一種理想模型）[38]。Destribats等[39]研究發(fā)現(xiàn)水包油型Pickering乳液穩(wěn)定的軟微凝膠也觀察到相鄰液滴間的橋接模式。

3 結(jié) 論

隨著ACN體積分?jǐn)?shù)的增大，SPI-ACN共價復(fù)合納米顆粒的表面疏水性逐漸下降，由其穩(wěn)定的Pickering乳液的EAI、ESI逐漸增加。SPI-ACN共價復(fù)合Pickering乳液表現(xiàn)出典型非牛頓假塑性流體行為并且該乳液為類固體乳液。由冷凍電鏡與激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果可知，隨著ACN體積分?jǐn)?shù)的增大，納米顆粒表現(xiàn)出致密有序的排列；乳液粒度在可視范圍內(nèi)減??；脂滴分布更為均一； SPI-ACN共價復(fù)合Pickering乳液呈現(xiàn)出橋接乳液形態(tài)。