劉 鶴，賀丹彤，邢春來(lái)，何 蕊，劉 睿，成光宇，位 鴻*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117；2 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥研究中心，長(zhǎng)春 130021；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新實(shí)踐中心，長(zhǎng)春 130117）

甘姜苓術(shù)湯出自《金匱要略·五臟風(fēng)寒積聚病脈證并治第十一》[1]，并被國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》收錄，全方由甘草、干姜、茯苓、白術(shù)組成，在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、盆腔炎、腎積水等方面具有良好效果[2-5]。甘草苷是甘姜苓術(shù)湯中有效且穩(wěn)定存在的成分，本實(shí)驗(yàn)建立了甘姜苓術(shù)湯中有效成分甘草苷的含量測(cè)定方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證[6-9]，為甘姜苓術(shù)湯的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 美國(guó)Waters 公司2695 液相色譜儀，PDA 檢測(cè)器；KH-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；CP225D 型電子天平（德國(guó)sartorius 公司）；Labconco Free Zone 冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Labconco 公司）。

1.1.2 藥品與試劑 甘草苷對(duì)照品（批號(hào)：111610-201607，供含量測(cè)定用，規(guī)格：20 mg，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院）；乙腈、乙醇為色譜純，水為超純水；其它試劑均為分析純。

1.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 島津WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相乙腈（C）-0.05%磷酸水溶液，流動(dòng)相比例0～8 min：19%C；8～45 min：19%～68%C；45～47 min：68%～90% C；47～55 min：90%C；55～60 min：90%～19%C；60～65 min：19% C；檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm；流速1.0 mL/min。進(jìn)樣量10 μL；甘草苷的理論塔板數(shù)不低于5 000；柱溫為室溫。

1.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甘草苷對(duì)照品，加70%乙醇制成每1 mL 含0.02 mg 溶液，搖勻，即得。

1.4 供試品溶液的制備 按處方量取甘草28.0 g，白術(shù)28.0 g，茯苓56.0 g，干姜56.0 g（共計(jì)168.0 g），加1 000 mL 水，浸泡30 min，明火煎煮至沸騰轉(zhuǎn)為文火，煎至得煎液600 mL，冷凍干燥，得提取物粉末備用。

取提取物粉末（過(guò)四號(hào)篩）約0.1 g，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加70%乙醇8 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過(guò)，即得。

2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1 專屬性考察 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（色譜柱型號(hào)：Inertsil ODS-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-0.05%磷酸水為流動(dòng)相，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm[10]。

分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液、溶劑各10 mL，注入液相色譜儀，甘草苷分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于5 000，色譜圖見(jiàn)圖1、2、3、4。

2.2 線性關(guān)系考察 精密吸取甘草苷對(duì)照品溶液2.0、4.0、8.0、10.0、15.0、20.0 mL，注入液相色譜儀，測(cè)定，以進(jìn)樣量（mg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]?；貧w方程：Y=1 307.6X-2 861.5，r=0.999 7（甘草苷），甘草苷線性范圍為40.02～400.20 mg，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、圖5。

圖1 溶劑專屬性考察

圖2 甘草陰性專屬性考察

圖3 甘草苷對(duì)照品專屬性考察

圖4 供試品專屬性考察

表1 線性關(guān)系考察

圖5 甘草苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 穩(wěn)定性考察 精密吸取對(duì)照品溶液和同一批供試品溶液各10 mL，分別在0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h 進(jìn)樣，依法測(cè)定[12]，以甘草苷峰面積積分值為指標(biāo)，計(jì)算甘草苷RSD為0.43%，表明樣品中穩(wěn)定性良好，24 h 內(nèi)測(cè)定結(jié)果可靠，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 精密度考察 精密吸取甘草苷對(duì)照品溶液10 mL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 次，依2.3 項(xiàng)下測(cè)定[13]，記錄峰面積積分值，計(jì)算得甘草苷對(duì)照品溶液連續(xù)測(cè)定的RSD 為0.74%，表明儀器、方法的精密度良好，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 甘草苷穩(wěn)定性試驗(yàn)

表3 甘草苷精密度試驗(yàn)

2.5 重現(xiàn)性考察 精密稱取同一批樣品共6 份，按2.2供試品溶液項(xiàng)下制備，依法獨(dú)立測(cè)定[14]，以甘草苷為含量測(cè)定指標(biāo)，計(jì)算樣品含量，結(jié)果RSD 為1.08%，平均含量為21.479 6 mg/g，表明該方法重現(xiàn)性良好，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)同批樣品，取約0.05 g，共6 份，精密稱定，置10 mL 量瓶中，分別精密加入甘草苷對(duì)照品1.001 mg，加入70%乙醇，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液，依法測(cè)定[15]，計(jì)算平均回收率為99.74%，RSD 為1.60%，表明本法準(zhǔn)確性較好，方法可行，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地不同批次藥材飲片制備15批甘姜苓術(shù)湯提取物粉末，依法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 mL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算15 批甘姜苓術(shù)湯提取物粉末中甘草苷含量[16]，結(jié)果見(jiàn)表6。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)考察對(duì)比了不同的流動(dòng)相系統(tǒng)[17]，包括乙腈—水、乙腈-0.05% 磷酸水溶液；結(jié)果表明，以乙腈-0.05% 磷酸水溶液體系為流動(dòng)相，采用梯度洗脫，能夠達(dá)到較好的洗脫效果，各色譜峰的峰形和分離度相對(duì)較好，故選用乙腈-0.05% 磷酸水溶液作為流動(dòng)相系統(tǒng)。

表6 測(cè)定結(jié)果

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 精密吸取甘草苷對(duì)照品溶液10 mL，進(jìn)樣分析，利用 PDA 檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描[18]，測(cè)得最大吸收為237 nm，與2015版《中國(guó)藥典》“甘草”項(xiàng)下收載的檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm 相符，因此選擇237 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)[19-20]。

3.3 結(jié)論 該方法建立了應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定甘姜苓術(shù)湯中甘草苷含量的方法，該方法專屬性好，精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率均符合方法學(xué)驗(yàn)證要求，可以作為甘姜苓術(shù)湯質(zhì)量控制方法。