崔勤濤 王俊華 劉曉晨 王學(xué)惠 蘇國寶 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管外科，新鄉(xiāng) 453000)

冠心病是由動脈粥樣硬化引起的血管狹窄/阻塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧型心臟病，其發(fā)病的主要原因為心肌缺血[1,2]，冠狀動脈經(jīng)皮介入是目前治療冠心病手段之一，但同時也伴隨著心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI)。MI/RI病理學(xué)表現(xiàn)為心肌組織排列紊亂、胞外基質(zhì)沉積增加、心肌組織損傷，從而引起心率失常，嚴(yán)重時可誘發(fā)猝死[3]。羽扇豆醇是三萜烯，存在于食用植物以及中草藥中，動物研究證實羽扇豆醇具有抗炎癥、抗氧化以及促進傷口愈合的作用，并且對前列腺癌、乳腺癌以及黑色素瘤等有抑制作用。有研究顯示羽扇豆醇可以改善腦缺血再灌注大鼠的氧化應(yīng)激損傷并減輕炎癥反應(yīng)[4]，但羽扇豆醇在心肌缺血再灌注方面的氧化應(yīng)激研究報道較少，因此，本研究通過制備大鼠MI/RI模型來探討羽扇豆醇對心肌缺血再灌注大鼠心臟功能、心肌損傷以及氧化應(yīng)激作用的影響，為臨床治療心肌缺血再灌注患者方案選擇提供動物實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 Caspase-3免疫組化劑盒(貨號：IH-0081R，上海雅吉生物科技有限公司)、羽扇豆醇(CAS號：545-47-1；上海源葉生物科技有限公司)、TRIzol RNA提取試劑盒(貨號：BTN71201-WJU，北京百奧萊博科技有限公司)、地爾硫卓(CAS號：42399-41-7；上海晶都生物技術(shù)有限公司)、CK-Mb(貨號：QY-BM11392，上海喬羽生物科技有限公司)、Mb(貨號：0-027530，上海江萊生物科技有限公司)、cTnI(貨號：BS-E12272R1，廣州徠智生物科技有限公司)、TNF-α(貨號：QY-BM10200，上海喬羽生物科技有限公司)、IL-1β(貨號：YAD23684S，北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司)、iNOS[貨號：JK-(a)-1607，上海晶抗生物工程有限公司]、IL-6[貨號：JK-(a)-0023，上海晶抗生物工程有限公司]、MDA(貨號：0-100860，上海將來實業(yè)股份有限公司)，SOD[貨號：JK-(a)-1752，上海晶抗生物工程有限公司]，LDH(貨號：YM-QP11477，上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)、Nrf1、PGC-1α、TFAM抗體購于武漢博歐特生物科技有限公司。

1.1.2儀器 冷凍離心機(CTK48，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)、熒光顯微鏡(Ti2-U，NIKON)、小動物呼吸機(R407，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)、切片機(HM 340E，賽默飛)、超低溫冰箱(Forma 700，賽默飛)、多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax Paradigm，美谷分子儀器上海有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物飼養(yǎng)及分組 4～5周齡的SPF級SD雄性健康大鼠90只，體質(zhì)量(190±20)g，購于成都達碩實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK(川)2015-030，購回飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25℃，濕度40%～50%，人工光照(12 h/晝、12 h/夜)，全天自由飲水。將90只SD大鼠隨機均分為6組，分別為健康對照組(Ctrl)、模型組(I/R)、陽性對照組(Diltia)、10 mg/kg Lupeol組、20 mg/kg Lupeol組、50 mg/kg Lupeol組，Diltia組與Lupeol組SD大鼠分別灌胃5 mg/kg地爾硫卓、10 mg/kg羽扇豆醇、20 mg/kg羽扇豆醇、50 mg/kg羽扇豆醇，1次/d，連續(xù)灌胃1周，健康對照組與I/R模型大鼠灌胃等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃1周。

1.2.2模型構(gòu)建 MI/RI大鼠模型制備：采取結(jié)扎左冠狀動脈前降支方法制備大鼠MI/RI模型，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，取仰臥位固定頭部、四肢于手術(shù)臺，連接心電電極并監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖、小動物呼吸機(呼吸頻率70次/min，潮氣量9 ml/kg，呼吸比1∶2)，左側(cè)第3～4肋間處剪開大鼠皮膚，分離肌肉組織、打開胸腔、分離心包膜、輕擠壓胸廓、暴露心臟，從左心耳、肺動脈圓錐間找出冠狀動脈左前降支。5/0號帶彎鉤尼龍縫線結(jié)扎分支起點外，在結(jié)扎時尼龍縫線與心肌間放置一根約1 cm細(xì)長棉線，此時缺血心肌表現(xiàn)出發(fā)紺、膨出跡象，心電圖有2個以上ST段抬高，T波高聳，或者QRS波增高增寬與T融合，表明心肌缺血形成，結(jié)扎30 min后松開結(jié)扎線，心電圖ST段恢復(fù)或與缺血前水平相似，表明大鼠缺血再灌注模型建立成功。其中結(jié)扎前心電圖異常，未觀察至終點就死亡以及造模不成功的大鼠剔除。Ctrl組大鼠不做任何處理。

1.2.3觀察指標(biāo) 再灌注120 min時，采用超聲心動圖檢查各組大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(FS)、左心室壁厚度(LVWT)、心率(HR)、左心室收縮壓(LVSP)水平，各組大鼠心臟功能指標(biāo)記錄結(jié)束后，抽取各組大鼠股動脈血5 ml，3 000 r/min 離心15 min，取上層血清并儲存于-80℃，用于肌酸激酶同工酶(CK-Mb)、Mb、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的含量、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、一氧化氮合酶(iNOS)以IL-6、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)含量檢測。再灌注120 min后，麻醉處死大鼠，取出心臟組織，一部分固定于10%甲醛中性溶液中，用于HE染色以及免疫組化實驗，一部分心臟組織儲存于-80℃，用于RT-PCR以及Western blot檢測。

1.2.4HE切片染色及免疫組化 取置于10%甲醛中性溶液中的心臟組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，5 μm切片，一部分用于HE染色，切片后進行脫蠟、復(fù)水、HE染色、再次脫水及透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。另一部分用于免疫組化，切片脫蠟與復(fù)水，PBS浸泡5 min，微波抗原修復(fù)，3%H2O2孵育15 min以消除過氧物酶活性，按照試劑盒說明書操作進行，加入DAB顯色，封片圖像采集。

1.2.5Western blot 提取心臟組織蛋白，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度保持一致，經(jīng)過SDS-PAGE電泳，將膜轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入Nrf1、PGC-1α、TFAM、β-actin一抗，于4℃條件下孵育過夜，再用TBST漂洗40 min，分為3次漂洗，再加入經(jīng)HRP標(biāo)記的二抗繼續(xù)孵育1 h，根據(jù)ECL試劑盒說明書對蛋白條帶進行顯影、定影，觀察各組蛋白條帶成像情況，并進行蛋白條帶分析。

1.2.6RT-PCR 采用TRIzol試劑盒提取組織total RNA，依據(jù)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄第一條鏈cDNA，用SYBR PCR Master Mix用于RT-PCR，PCR程序設(shè)置參考試劑盒說明書，文章用所用引物設(shè)計及合成均由Sangon Biotech公司完成。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠心臟功能及超聲心動圖檢查結(jié)果比較 與I/R組相比，Ctrl組、Diltia組、20 mg/kg Lupeol組以及50 mg/kg Lupeol組的HR、LVSP、LVEF、FS以及LVWT均增加(P<0.05)，而10 mg/kg Lupeol組大鼠的HR、LVSP、LVEF、FS以及LVWT與Ctrl組的差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2各組大鼠CK-Mb、Mb、cTnI含量比較 與I/R組相比，Ctrl組、Diltia組、20 mg/kg Lupeol組以及50 mg/kg Lupeol組的CK-Mb、Mb、cTnI含量均降低(P<0.05)，而10 mg/kg Lupeol組大鼠的CK-Mb、Mb、cTnI含量與Ctr組的差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3羽扇豆醇對MI/RI大鼠心肌組織損傷的保護作用 采用HE染色觀察各組大鼠心肌組織損傷情況，結(jié)果顯示Ctrl組大鼠心肌組織細(xì)胞排列規(guī)則緊密、心肌纖維無變形現(xiàn)象且分布均勻；I/R組大鼠心肌組織細(xì)胞心肌纖維排列紊亂，胞質(zhì)間水腫現(xiàn)象明顯；Lupeol組大鼠心肌組織細(xì)胞損傷程度逐漸減輕，其中 Lupeol 50 mg/kg時的細(xì)胞損傷程度最??；Diltia組大鼠心肌細(xì)胞的損傷程度明顯低于I/R模型組，見圖1。采用RT-PCR檢測各組大鼠心肌組織中Ki67、Survivin表達量，結(jié)果顯示，與I/R組相比，Ctrl組、Diltia、20 mg/kg Lupeol組以及50 mg/kg Lupeol組心肌組織中的Ki67、Survivin mRNA含量增加(P<0.05)，而10 mg/kg Lupeol組大鼠心肌組織中的Ki67、Survivin mRNA含量與Ctrl組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。采用免疫組化檢測各組大鼠心肌組織中Caspase-3水平，結(jié)果顯示，Diltia組、20 mg/kg Lupeol組以及50 mg/kg Lupeol組心肌組織中的Caspase-3陽性率明顯低于I/R組(P<0.05)，而10 mg/kg Lupeol組Caspase-3陽性率與I/R組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2、表3。

GroupsDosage(mg/kg)HR(beat/min)LVSP(mmHg)LVEF(%)FS(%)LVWT(mm)Ctrl-414.87±35.161)135.37±21.291) 58.05±11.281)28.12±6.930.85±0.061)I/R -207.21±26.5257.02±12.1723.37±8.458.05±1.890.52±0.04Lupeol 10213.12±28.6162.13±14.5425.92±7.369.49±2.010.54±0.0520298.19±38.541) 93.36±10.421) 39.16±6.421)15.05±3.731)0.73±0.071)50349.21±35.491)127.07±9.271) 49.93±8.391)24.46±5.921)0.90±0.051)Diltia5275.64±22.931) 99.58±12.141) 42.03±7.481)20.01±4.141)0.74±0.06

Note：1)P<0.05 compared with the I/R group.

GroupsDosage(mg/kg)CK-Mb(U/L)Mb(ng/ml)cTnI(ng/ml)Ctrl- 21.27±7.381)27.08±8.391)0.12±0.021)I/R -114.25±11.23148.16±14.450.65±0.03Lupeol 10108.74±12.77137.38±18.540.63±0.0620 75.12±10.531) 89.23±11.421)0.29±0.041)5028.52±9.071) 45.26±5.381)0.16±0.031)Diltia537.76±5.981) 58.01±8.071)0.26±0.051)

Note：1)P<0.05 compared with the I/R group.

2.4各組大鼠TNF-α、 IL-1β、 iNOS以及IL-6含量比較 與I/R組相比，Ctrl組、Diltia組、20 mg/kg Lupeol組以及50 mg/kg Lupeol組的TNF-α、IL-1β、iNOS以及IL-6含量均降低(P<0.05)，而10 mg/kg Lupeol組大鼠的TNF-α、IL-1β、iNOS以及IL-6含量與Ctrl組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

2.5各組大鼠MDA、SOD、LDH含量比較 與I/R組相比，Ctrl組、Diltia組、20 mg/kg Lupeol組以及50 mg/kg Lupeol組的MDA含量均降低(P<0.05)，SOD、LDH活性增加(P<0.05)，而10 mg/kg Lupeol組大鼠的MDA含量、SOD、LDH活性與Ctrl組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

2.6各組大鼠Nrf1、PGC-1α、TFAM水平比較 與I/R組相比，Ctrl組、Diltia組、20 mg/kg Lupeol組以及50 mg/kg Lupeol組的Nrf1、PGC-1α、TFAM水平增加(P<0.05)，而10 mg/kg Lupeol組大鼠的Nrf1、PGC-1α、TFAM水平與Ctrl組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表6、圖3。

GroupsDosage(mg/kg)Ki67 mRNA(2-ΔΔCt)Survivin mRNA(2-ΔΔCt)Caspase-3 positive rate(%)Ctrl-11)11)-I/R -0.17±0.030.04±0.0163.54±5.48Lupeol 100.19±0.040.07±0.0259.74±4.47200.45±0.051)0.29±0.031)42.65±3.881)500.84±0.071)0.68±0.041)23.41±2.651)Diltia50.75±0.061)0.54±0.031)13.58±1.251)

Note：1)P<0.05 compared with the I/R group.

GroupsDosage(mg/kg)TNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)iNOS(pg/ml)IL-6(pg/ml)Ctrl- 45.16±7.341) 37.42±0.091)54.64±8.821)14.17±4.171)I/R -144.64±16.54176.79±21.25231.42±29.4889.73±13.68Lupeol 10139.48±19.62169.66±25.34226.43±25.6685.69±11.3120 96.35±12.141) 107.01±18.121) 145.62±15.281)57.36±9.051)50 53.48±9.441) 63.55±9.171) 79.38±8.441)26.21±6.531)Diltia5 62.53±10.261) 58.68±11.141) 98.06±13.541)38.32±7.281)

Note：1)P<0.05 compared with the I/R group.

GroupsDosage(mg/kg)MDA(mmol/ml)SOD(U/ml)LDH(U/L)Ctrl-2.15±0.311)11.03±1.611)896.39±125.041)I/R -5.72±0.543.58±0.572 371.01±284.12Lupeol 105.68±0.463.54±0.762 291.42±219.48203.52±0.351)7.14±0.441)1 732.39±165.281)502.44±0.521)10.05±0.821)1 023.48±127.131)Diltia52.83±0.431)6.04±0.611)1 648.03±150.941)

Note：1)P<0.05 compared with the I/R group.

GroupsDosage(mg/kg)Nrf1/β-actin(%)PGC-1α/β-actin(%)TFAM/β-actin(%)Ctrl-0.22±0.031)0.57±0.071)0.29±0.041)I/R -0.02±0.010.01±0.010.04±0.02Lupeol 100.04±0.010.02±0.010.05±0.03200.08±0.031)0.14±0.031)0.12±0.041)500.18±0.041)0.64±0.071)0.30±0.021)Diltia50.26±0.021)0.44±0.061)0.32±0.051)

Note：1)P<0.05 compared with the I/R group.

圖3 各組大鼠心肌組織Nrf1、PGC-1α、TFAM凝膠成像結(jié)果(×200)

3 討論

再灌注是治療冠心病急性心肌梗死的重要方式之一，可以快速打開患者堵塞血管并恢復(fù)患者冠狀脈血供。雖然再灌注治療在冠心病救治方面取得一定效果，但其也只限于局部治療，不能有效阻止冠心病的病理進程，治療后也會出現(xiàn)MI/RI心肌損傷，導(dǎo)致冠心病患者的治療效果欠佳[5]。MI/RI為冠心病病理環(huán)節(jié)之一，臨床表現(xiàn)為氣短、胸痛、乏力、心率失常等癥狀，MI/RI使機體氧自由基增多、鈣離子超載、炎癥反應(yīng)、線粒體功能及能量代謝出現(xiàn)障礙，最終使心肌組織細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷，增加患者心力衰竭、心源性猝死風(fēng)險[6]。

MI/RI促進心肌細(xì)胞凋亡，增加心臟梗死面積，加重心肌功能損傷[7]。羽扇豆醇廣泛存在于食用植物與中草藥中，并且對多種癌癥表現(xiàn)出抗癌作用，濃度羽扇豆醇可以致癌物質(zhì)對大鼠肝臟損傷[8,9]。本研究結(jié)果顯示I/R模型組大鼠HR、LVSP、LVEF、FS及LVWT降低，心臟組織的受損程度嚴(yán)重，羽扇豆醇預(yù)處理后再進行MI/RI可以明顯改善大鼠再灌注后的心臟功能，減低血清CK-Mb、Mb、cTnI、LDH含量以及心肌組織的Caspase-3陽性率，并增加心肌組織中Ki67、Survivin mRNA含量。CK-Mb、Mb、cTnI及LDH是檢測心肌損傷的重要指標(biāo)[10]，Ki67為調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖有關(guān)基因并參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)[11]，Survivin為凋亡抑制基因[12]，Caspase-3是機體內(nèi)所有凋亡途徑最終行使凋亡功能的蛋白[13]。程斌等[14]研究發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rb1可以促進Survivin表達，抑制大鼠脊髓缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡，從而保護神經(jīng)功能。三七總皂苷可以增加全腦缺血大鼠側(cè)腦室室管膜區(qū)的Ki67表達水平，加速神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖[15]。劉春曉等[16]研究顯示枳實薤白桂枝湯可以抑制MI/RI大鼠血清中cTnI、LDH含量，并抑制心肌組織中Caspase-3表達。本研究結(jié)果與既往研究相似，表明羽扇豆醇對MI/RI大鼠的心臟具有保護作用，可能是通過上調(diào)Ki67、Survivin表達，降低心臟組織細(xì)胞中Caspase-3水平，促進心肌細(xì)胞增殖、抑制心肌細(xì)胞凋亡，來實現(xiàn)對大鼠的心臟保護作用。

正常生理狀態(tài)下，心肌細(xì)胞中存在少量的氧自由基，但會被自由基清除系統(tǒng)清除，不會對心肌細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷。當(dāng)發(fā)生缺血缺氧時，機體清除自由基的能力降低，生成自由基的能力增強，當(dāng)機體恢復(fù)血氧供給后，自由基含量增加，增強機體氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示心肌缺血再灌注大鼠的血清SOD活性降低，MDA、TNF-α、IL-1β、iNOS以及IL-6水平增加，而羽扇豆醇可以降低心肌缺血再灌注大鼠血清中MDA、TNF-α、IL-1β、iNOS以及IL-6含量并增加SOD活性。SOD在自由基清除過程具有重要作用，當(dāng)機體內(nèi)SOD減少時，細(xì)胞膜中的不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)容易受到自由基破壞，使脂質(zhì)發(fā)生降解產(chǎn)生MDA，同時也會改變細(xì)胞的通透性，導(dǎo)致線粒體功能出現(xiàn)障礙，所以MDA與SOD能夠反映機體氧化應(yīng)激狀態(tài)[17,18]。與此同時，心肌缺血再灌注損傷也與炎癥因子有著密切關(guān)系，當(dāng)發(fā)生MI/RI時，巨噬細(xì)胞中的iNOS表達上調(diào)，使iNOS含量增加，促進再灌注損傷；TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子含量增加可以通過反饋作用促進氧自由基含量增多，加重缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇可以增加MI/RI大鼠心肌組織中的Nrf1、PGC-1α、TFAM水平。Nrf1能夠調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈相關(guān)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，是NRFs的亞型之一，PGC-1α可以與NRFs結(jié)合作用于線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)的啟動子區(qū)，促進線粒體DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，促進線粒體的增殖。TFAM水平對維持機體線粒體呼吸鏈的電子傳遞具有重要作用，是細(xì)胞能量代謝的重要保證。劉路等[19]研究顯示電針“足三里”穴可以促進大鼠心肌組織Nrf1、PGC-1α、TFAM水平，提高能量代謝。本研究與其相似，表明羽扇豆醇可以降低MI/RI大鼠的心肌組織的氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)，提高心肌細(xì)胞能量代謝，從而實現(xiàn)對心臟功能的保護作用。

綜上所述，羽扇豆醇一方面可以通過降低MI/RI大鼠心肌細(xì)胞Caspase-3陽性率，上調(diào)心肌組織Ki67、Survivin表達，來促進心肌細(xì)胞增殖、降低細(xì)胞凋亡；羽扇豆醇一方面還可以降低MI/RI大鼠血清促炎性因子水平，提高機體清除自由基能力，降低機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護線粒體呼吸鏈，提高心肌細(xì)胞的能量代謝，從而實現(xiàn)對MI/RI大鼠心臟功能及心肌損傷的保護作用。本研究結(jié)論僅僅是在大鼠實驗所得，在臨床上是否也存在相似功能，還需要進一步研究。