范騰陽 高冬梅 喻榮華 柯 迪 肖 雪

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科,遵義 563000)

膿毒癥(Sepsis)是臨床常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，是一種由微生物感染引起的全身性炎癥反應(yīng)(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)，包括呼吸急促、心跳過速、發(fā)熱、白細(xì)胞數(shù)量異常等一系列癥狀，可導(dǎo)致膿毒性休克、多臟器功能障礙綜合征[1]。膿毒性休克時(shí)，半數(shù)的患者伴隨著膿毒性的心肌炎癥[2]。炎癥細(xì)胞因子在其中起著重要作用，其中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)會抑制心肌的收縮功能，導(dǎo)致心臟功能紊亂[3]。

研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在許多疾病中扮演著重要角色，其中同源盒基因轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)是由HOXC基因座轉(zhuǎn)錄得到的lncRNA，最早報(bào)道了該lncRNA的作用是調(diào)控HOXD基因的表達(dá)[4]，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR還參與到如癌癥、心臟類疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等不同的人類疾病中。HOTAIR可以通過激活NF-κB信號通路促進(jìn) TNF-α合成，在脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)誘導(dǎo)的膿毒癥引發(fā)心肌炎癥中具有重要的作用[5]。研究表明，HOTAIR能夠沉默體內(nèi)多種microRNA(miRNA)[6]，其中包括miR-138。而miRNA可以與目標(biāo)mRNA 3′UTR區(qū)域結(jié)合引起轉(zhuǎn)錄本沉默[7]，HOTAIR通過這種方式保護(hù)miR-138調(diào)控的蛋白表達(dá)。已有報(bào)道HOTAIR在腎細(xì)胞癌和LPS誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中與miR-138相互作用的調(diào)控機(jī)制[6,8]，并且已有報(bào)道HOTAIR、miR-138對心臟相關(guān)疾病的不同調(diào)控作用[5,9]，HOTAIR與miR-138是否在膿毒癥誘導(dǎo)的心肌炎癥中存在相互作用及作用機(jī)制還未見報(bào)道，本研究通過構(gòu)建大鼠膿毒癥模型及培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細(xì)胞，從體內(nèi)體外兩方面探究了HOTAIR與miR-138的相互作用及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑、siRNA陰性對照、si-HOTAIR、miR-138 inhibitor、miR-138 mimic購自上海吉瑪公司。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、牛胎血清(FBS)購自美國Hyclone公司。LPS購自美國sigma公司。Trizol試劑、MTT試劑盒、RIPA裂解液、ECL顯色液、BCA試劑盒、Hoechst染色試劑盒購自北京索萊寶生物公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SsoFastTMEva-Green?Supermix試劑盒購自美國Bio-rad公司。HE染色試劑盒、心肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ,cTnⅠ)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、IL-1β、IL-6，心肌丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase,SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。IκB激酶(ⅠkappaB kinase,IKK)、磷酸化核因子kappaB激酶抑制因子α(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,p-IκBα)、核因子kappaB p65(nuclear factor-kappaB p65,NF-κB p65)和β-actin抗體購自英國Abcam生物公司。雙熒光素酶報(bào)告檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司。試驗(yàn)所用到的引物采用Primer3 Input網(wǎng)站設(shè)計(jì)，由上海生工生物公司合成。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型制備及心臟功能檢測 32只(體質(zhì)量250～300 g)健康雄性SD大鼠購自上海杰思捷試驗(yàn)動(dòng)物有限公司，于恒溫恒濕、明暗交替(12 h)的環(huán)境中喂養(yǎng)48 h。32只大鼠隨機(jī)分為Control組、CLP組、siRNA+CLP組、si-HOTAIR+CLP組，每組8只，采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation puncture,CLP)制備大鼠膿毒癥模型。大鼠在乙醚吸入麻醉下無菌開腹手術(shù)，Control組開腹找出盲腸后再將其還納腹腔并逐層關(guān)腹。除Control組外，其余各組在麻醉狀態(tài)下開腹，在距離盲腸末端1 cm處用4～0絲線結(jié)扎盲腸，用18G針頭在結(jié)扎處穿過3次并防止糞便污染，之后用生理鹽水潤濕腸管，還納腹腔并逐層關(guān)腹，術(shù)后各組大鼠均使用生理鹽水2 ml注射，12 h后再重復(fù)1次。在動(dòng)物模型制備完畢后，采用10 μg/μl的siRNA陰性對照和si-HOTAIR，按照Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑的操作說明制備siRNA/Lipofectamin復(fù)合物，分別對siRNA+CLP組和si-HOTAIR+CLP組大鼠進(jìn)行左心室注射。在處理完成48 h后，使用小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)PanoView b1500檢測大鼠心肌左心室收縮壓(LVSP)和左心室舒張末期壓(LVEDP)。處死大鼠，血清4℃ 3 000 g 離心10 min,收集血清并保存在-80℃冰箱中。收集心肌組織烘干后(80℃， 48 h)，貯存于-80℃冰箱以備后續(xù)使用。

1.2.2大鼠心肌細(xì)胞膿毒癥心肌損傷體外模型制備 大鼠心肌細(xì)胞株H9c2購自美國ATCC公司，使用含1.5 g/L NaHCO3、10%FBS、1%谷氨酰胺、1%青鏈霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)于含有5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中，隔天換液1次，2～3 d根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)換液1次。將細(xì)胞分為Control組、LPS組、siRNA+LPS組、si-HOTAIR+LPS組，除Control組外，其余各組均使用LPS處理24 h，按照Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑的操作說明分別制備siRNA陰性對照和si-HOTAIR的siRNA/Lipofectamin復(fù)合物，分別對siRNA+LPS組和si-HOTAIR+LPS組進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h后，1 000 r/min 離心5 min收集細(xì)胞，保存于-80℃冰箱中以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2.3RT-PCR檢測mRNA表達(dá)水平 根據(jù)1.2.1、1.2.2描述的試驗(yàn)方法進(jìn)行分組處理后(組織樣品需要進(jìn)一步通過液氮搗碎處理)，用Trizol提取各組細(xì)胞RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，隨后采用PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，循環(huán)條件為：預(yù)變性95℃ 10 min，變性95℃ 15 s，退火63℃ 1 min 40個(gè)循環(huán)。根據(jù)SsoFastTMEva-Green?Supermix試劑盒檢測檢測各組mRNA水平，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4HE檢測心肌組織病理變化 根據(jù)1.2.1描述的試驗(yàn)方法進(jìn)行分組處理后，將心肌置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋后切片，HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.2.5si-HOTAIR、miR-138 inhibitor共轉(zhuǎn)染細(xì)胞及MTT檢測 將細(xì)胞分為Control組、LPS組、si-HOTAIR+LPS組、si-HOTAIR+LPS+inhibitor組，除si-HOTAIR+LPS+inhibitor組外，其余各組按1.2.2所描述的方法對細(xì)胞進(jìn)行處理。si-HOTAIR+LPS+inhibitor組按照Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑的操作說明共轉(zhuǎn)染si-HOTAIR和miR-138 inhibitor。轉(zhuǎn)染24 h后，各組取出部分細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入100 μl MTT溶液(5 mg/ml)，混勻后于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后每孔加入150 μl的二甲基亞砜，于搖床上低俗振蕩10 min后，酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm檢測細(xì)胞吸光度。剩余細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后，1 000 r/min 離心5 min收集細(xì)胞，保存于-80℃冰箱中以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2.6Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡 按照1.2.5描述的方法將細(xì)胞進(jìn)行分組處理，將細(xì)胞接種于6孔板中。用4%多聚甲醛于室溫固定細(xì)胞30 min，用0.5%的TrintonX-100進(jìn)行透膜處理，隨后滴加Hoechst熒光染料對細(xì)胞進(jìn)行染色，室溫放置30 min。最后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。以細(xì)胞核固縮，細(xì)胞核呈致密濃染或碎片狀致密濃染視為細(xì)胞凋亡(細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.2.7cTnⅠ、CK-MB檢測 根據(jù)1.2.1描述的試驗(yàn)方法進(jìn)行分組處理后，取心肌組織200 mg，4℃生理鹽水清洗后研磨制成10%心肌組織勻漿，cTnⅠ、CK-MB檢測通過酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)試劑盒完成。

1.2.8TNF-α、IL-1β、IL-6檢測 根據(jù)1.2.1描述的試驗(yàn)方法進(jìn)行分組處理后，按上所述的方法制備檢測樣品，按照試劑盒操作說明檢測TNF-α、IL-1β、IL-6。

1.2.9MDA和SOD的檢測 根據(jù)1.2.1、1.2.5描述的試驗(yàn)方法進(jìn)行分組處理后，按1.2.1的方法制備檢測樣品，按照試劑盒操作說明檢測MDA和 SOD。

1.2.10Western blot檢測 按照1.2.1、1.2.5描述的方法對細(xì)胞或組織分組處理后(組織樣品需要進(jìn)一步通過液氮搗碎處理)，用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，用BCA試劑盒對各組細(xì)胞總蛋白濃度進(jìn)行檢測，調(diào)整各組蛋白濃度一致。每組取30 μg蛋白用10% SDS-PAGE分離，將分離后的蛋白采用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h后，加入適宜濃度一抗，4℃孵育過夜。第2天用磷酸鹽緩沖液(phosphate Buffer solution,PBS)清洗3次后，加入二抗室溫孵育2 h后，滴加ECL顯色液曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參。

1.2.11熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)檢測 用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測了miR-138可能的結(jié)合位點(diǎn)位于LncRNA HOTAIR 2 142～2 163 bp區(qū)域。分別構(gòu)建HOTAIR Lenti-reporter-Luciferase野生型載體和其突變型載體。將細(xì)胞分為HOTAIR wt、HOTAIR mut、HOTAIR wt+miR-138 mimic、HOTAIR mut+miR-138 mimic四組。加樣到24孔板中，放置1 d。將上述野生型載體(200 ng)和pRL-CMV載體(20 ng)轉(zhuǎn)染到HOTAIR wt、HOTAIR wt+miR-138 mimic組中，突變型載體(200 ng)和Prl-CMV載體(20 ng)分別轉(zhuǎn)染到HOTAIR mut、HOTAIR mut+miR-138 mimic組中。同時(shí)，HOTAIR wt+miR-138 mimic和HOTAIR mut+miR-138 mimic組中轉(zhuǎn)染miR-138 mimic。在轉(zhuǎn)染48 h后，使用熒光素酶報(bào)告檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1LncRNA HOTAIR在體內(nèi)抑制miR-138的表達(dá) 如圖1A所示，與Control組比較，CLP組HOTAIR表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)，miR-138表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用si-HOTAIR對HOTAIR進(jìn)行沉默，如圖1B所示，與Control組比較，CLP組HOTAIR表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)，miR-138表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CLP組比較，si-HOTAIR+CLP組HOTAIR表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)，miR-138表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2沉默 HOTAIR減輕CLP大鼠心肌組織的病理變化 如圖2所示，Control組心肌纖維排列規(guī)則，細(xì)胞無變性壞死，CLP組心肌纖維結(jié)構(gòu)改變，出現(xiàn)細(xì)胞皺縮，核固縮，細(xì)胞間隙變寬。si-HOTAIR+CLP組心肌組織無明顯病理變化。

圖1 HOTAIR及miR-138在大鼠體內(nèi)的表達(dá)Fig.1 Expression of HOTAIR and miR-138 in ratsNote:n=8,***.P<0.001 versus Control group;###.P<0.001 versus CLP group.

2.3沉默 HOTAIR保護(hù)CLP大鼠心臟功能 如圖3A、B所示，與Control組比較，CLP組LVSP顯著降低(P<0.01)，LVEDP顯著升高(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CLP組比較，si-HOTAIR+CLP組LVSP顯著升高(P<0.01)，LVEDP顯著降低(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖3C、圖3D所示，與Control組比較，CLP組cTnⅠ表達(dá)水平、CK-MB活性顯著升高(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CLP組比較，si-HOTAIR+CLP組cTnⅠ表達(dá)水平、CK-MB活性顯著降低(P<0.001，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4沉默HOTAIR減輕心肌組織炎癥 如圖4所示，與Control組比較，CLP組TNF-α、IL-1β、IL-6濃度顯著升高(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CLP組比較，si-HOTAIR+CLP組TNF-α、IL-1β、IL-6濃度顯著降低(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 沉默HOTAIR對大鼠心功能和心肌損傷的影響Fig.3 Effect of si-HOTAIR on cardiac function and myocardial injury in ratsNote:n=8,**.P<0.01,***.P<0.001 versus Control group;##.P<0.01,###.P<0.001 versus CLP group.

2.5沉默HOTAIR對降低大鼠血清的氧化應(yīng)激 如圖5A、B所示，與Control組比較，CLP組SOD活性顯著降低(P<0.001)，MDA濃度顯著升高(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CLP組比較，si-HOTAIR+CLP組SOD活性顯著升高(P<0.001)，MDA濃度顯著降低(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6沉默HOTAIR抑制大鼠心肌組織NF-κB的激活 如圖6所示，與Control組比較，CLP組IKK、p-IκBα、NF-κB p65表達(dá)水平顯著上升(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CLP組比較，si-HOTAIR+CLP組IKK、p-IκBα、NF-κB p65表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7HOTAIR在大鼠心肌細(xì)胞中抑制miR-138的表達(dá) 如圖7A所示，與Control組比較，LPS組HOTAIR表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)，miR-138表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 沉默 HOTAIR對大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6濃度影響Fig.4 Effect of si-HOTAIR on concentration of TNF-α,IL-1β,IL-6 in ratsNote:n=8,***.P<0.001 versus Control group;###.P<0.001 versus CLP group.

圖5 沉默HOTAIR對大鼠血清氧化應(yīng)激的影響Fig.5 Effect of si-HOTAIR on serum oxidative stress in ratsNote:n=8,***.P<0.001 versus Control group;###.P<0.001 versus CLP group.

使用si-HOTAIR對HOTAIR進(jìn)行沉默，如圖7B所示，與Control組比較，LPS組HOTAIR表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)，miR-138表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與LPS組比較，si-HOTAIR+LPS組HOTAIR表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)，miR-138表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.8miR-138靶向作用于HOTAIR 如圖8所示，與HOTAIR wt組比較，HOTAIR wt+miR-138 mimic組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HOTAIR mut組、HOTAIR mut+miR-138 mimic組熒光素酶活性不存在顯著差異。驗(yàn)證了miR-138靶向作用于HOTAIR。

2.9沉默HOTAIR抑制膿毒癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡 如圖9B、C所示，與Control組比較，LPS組細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01,P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與LPS組比較，si-HOTAIR+LPS組細(xì)胞活力顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01,P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與si-HOTAIR+LPS組比較，si-HOTAIR+LPS+inhibitor組細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6 沉默HOTAIR對大鼠心肌組織IKK、p-IκBα、NF-κB p65表達(dá)影響Fig.6 Effect of si-HOTAIR on expressions of IKK，p-IκBα，NF-κB p65 in rats myocardial tissueNote:n=8,***.P<0.001 versus Control group;###.P<0.001 versus CLP group.

圖7 HOTAIR及miR-138在H9c2細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)Fig.7 Expression of HOTAIR and miR-138 in H9c2 cellsNote:n=6,***.P<0.001 versus Control group;###.P<0.001 versus LPS group.

圖8 熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)檢測miR-138和HOTAIR的靶向關(guān)系Fig.8 Luciferase reporter assay was performed for measuring targeting relationship between miR-138 and HOTAIRNote:n=3,***.P<0.001 versus HOTAIR wt group.

圖9 沉默HOTAIR對H9c2細(xì)胞活性及細(xì)胞凋亡的影響Fig.9 Effect of si-HOTAIR on viability and apoptosis of H9c2Note:n=6,**.P<0.01,***.P<0.001 versus Control group;##.P<0.01,###.P<0.001 versus LPS group;&&.P<0.01 versus si-HOTAIR+LPS group.

2.10沉默 HOTAIR抑制大鼠心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激 如圖10A、B所示，與Control組比較，LPS組SOD活性顯著降低，MDA濃度顯著升高(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與LPS組比較，si-HOTAIR+LPS組SOD活性顯著升高，MDA濃度顯著降低(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與si-HOTAIR+LPS組比較，si-HOTAIR+LPS+inhibitor組SOD活性顯著降低，MDA濃度顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖10 沉默HOTAIR對H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響Fig.10 Effect of si-HOTAIR on oxidative stress of H9c2Note:n=6,***.P<0.001 versus Control group;###.P<0.001 versus LPS group;&&.P<0.01 versus si-HOTAIR+LPS group.

圖11 沉默HOTAIR對H9c2細(xì)胞中IKK、p-IκBα、NF-κB p65表達(dá)影響Fig.11 Effect of si-HOTAIR on expression of IKK,p-IκBα,NF-κB p65 of H9c2Note:n=6,***.P<0.001 versus Control group;##.P<0.01 versus LPS group;&&.P<0.01 versus si-HOTAIR+LPS group.

2.11沉默HOTAIR抑制大鼠心肌細(xì)胞NF-κB通路的激活 如圖11所示，與Control組比較，LPS組IKK、p-IκBα、NF-κB p65表達(dá)水平顯著上升(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與LPS組比較，si-HOTAIR+LPS組IKK、p-IκBα、NF-κB p65表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與si-HOTAIR+LPS組比較，si-HOTAIR+LPS+inhibitor組IKK、p-IκBα、NF-κB p65表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

膿毒癥是一種由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)，會導(dǎo)致多器官衰竭，其中心臟是易損器官之一[1]，目前的治療方法仍停留在早期的抗菌藥物治療和支持療法。非編碼RNA的研究為治療膿毒癥引發(fā)的心肌炎癥提供了新的思路[5,10]。之前的文獻(xiàn)報(bào)道了HOTAIR可通過促進(jìn)NF-κB p65亞基磷酸化，激活NF-κB信號途徑，激活心肌炎癥反應(yīng)[5]；miR-138可以通過MLK3/JNK/c-jun信號途徑降低由缺氧引起的心肌細(xì)胞凋亡[9]，并且有研究證實(shí)，HOTAIR和miR-138在體內(nèi)可以通過相互作用影響腎細(xì)胞癌和LPS誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[6,8]。本文首次探究了miR-138和HOTAIR在膿毒癥引發(fā)的心肌炎癥中的相互作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在CLP模型大鼠體內(nèi)的表達(dá)量顯著升高，miR-138表達(dá)量顯著降低，沉默HOTAIR表達(dá)后發(fā)現(xiàn)miR-138表達(dá)量顯著升高，表明HOTAIR和miR-138在膿毒癥大鼠心肌組織中確實(shí)存在相互作用關(guān)系。通過熒光素酶報(bào)告基因檢測，發(fā)現(xiàn)HOTAIR可以直接作用于miR-138，證實(shí)了前人的研究。

心肌炎癥會引起心肌組織一系列病理變化，對CLP大鼠心肌組織的HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，對HOTAIR的沉默，顯著減輕了心肌組織的病理性變化。cTnⅠ和CK-MB是常用的心肌損傷標(biāo)記物，心肌細(xì)胞損傷時(shí)會釋放這些物質(zhì)進(jìn)入血液，導(dǎo)致血清cTnⅠ、CK-MB濃度與活性升高[11]。研究發(fā)現(xiàn)，對HOTAIR的沉默，顯著減輕了心肌損傷，保護(hù)了心肌細(xì)胞功能。與之前的研究結(jié)果一致[5]。進(jìn)一步對miR-138進(jìn)行沉默后發(fā)現(xiàn)，對miR-138的沉默導(dǎo)致心肌細(xì)胞活力顯著降低，凋亡率顯著上升，表明miR-138對大鼠心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

炎癥細(xì)胞因子參與了膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷過程，研究表明，TNF-α和IL-1β共同啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，對心肌有負(fù)性肌力作用，IL-6對心肌收縮性能的負(fù)調(diào)控作用則是通過蛋白激酶通路相互聯(lián)系的[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，對HOTAIR的沉默可以抑制CLP模型大鼠中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá),表明HOTAIR參與了炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)過程。

氧化應(yīng)激在膿毒癥心肌損傷中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15]，膿毒癥會誘發(fā)線粒體過度產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致氧化/抗氧化失衡，活性氧破壞心肌細(xì)胞膜，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物MDA大量產(chǎn)生，SOD活性被消耗。本研究發(fā)現(xiàn)，通過沉默HOTAIR表達(dá)，SOD的活性恢復(fù)，MDA產(chǎn)量下降，表明HOTAIR參與了大鼠心肌的氧化應(yīng)激。進(jìn)一步對miR-138進(jìn)行沉默發(fā)現(xiàn)，SOD的活性降低，MDA產(chǎn)量升高，表明miR-138對膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞中氧化應(yīng)激具有抑制作用。

NF-κB信號途徑在各類炎癥反應(yīng)中被廣泛涉及。通常狀態(tài)下，NF-κB家族蛋白以p50-p65的異二聚體形式存在，并與kappaB抑制蛋白(inhibitor kappaB,IκB)結(jié)合呈非活化狀態(tài)，定位于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中[16,17]。當(dāng)存在誘導(dǎo)物如TNF-α、IL-1、IL-6、LPS、紫外線等的條件下，IκB激酶被激活，磷酸化IκB，使其釋放p50-p65，之后進(jìn)一步多聚泛素化，最終被蛋白酶體降解。此時(shí)p50-p65暴露出核定位信號，轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核，作為轉(zhuǎn)錄因子與各種目標(biāo)DNA序列結(jié)合。為了探究NF-κB信號通路是否在大鼠膿毒性心肌炎癥中受HOTAIR和miR-138的調(diào)節(jié)，本研究從體內(nèi)體外兩方面對IKK、p-IκBα、NF-κB p65表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)HOTAIR沉默可以顯著抑制IKK、p-IκBα、NF-κB p65的表達(dá)，表明HOTAIR參與了NF-κB的激活，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。體外進(jìn)一步使用抑制劑對miR-138也進(jìn)行沉默，發(fā)現(xiàn)IKK、p-IκBα、NF-κB p65表達(dá)量水平相比si-HOTAIR+LPS組顯著升高，表明miR-138可以抑制NF-κB的激活，從而降低炎癥反應(yīng)。

綜上所述，LncRNA HOTAIR參與了大鼠膿毒性心肌炎癥的病理發(fā)展過程，參與了炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)及氧化應(yīng)激的發(fā)生，對NF-κB有激活作用；miR-138可以提高細(xì)胞活力，抑制氧化應(yīng)激，抑制NF-κB信號通路。HOTAIR可以在心肌組織中與miR-138發(fā)生相互作用，導(dǎo)致miR-138沉默。因此HOTAIR可以通過沉默miR-138達(dá)到對大鼠膿毒癥心肌炎癥和氧化應(yīng)激的調(diào)控目的。結(jié)合之前已報(bào)道的文獻(xiàn)，推測HOTAIR和miR-138在大鼠膿毒癥心肌炎癥中存在多種不同途徑發(fā)揮調(diào)控作用。大鼠HOTAIR的沉默在膿毒癥心肌炎癥中保護(hù)了心肌細(xì)胞，為在膿毒癥心肌炎癥中維持心臟功能提供了新的治療思路。后期將對HOTAIR與其他miRNA的作用和機(jī)制進(jìn)一步研究。