吳家勁 朱森林 周密 孫會增

（1. 浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院奶業(yè)科學(xué)研究所，杭州 310058；2. 加拿大阿爾伯塔大學(xué)農(nóng)業(yè)食品營養(yǎng)科學(xué)系，埃德蒙頓，加拿大 T6G 2P5）

奶及奶制品是人類最重要的食用蛋白質(zhì)來源之一。奶牛作為奶及奶制品的供應(yīng)源，起著關(guān)鍵作用。雖然當(dāng)前奶牛的產(chǎn)奶性能已經(jīng)達到了較高水平，如美國奶牛的年平均產(chǎn)奶量超過了10 t［1］，但隨著世界人口的持續(xù)增長以及人均牛奶需求量的逐漸增加，如何進一步提高奶牛生產(chǎn)效率和環(huán)境可持續(xù)性成為了當(dāng)前緊迫的任務(wù)。目前，該方面的研究已經(jīng)從關(guān)注傳統(tǒng)的泌乳調(diào)控的外部要素（如改變?nèi)占Z的營養(yǎng)成分等）逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榻沂久谌檎{(diào)節(jié)的生物學(xué)過程［2］。奶牛的瘤胃微生物包括細菌、古菌、真菌和原蟲4大類，它們負責(zé)降解和發(fā)酵不同類型的飼料，從而為宿主的生長、繁殖、維持和泌乳提供大量營養(yǎng)物質(zhì)，這就為揭示相關(guān)的生物學(xué)過程提供了巨大的潛力［3］。瘤胃中的微生物通過發(fā)酵合成揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acid，VFA），微生物蛋白（Microbial crude protein，MCP）和維生素等養(yǎng)分與宿主建立聯(lián)系，協(xié)助宿主完成多種生理活動［4］，這為研究和調(diào)控奶牛的泌乳生物學(xué)過程提供了幫助，有利于實現(xiàn)更加高效和可持續(xù)的奶業(yè)。

1990年前，奶牛瘤胃微生物的研究主要依靠基于培養(yǎng)的方法，但由于大多數(shù)瘤胃微生物是不可培養(yǎng)的，因此得到的信息非常有限［5］。之后出現(xiàn)了一系列新技術(shù)，并逐漸應(yīng)用于奶牛瘤胃微生物領(lǐng)域。以“奶牛”和“瘤胃微生物”的英文翻譯為關(guān)鍵詞在Web of Science數(shù)據(jù)庫中進行檢索，結(jié)果顯示從1990-2019年，共有2 052篇相關(guān)SCI文章發(fā)表，2013年以后文章數(shù)量增長較快（圖1）。使用一個詞云來說明這2 052篇論文摘要中出現(xiàn)的高頻詞，其中最常見的有“甲烷”、“瘤胃”、“發(fā)酵”、“MCP”、“VFA”、“奶產(chǎn)量”、“16S”和“宏基因組學(xué)”（圖1）。這表明在奶牛瘤胃微生物領(lǐng)域的已發(fā)表研究中，與效率和生產(chǎn)有關(guān)的參數(shù)受到了更多的關(guān)注。此外，近年來瘤胃微生物對犢牛健康和發(fā)育的影響也開始受到了重視［6-7］。越來越多的研究強調(diào)了二代測序（Nest generation sequence，NGS）技術(shù)在檢測和分析微生物中的重要性，如擴增子測序、宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏蛋白組等。16S rRNA基因等擴增子測序、宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)分別用于識別操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU）/擴增子序列變異體（Amplicon sequence variants，ASV）、預(yù)測功能信息和活性微生物/代謝通路（圖1）。這些基于NGS的研究需要扎實的綜合知識，包括生物信息學(xué)、分析化學(xué)、生物學(xué)等。最近一項基于283個牛瘤胃微生物宏基因組二、三代混合測序的研究將宏基因組數(shù)據(jù)比對率從15%提高至50%-70%，同時也提供了宏基因組分箱、下游分析的全套流程和方法標(biāo)準［8］。即便NGS高通量分析方法已經(jīng)被廣泛接受并形成標(biāo)準流程，但在應(yīng)用過程中的技術(shù)性操作和數(shù)據(jù)處理分析產(chǎn)生的變異也必須最小化［9］。在NGS分析流程中，如樣品DNA/RNA的提?。?0］、分類學(xué)數(shù)據(jù)庫的比對［11］、數(shù)據(jù)歸一化［12］，任何不當(dāng)?shù)奶幚矶紝?dǎo)致微生物檢測的結(jié)果出現(xiàn)顯著偏差和錯誤。

圖1 奶牛瘤胃微生物領(lǐng)域論文發(fā)表、研究熱點和研究方法

奶牛瘤胃微生物研究正處于快速發(fā)展階段，但同時也面臨著巨大挑戰(zhàn)。瘤胃微生物可以在多大程度上幫助人們揭示奶牛泌乳的基本生物學(xué)機制仍然是一個問題。為了更好理解瘤胃微生物與奶牛生長發(fā)育和重要表型的關(guān)系，以期從瘤胃微生物調(diào)控策略角度提高奶牛生產(chǎn)效率和環(huán)境可持續(xù)性，本文系統(tǒng)綜述了瘤胃微生物在產(chǎn)奶效率、甲烷排放和瘤胃發(fā)育方面的研究進展，詳細歸納了瘤胃微生物與奶牛主要生產(chǎn)性狀關(guān)系，同時指出了奶牛瘤胃微生物未來的研究趨勢。

1 瘤胃微生物與奶牛產(chǎn)奶效率

目前，全球奶牛養(yǎng)殖業(yè)面臨的重要挑戰(zhàn)之一是如何提高動物對飼料能量的利用效率［13］。產(chǎn)奶效率是指產(chǎn)奶動物研究上所使用的飼料效率的概念，反映了牧場盈利能力和對環(huán)境的影響［14］。產(chǎn)奶效率的不同通常歸因于先進的遺傳選育、飼養(yǎng)和管理策略［15-16］。但是，產(chǎn)奶效率是一個復(fù)雜的性狀，除了遺傳因素外，奶牛個體之間的差異還受許多因素的影響［17］。有證據(jù)表明，瘤胃微生物的組成、菌群內(nèi)部以及與宿主的相互作用與乳成分和飼料效率有關(guān)［18-19］。作為瘤胃中微生物群發(fā)酵的最終產(chǎn)物，VFA可以提供奶牛70%以上的能量需要［19］，MCP可以提供60%的小腸可吸收非氨態(tài)氮［20］。VFA和MCP給奶牛提供了大量的養(yǎng)分，并顯著影響營養(yǎng)狀況，最終導(dǎo)致飼料效率變化。加拿大Leluo Guan教授實驗室發(fā)現(xiàn)肉牛的飼料效率與瘤胃微生態(tài)［21］、細菌菌群［22-23］和甲烷菌群有關(guān)［24］，且最新的試驗表明某些與飼料效率相關(guān)的瘤胃微生物特征可遺傳［25］。其他研究人員也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果［26-27］。相比之下，奶牛在一個泌乳周期不同的生理階段（如泌乳早期、泌乳中期、泌乳后期、干奶期和圍產(chǎn)期），能量需求存在較大波動，這為類似的研究帶來了更多挑戰(zhàn)。

Jami等［4］對15頭奶牛的泌乳性能參數(shù)與瘤胃細菌群落進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)奶量和乳成分與各種瘤胃細菌的豐度密切相關(guān)，如Adlercreutzia與產(chǎn)奶量呈正相關(guān)（R = 0.57，P= 0.027），F(xiàn)irmicutes與Bacteroidetes的比率和乳脂產(chǎn)量之間也存在很強的相關(guān)性（R = 0.72，P= 0.002）。但是，這項研究并未考慮泌乳階段的影響，因此，他們實驗室使用454焦磷酸測序進一步表征了14頭荷斯坦奶牛在前兩個泌乳周期的早期、中期和后期的細菌群落組成［28］。結(jié)果表明，即使在相同的日糧條件下，瘤胃微生物菌群在不同泌乳期和年齡中也是動態(tài)的，低效率奶牛的Anaerovibrio和Butyrivibrio的豐度較高，而Coprococcus的豐度較低，這表明瘤胃微生物菌群在影響奶牛產(chǎn)奶效率方面可能起著至關(guān)重要的作用。本課題組最近對334頭奶牛瘤胃微生物的16S rRNA基因進行測序發(fā)現(xiàn)，瘤胃菌群與產(chǎn)奶能力之間存在顯著相關(guān)，其中核心微生物群對關(guān)聯(lián)的貢獻為 52.9%［29］。Shabat等［30］比較了 40頭泌乳中期的高效率奶牛和38頭低效率奶牛的瘤胃細菌和古菌發(fā)現(xiàn)，高飼料效率奶牛有著較低的瘤胃微生物組基因含量和OTU豐度，他們還提出了Megasphaera elsdenii和Coprococcus catus是產(chǎn)奶效率的關(guān)鍵決定因素。Xue等［31］比較了20頭低產(chǎn)奶量、低乳蛋白產(chǎn)量（LL）奶牛和20頭高產(chǎn)奶量、高乳蛋白含量（HH）奶牛的瘤胃細菌菌群發(fā)現(xiàn)，HH組奶牛瘤胃的Sharpea屬相對豐度顯著高于LL組，而Succinivibrio顯著低于LL組。這些結(jié)果表明，瘤胃中的少數(shù)微生物種類可能會在一定程度上影響微生物菌群的結(jié)構(gòu)和功能，最終改變宿主的生產(chǎn)效率。因此，對瘤胃微生物作用機制的理解可以潛在地應(yīng)用于實現(xiàn)高效和環(huán)保的畜牧業(yè)。在圍產(chǎn)期，適應(yīng)日糧的變化對瘤胃微生物來說是一個很大的挑戰(zhàn)［32］。Lima等［33］使用MiSeq對115頭高產(chǎn)奶牛產(chǎn)前和產(chǎn)后瘤胃微生物的16S rRNA和18S rRNA進行了測序，結(jié)果顯示，與產(chǎn)后奶牛相比，產(chǎn)前真菌的豐富度較高，而纖毛蟲的豐富度較低，產(chǎn)前和產(chǎn)后瘤胃微生物菌群的變化曲線可用于準確預(yù)測宿主的生產(chǎn)性狀。Jewell等［28］對奶牛連續(xù)3個泌乳周期進行研究發(fā)現(xiàn)，較高豐度的Christensenellaceae家族與產(chǎn)奶效率也呈負相關(guān)。Derakhshani等［34］研究發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)前，當(dāng)奶牛的自由干物質(zhì)采食量減少時，瘤胃微生物的個體間差異大大降低，在產(chǎn)后，當(dāng)自由干物質(zhì)采食量增加時，蛋白降解菌、淀粉分解菌和乳酸產(chǎn)生菌的豐富度較高，這表明瘤胃微生物能夠從高濃度碳水化合物的產(chǎn)后泌乳日糧中獲取能量。Indugu等［35］使用16S rRNA基因擴增子序列比較了泌乳中期的47頭高產(chǎn)奶牛和38頭低產(chǎn)奶牛的瘤胃細菌組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高產(chǎn)奶牛中，Succinivibrionaceae豐度較高，Prevotella、S24-7和Succinivibrionaceae與產(chǎn)奶量呈正相關(guān)，但是該研究并沒有排除日糧因素對產(chǎn)奶量的影響。為了研究其中的作用機制，而不僅僅是瘤胃微生物群與產(chǎn)奶效率之間的相關(guān)性，Weimer等［14］把高低效率奶牛的瘤胃內(nèi)容物幾乎完全互換，結(jié)果表明瘤胃細菌群落對產(chǎn)奶效率有明顯的貢獻，并提示移植和重塑整個瘤胃微生物菌群可以改變宿主表型。通過評估低、中、高產(chǎn)奶量和干奶期的荷斯坦奶牛的瘤胃細菌、古菌和真菌對甲烷排放量和生產(chǎn)性能的影響，Cunha等［36］的研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃中高豐度 的Christensenel-laceae，Mogibacteriaceae，S24-7，Butyrivibrio，Shwartzia，Treponema和Methanosphaera可能會減少甲烷排放并提高產(chǎn)奶量。

與產(chǎn)奶效率相關(guān)的瘤胃微生物的研究工作主要是在近幾年完成的，這些研究大大拓寬了我們對瘤胃微生物與宿主生產(chǎn)性能之間的相互作用的理解［37］。根據(jù)已有的研究結(jié)果，對瘤胃微生物進行調(diào)控的可行性越來越大，如直接給奶?？诜钚晕⑸飳μ岣弋a(chǎn)奶量有很好的效果［38］。然而，目前對瘤胃微生物菌群的認知還非常有限。對瘤胃中特定的微生物和微生物間復(fù)雜的相互作用的進一步探索需要更先進的技術(shù)，能在種或菌株水平來準確鑒定微生物［39］。與目前依賴相關(guān)性和推測分析的研究相比，建立一個更可靠的模型來評估瘤胃微生物菌群對產(chǎn)奶量的影響，并預(yù)測瘤胃微生物對日糧調(diào)控的反應(yīng)，更具挑戰(zhàn)性［40］。在未來，將微生物這個因素納入“遺傳-環(huán)境-瘤胃-微生物菌群”的相互作用模型中，來加深對奶牛泌乳機制和調(diào)控的了解是件值得期待的事情。在微生物分析中除了微生物多樣性和預(yù)測功能外，關(guān)注直接反映微生物代謝活性的下游代謝物，對了解瘤胃發(fā)生的生物學(xué)機制也具有重要作用［41-42］。利用有效途徑改善瘤胃功能只是時間問題，但選擇調(diào)控方法時，必須考慮瘤胃微生物群代謝引起的環(huán)境問題，特別是來自甲烷代謝的環(huán)境問題［43］。

2 瘤胃古菌的甲烷排放與減排的研究進展

家畜胃腸道甲烷排放約占全球甲烷排放量的17%［44］。奶牛排放的甲烷占其能量損失的5.3%-6.1%［45-46］，甲烷的增溫潛力是二氧化碳的 25 倍［47］，減少胃腸道甲烷的排放對經(jīng)濟和環(huán)境都有積極的影響。

瘤胃中的古菌是主要產(chǎn)甲烷菌。近20年來，對瘤胃古菌的研究蓬勃發(fā)展，其主要集中于瘤胃古菌群落的組成及開發(fā)調(diào)控甲烷菌的方法的研究。一般來說，泌乳的反芻動物每克瘤胃內(nèi)容物中含有107-108個古菌。甲烷菌群通常由3個主要的系統(tǒng)發(fā)育群組成，包括Methanobrevibacter、Methanomicrobium和Methanomassiliicoccales［48］。

降低動物胃腸道甲烷排放的研究主要集中在降低古菌總數(shù)上，如添加食用油和脂肪酸［49-50］，甲烷菌的免疫抑制［51］、清除原蟲［52-54］和調(diào)整日糧配方［55］等措施。然而，無論古菌總數(shù)是否受到影響，這些方法都沒有實現(xiàn)長期有效地減少甲烷排放。于是有人提出了一個問題：古菌總數(shù)是否重要。事實上，后來的研究已經(jīng)證明，古細總數(shù)量與宿主甲烷排放量無關(guān)［24，56-57］。相反，古菌群落的結(jié)構(gòu)被認為與宿主甲烷排放有關(guān)。與Methanobrevibacter gottschalkii相關(guān)的古菌系統(tǒng)發(fā)育群和荷斯坦奶牛甲烷排放量呈正相關(guān)［58］。Danielsson 等［59］根據(jù) King 等［51］和Danielsson等［56］的研究，通過將系統(tǒng)發(fā)育群劃分為SGMT組（Methanobrevibacter smithii、Methanobrevibacter gottschalkii、Methanobrevibacter millerae和Methanobrevibacter thaueri）和RO組（Methanobrevibacter ruminantium和Methanobrevibacter olleyae）來研究瘤胃的古菌群落，部分解釋了奶牛胃腸道甲烷排放的變化。RO組相對豐度越高，奶牛甲烷排放量越低［59］。一項基于超過1 000頭奶?；蛐秃?6S rRNA和18S rRNA測序的研究，發(fā)現(xiàn)奶牛具有的核心微生物群落對決定甲烷排放有顯著作用［60］。因此，減少動物胃腸道甲烷排放的有效方法可能依賴個別古菌而非整個古菌群落。

不同的飲食結(jié)構(gòu)可以改變宿主瘤胃古菌群落的組成，但在之前的研究中，飲食干預(yù)并沒有實現(xiàn)長期減少甲烷排放［61-62］。2014年有學(xué)者開發(fā)的3-硝基丙醇（3-NOP），是一種結(jié)構(gòu)上類似于甲基輔酶M的化合物，在對多個奶牛研究中證明其可以有效地減少胃腸道甲烷的排放［63-64］。這種化合物針是對甲烷生成的最后一個步驟來抑制瘤胃甲烷的產(chǎn)生［65］。有研究證明海藻也可以減少胃腸道甲烷的排放。用海藻喂養(yǎng)肉牛時，農(nóng)場內(nèi)的甲烷排放量大大降低（Kiney等，未發(fā)表）。在最近的一項研究中，用風(fēng)干的棕色海藻飼喂公羊，古菌數(shù)量減少了50%以上［66］。之前的任何研究均未實現(xiàn)如此顯著的古菌種群減少，這需要進一步研究飼喂海藻減少動物胃腸道甲烷排放的機制。

改變宿主幼年時的瘤胃古菌群落的組成可能是另一種甲烷減排的方法。斷奶前的犢牛胃腸道幾乎不產(chǎn)生甲烷，但甲烷菌群在犢牛幼年時期就已發(fā)育。Zhou等［67］對3周齡的犢牛胃腸道的微生物進行了研究發(fā)現(xiàn)，盡管個體間的菌群相對豐度和組成差異很大，但在提供固體飼料之前，甲烷菌群已形成。正如Yá?ez-Ruiz［68］等提出的，在反芻動物的幼年時期，特別是在瘤胃微生物群完全建立之前，是“預(yù)先規(guī)劃”瘤胃微生物區(qū)系的理想時間窗口。因此，有必要進一步研究如何應(yīng)用早期干預(yù)方法建立一個既能產(chǎn)生較少甲烷又能有效處理氫氣的古菌群落。

很多研究都是基于基因組DNA和RNA的分析方法開展的，在對微生物DNA樣品進行檢測的研究中，無論是采用傳統(tǒng)的分析方法（如克隆文庫、PCR-DGGE、T-RFLP），還是高通量測序方法（如擴增子測序、宏基因組），人們一直認為與Methanobrevibacter相關(guān)的古菌是瘤胃中產(chǎn)甲烷的主要的微生物。然而，一項基于宏轉(zhuǎn)錄組分析活性微生物群的研究發(fā)現(xiàn)，相對豐度最高的古菌轉(zhuǎn)錄本與Methanomassillicoccales有關(guān)［69］。這一結(jié)果提示需要重新考慮瘤胃古菌群落研究方法的重要性以及不同方法在多大程度上反映出“真實的微生物群落”。瘤胃古菌群落研究的局限性還表現(xiàn)在所參考數(shù)據(jù)庫的選擇和分類學(xué)方法的選擇上。當(dāng)使用基于16S rRNA基因序列的方法和宏基因組時，從DNA樣本中發(fā)現(xiàn)了不同的古菌組成。不同數(shù)據(jù)庫（SILVA、RDP、Greengenes、NCBI和OTT）中包含的不同參考序列也導(dǎo)致相同樣本的不同分類歸屬［11］。因此，對瘤胃古菌群落的研究迫切需要規(guī)范的工作流程。但新的分析和測序方法的出現(xiàn)將有助于更好地了解包括古菌在內(nèi)的瘤胃微生物的組成及功能。

3 瘤胃微生物在瘤胃發(fā)育中的作用

3.1 組學(xué)和瘤胃發(fā)育早期微生物

近年來，隨著NGS的廣泛應(yīng)用，對反芻動物建立反芻行為前的瘤胃微生物研究成為了熱點。在這些NGS方法中，最常用的方法是16S rRNA基因的擴增子測序。有研究利用擴增子測序發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物定植始于犢牛出生的第1天［70］。瘤胃細菌的復(fù)雜性（多樣性）隨著犢牛年齡的增長而增加，同時個體間的異質(zhì)性減少［70］。Rey等［71］對同一組犢牛從出生到第83天進行研究，以探索瘤胃微生物定植的時間動態(tài)變化，盡管他們沒有對犢牛出生第1天的瘤胃細菌群落進行分析，但成功地展示了不同分類水平下細菌群落的時間變化，特別是這項研究清楚地表明，優(yōu)勢菌群的豐度隨犢牛年齡及其采食量的變化而變化。例如，隨著固體飼料的引入，犢牛瘤胃中相對豐度最高的細菌屬之一Prevotella的豐度顯著增加［70，72-73］。Jami等［70］和 Rey 等［71］使用瘤胃液來研究瘤胃細菌群落，通過比較瘤胃內(nèi)容物與瘤胃黏膜表面附著細菌的含量，發(fā)現(xiàn)兩個微生物群落之間存在顯著差異［73］，因此在研究幼齡反芻動物的瘤胃微生物組成時，這兩個微生物群都應(yīng)該納入考慮。

擴增子測序主要是產(chǎn)生關(guān)于分類組成及其相對豐度的數(shù)據(jù)，值得一提的是，利用一些生物信息學(xué)分析方法，如PICRUSt［74］、Tax4Fun［75］、PICRUSt2［76］等可以根據(jù)擴增子測序數(shù)據(jù)預(yù)測微生物功能。與擴增子測序相比，宏基因組測序允許通過對微生物的全基因組測序來探索菌群分類和功能組成。用宏基因組評估動物建立反芻行為前的微生物區(qū)系的報道較少［72，77］。但這些研究已經(jīng)報道了在建立反芻行為前，甚至在引入固體食物之前，瘤胃中就存在水解復(fù)雜碳水化合物中糖苷鍵的糖苷水解酶。擴增子測序顯示，在建立反芻行為前，瘤胃中就存在類似成年反芻動物的菌群，而宏基因組測序顯示，類似成年反芻動物的菌群包含復(fù)雜的碳水化合物發(fā)酵所需的基因。盡管基因的存在并不一定意味著它們有活性，但基于宏基因組測序的方法為探索反芻動物建立反芻行為前的瘤胃微生物提供了在功能層面的線索。因此，在未來，使用宏轉(zhuǎn)錄組的測序方法將有助于更好地了解反芻動物建立反芻行為前的瘤胃微生物群的活性/功能。這對于預(yù)測早期微生物在瘤胃發(fā)育過程中的作用是至關(guān)重要的。

3.2 影響早期發(fā)育瘤胃微生物組成的因素

對早期發(fā)育瘤胃微生物的研究提示了很多可能影響微生物區(qū)系的因素，這些因素主要分為生物學(xué)因素（年齡、飲食、斷奶方法/年齡、個性差異）和技術(shù)因素（取樣方法/類型、測序方法、16S靶區(qū)、數(shù)據(jù)庫/質(zhì)量控制/生物信息學(xué)工具、環(huán)境污染）。探索瘤胃微生物定植過程的研究［70-71，77-78］清楚地證明了瘤胃微生物組的年齡依賴性變化，還需要注意的是，這些研究中的年齡依賴性變化總是與飲食變化相結(jié)合。在Li等［72］的研究中，犢牛出生后只飼喂代乳品，并在第2周和第6周采集瘤胃液進行16S rRNA和全基因組鳥槍法測序。因此，觀察到的微生物群落的組成和功能的變化僅代表瘤胃微生物的年齡依賴性變化。

Abecia等［79-80］使用雙胞胎羔羊進行兩種飲食干預(yù)，這樣可以使遺傳變異的影響最小化，從而充分反映出斷奶前飲食對瘤胃微生物群的影響。這些研究表明，早期飲食干預(yù)的變化（代乳品與哺乳）影響瘤胃微生物群［79-80］及其定植過程［81］。因此，即使在斷奶后，早期喂養(yǎng)也是調(diào)節(jié)瘤胃微生物定植過程和微生物組成的重要因素之一。然而，這種飼養(yǎng)方式是如何影響與早期瘤胃發(fā)育過程相關(guān)的瘤胃微生物群功能的問題仍未得到解答。

影響早期瘤胃微生物的生物學(xué)因素可以真實地解釋瘤胃微生物定植過程，但技術(shù)因素可能會使結(jié)果出現(xiàn)偏差。特別是，在擴增子測序中使用16S rRNA基因高變區(qū)和引物會引入假象［82-83］。Jovel等［79］清楚地展示了基于NGS技術(shù)層面影響腸道微生物數(shù)據(jù)解釋的因素。他們在宏基因組和擴增子測序中使用了模擬（人工）菌群，并比較了數(shù)據(jù)處理和分類的可用方法以評估最適合的方法。雖然擴增子測序存在很多問題，但宏基因組測序因為缺乏參考基因組而受到影響。特別是，他們觀察到，在沒有生物參考基因組的情況下，序列會被分配到最接近的參考基因組。此外，環(huán)境污染也是影響群落組成的重要因素。因此，樣品制備過程使用陰性對照可以避免污染造成的偏差。

3.3 瘤胃微生物在瘤胃早期發(fā)育中的作用

目前很多研究關(guān)注反芻動物斷奶過渡期瘤胃的生理（瘤胃乳頭長度、瘤胃大?。?、代謝（發(fā)酵能力）和轉(zhuǎn)錄（轉(zhuǎn)錄組、microRNA組）的變化。雖然固體飼料的引入有助于瘤胃的生理和代謝發(fā)育，但瘤胃發(fā)育背后的分子機制是個體發(fā)育控制的［85］。然而，有研究試圖揭示早期瘤胃發(fā)育背后的分子機制［86-89］。Connor及其同事還提出，潛在的分子標(biāo)記物（轉(zhuǎn)化生長因子-β1和雌激素相關(guān)受體-α）與瘤胃發(fā)育過程相關(guān)［87］。此外，瘤胃細菌與microRNAs表達之間的關(guān)聯(lián)性表明，早期微生物群可能參與瘤胃早期發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［88］。近期Malmuthuge等［90］通過整合犢牛在出生30 min，第1周、第3周和第6周的瘤胃微生物（組織和內(nèi)容物）宏基因組和宿主瘤胃組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，早期微生物群可能通過鋅的吸收影響瘤胃發(fā)育，這種相互作用可能通過miRNA進行調(diào)節(jié)。

人們對腸道微生物菌群在哺乳動物胃腸道發(fā)育中的作用已有較為充分的研究［86］，但對瘤胃微生物群（一種研究時間最長和最多的宿主相關(guān)微生物群）對個體發(fā)育的調(diào)控機制的認識依然非常有限。Malmuthuge等［92］研究了瘤胃微生物組、轉(zhuǎn)錄組和microRNA組之間的相互作用，并利用一個綜合的網(wǎng)絡(luò)分析來揭示潛在的微生物驅(qū)動瘤胃發(fā)育的分子機制。這項研究進一步表明，組織發(fā)育和代謝相關(guān)基因和microRNAs（26.3%的mRNAs和46.4%的microRNAs）與微生物代謝產(chǎn)物濃度相關(guān)，這意味著并非所有與瘤胃發(fā)育相關(guān)的機制都是個體發(fā)育調(diào)節(jié)的。然而，這些機制仍然只是基于關(guān)聯(lián)分析，有待進一步通過設(shè)計試驗和功能驗證來證實。利用免疫染色在蛋白質(zhì)水平上確認瘤胃微生物驅(qū)動瘤胃發(fā)育的變化，可能為驗證基于關(guān)聯(lián)分析的預(yù)測和鑒定微生物驅(qū)動的瘤胃發(fā)育提供更多的機會。

4 小結(jié)與展望

瘤胃微生物種類繁多、功能強大，其參與或影響宿主生理功能及表型的特征和機制逐漸被認識。在奶牛研究中，有關(guān)瘤胃微生物如何影響產(chǎn)奶性能、甲烷排放和瘤胃發(fā)育的研究被相繼報道，一些關(guān)鍵的微生物種類和代謝通路也被揭示。為了更加系統(tǒng)便捷的展示相關(guān)結(jié)果，我們整理了瘤胃微生物與奶牛主要生產(chǎn)性狀的關(guān)系（表1），其中涵蓋了具體性狀、各項研究中的技術(shù)方法和主要發(fā)現(xiàn)。這些研究

結(jié)果有助于我們理解瘤胃自身發(fā)育、調(diào)控甲烷產(chǎn)生以及提高牛奶產(chǎn)量和效率，對將來通過微生物調(diào)控策略實現(xiàn)奶業(yè)高效可持續(xù)發(fā)展也提出新的見解。

表1 瘤胃微生物與奶牛主要生產(chǎn)性狀的關(guān)系

同時我們也應(yīng)該認識到，奶牛瘤胃微生物的研究還遠遠不夠。例如，對于瘤胃微生物成員的解析還需要大量的工作，盡管目前基于培養(yǎng)的方法，對瘤胃細菌和古菌的研究取得了一些進展［93］，但更多的細菌和古菌仍需要建立培養(yǎng)方法在實驗室進行研究。近期基于283個牛瘤胃微生物宏基因組二、三代混合測序的研究大幅度提高了宏基因組數(shù)據(jù)比對率［8］，但據(jù)估計至少還有1 000種以上瘤胃微生物有待測序和組裝，尤其是對瘤胃中真核生物（如厭氧真菌、原蟲）和病毒組的測序仍然存在巨大的技術(shù)挑戰(zhàn)。長讀長的三代測序和單細胞微生物測序?qū)⒂兄谔剿餍滦凸δ芑蚝臀锓N豐度極小的未被培養(yǎng)的瘤胃微生物。此外，在功能層面，功能基因的表達和編碼蛋白的活性研究還需要借助宏轉(zhuǎn)錄組和宏蛋白組開展大量工作。目前對瘤胃微生物代謝過程中代謝豐富度的探究方法依然不足，因此對瘤胃微生物代謝過程的研究可能只是盲人摸象，有學(xué)者指出通過使用功能組（Functional group）整合瘤胃微生物物種分類（因為不同的物種分類的微生物在功能上也可能相同，同種物種分類的微生物功能也存在差異）來解決由于水平基因轉(zhuǎn)移事件以及功能冗余而造成的分類混亂，進而更好地解析瘤胃中的具體代謝途徑［94］。奶牛瘤胃微生物功能的研究還需要逐漸從描述性向機制性轉(zhuǎn)變，將來微生物組和其他組學(xué)及宿主功能基因組的聯(lián)合分析將有助于識別和構(gòu)建瘤胃微生物的功能性和生態(tài)性網(wǎng)絡(luò)，進而通過網(wǎng)絡(luò)調(diào)控減少甲烷排放和提高泌乳效率。