劉大川, 王 影

(1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院 a. 藥學(xué)院; b. 公共基礎(chǔ)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

癲癇在民間被稱為“羊癲風(fēng)”或“羊角風(fēng)”，是由大腦神經(jīng)元突發(fā)性的異常放電導(dǎo)致的短暫大腦功能障礙，屬慢性疾病。全球癲癇患者人數(shù)眾多，其中中國(guó)癲癇患病率為0.7%，每年新發(fā)病例近40萬。雖然部分癲癇癥狀可通過手術(shù)、生酮飲食等方式治療，但大部分患者仍然需要長(zhǎng)期服用藥物。新型抗癲癇藥物的研究迫在眉睫[1-3]。

1,3-硫氮雜茚結(jié)構(gòu)是一種獨(dú)特的活性骨架，研究人員以其為基礎(chǔ)，合成了諸多有藥理活性的化合物[4-7]。部分化合物表現(xiàn)出良好的抗癲癇活性[8-9]。五元含氮雜環(huán)作為一類經(jīng)典的分子，在有機(jī)合成化學(xué)、農(nóng)藥學(xué)、藥物化學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域有廣泛的研究和應(yīng)用，其中含有吡唑基團(tuán)或取代吡唑基團(tuán)的化合物，具有較好的抗菌活性[10]、抗腫瘤活性[11]、抗炎活性[12]、硝化抑制作用[13]等和抗驚厥活性[14]。

Scheme 1

基團(tuán)拼合原理表明，將具有類似活性的兩個(gè)分子拼合到一個(gè)分子內(nèi)，有可能獲得具有較好活性或較低毒副作用的新結(jié)構(gòu)。根據(jù)該原理，研究人員發(fā)現(xiàn)了貝諾酯、苯丁酸氮芥等多種藥物。

本文將1,3-硫氮雜茚結(jié)構(gòu)與3,5-二甲基吡唑環(huán)兩種活性結(jié)構(gòu)進(jìn)行了拼合，并在1,3-硫氮雜茚環(huán)的6-位引入不同長(zhǎng)度的脂肪鏈或不同取代芐基，以調(diào)節(jié)脂水分配系數(shù)和分子中的電荷分布，控制化合物透過血腦屏障的劑量和與受體結(jié)合的程度。以對(duì)甲氧基苯胺為起始原料，經(jīng)催化環(huán)合、肼代、乙酰丙酮環(huán)合、脫甲基和烷基化反應(yīng)合成了一系列吡唑聯(lián)6-取代芐基-1,3-硫氮雜茚環(huán)為骨架的系列化合物(6a～6o， Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR,13C NMR, IR和MS(EI)表征。采用動(dòng)物模型驗(yàn)證了6a～6o的活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

BURKER AV-300 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；FT-IR 1730型傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)；AXIMA CFR Plus型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。

所用試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 合成

(1) 2-氨基-6甲氧基-1,3-硫氮雜茚(2)的合成

將對(duì)甲氧基苯胺6.15 g(50 mmol)和硫氰酸銨19.0 g(250 mmol)加至150 mL圓底燒瓶中，加入冰乙酸50 mL，于室溫反應(yīng)0.5 h。冰浴冷卻，滴加液溴9.9 g(55 mmol)的冰乙酸(3.0 mL)溶液，滴畢，反應(yīng)5 h(TLC跟蹤)。倒入500 mL水中，用氨水調(diào)至pH 9，抽濾，濾餅真空干燥得灰白色固體26.2 g，收率69%， m.p.158～161 ℃[15]。

(2)3的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入25.0 g(28 mmol)和乙二醇20 mL，滴加98%濃硫酸1.5 mL，滴畢，于80 ℃反應(yīng)0.5 h。加入水合肼10 mL，升溫至140 ℃，反應(yīng)5 h(TLC監(jiān)測(cè))。倒入50 mL冰水中，有淡綠色針狀固體析出，抽濾，濾餅避光干燥得33.3 g，收率60%, m.p.167～169 ℃;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 8.76(s, 1H), 7.30(d,J=2.6 Hz, 1H), 7.21(d,J=8.8 Hz, 1H), 6.80(dd,J=8.8 Hz, 2.6 Hz, 1H), 4.94(s, 2H), 3.73(s, 3H); MS(EI)m/z: 196{[M+H+]}。

(3)4的合成

將32.0 g(10 mmol)與乙酰丙酮1.0 g(10 mmol)加入反應(yīng)瓶中，加入二氧六環(huán)20 mL，于100 ℃反應(yīng)1 h。減壓蒸除溶劑,黃色粗品經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：CH2Cl2)純化得白色固體41.9 g，收率72.3%， m.p.124～126 ℃；1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.76(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.31(d,J=2.3 Hz, 1H), 7.05(d,J=8.9 Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 3.90(s, 3H), 2.77(s, 3H), 2.32(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 159.17, 157.11, 151.80, 145.81, 142.17, 134.13, 122.83, 114.85, 109.97, 104.30, 55.76, 13.82, 13.62; IRν: 1604.77(C=N), 1577.77(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 260{[M+H+]}。

(4)5的合成

將42.6 g(10 mmol)溶于二氯甲烷50 mL中，冰浴冷卻，滴加三溴化硼7.5 g(30 mmol)，滴畢，于室溫反應(yīng)5 h。緩慢滴加冰水至無白色煙霧產(chǎn)生，減壓蒸除二氯甲烷，殘余物抽濾，濾餅用水洗滌后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：CH2Cl2)純化得淡黃色固體50.95 g，收率38.82%, m.p.186～188 ℃;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.73(d,J=8.7 Hz, 1H), 7.28(s, 1H), 6.96(d,J=8.7 Hz, 1H), 6.05(s, 1H), 5.30(s, 1H), 2.77(s, 3H), 2.32(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 160.53, 157.77, 153.05, 146.74, 146.19, 134.41, 123.03, 115.12, 110.02, 107.00, 90.41, 13.71, 13.56; IRν: 1602.81(C=N), 1579.77(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 246{[M+H+]}。

(5)6a～6o的合成通法

將50.5 g(2 mmol)，取代氯芐1.1 eq.和碳酸鉀0.5 g(3.6 mmol)加入反應(yīng)瓶中，加入乙腈20 mL和芐基三乙基氯化銨(TEBA)0.1 g，攪拌下于60 ℃反應(yīng)12～48 h(TLC跟蹤)。減壓蒸除溶劑，殘余物用50 mL熱水洗滌30 min，抽濾，濾餅真空干燥得6a～6o。

2-(3,5-二甲基-1H-1-吡唑基)-6-丁氧基-1,3-硫氮雜茚(6a): 白色固體，收率76.52%, m.p.92～94 ℃;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.75(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.30(s, 1H), 7.04(d,J=8.7 Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 4.04(t,J=6.4 Hz, 2H), 2.77(s, 3H), 2.32(s, 3H), 1.94～1.74(m, 2H), 1.59～1.45(m, 2H), 1.02(t,J=7.1 Hz, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 156.69, 151.77, 145.68, 142.16, 134.10, 122.78, 115.31, 109.93, 105.04, 68.34, 31.34, 19.26, 13.86, 13.82, 13.62; IRν: 1604.77(C=N), 1577.77(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 302{[M+H+]}。

2-(3,5-二甲基-1H-1-吡唑基)-6-戊氧基-1,3-硫氮雜茚(6b): 白色固體，收率61.28%, m.p.89～91 ℃;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.75(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.30(d,J=2.5 Hz, 1H), 7.04(d,J=8.9 Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 4.03(t,J=6.6 Hz, 2H), 2.77(s, 3H), 2.32(s, 3H), 1.83(dd,J=14.4 Hz, 6.8 Hz, 2H), 1.54～1.33(m, 4H), 0.96(t,J=7.1 Hz, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 158.99, 156.63, 151.70, 145.61, 142.09, 134.04, 122.72, 115.24, 109.87, 104.97, 68.58, 28.93, 28.15, 22.41, 13.97, 13.75, 13.55; IRν: 1604.77(C=N), 1577.77(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 316{[M+H+]}。

2-(3,5-二甲基-1H-1-吡唑基)-6-己氧基-1,3-硫氮雜茚(6c): 白色固體，收率67.71%, m.p.78～80 ℃;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.75(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.30(d,J=2.7 Hz, 1H), 7.04(d,J=8.8 Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 4.03(t,J=6.5 Hz, 2H), 2.77(s, 3H), 2.32(s, 3H), 2.00～1.74(m, 2H), 1.82～1.40(m, 2H), 1.46～1.19(m, 4H), 0.94(t,J=7.1 Hz, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 159.00, 156.63, 151.70, 145.62, 142.08, 134.04, 122.72, 115.24, 109.87, 104.97, 68.59, 31.53, 29.20, 25.68, 22.55, 13.98, 13.75, 13.56; IRν: 1608.63(C=N), 1577.77(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 330{[M+H+]}。

2-(3,5-二甲基-1H-1-吡唑基)-6-庚氧基-1,3-硫氮雜茚(6d): 白色固體，收率70.32%, m.p.85～87 ℃;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.75(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.30(d,J=2.5 Hz, 1H), 7.04(dd,J=8.9 Hz, 2.5 Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 4.03(t,J=6.5 Hz, 2H), 2.77(s, 3H), 2.32(s, 3H), 1.95～1.74(m, 2H), 1.55～1.27(m, 8H), 0.92(t,J=6.6 Hz, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 159.00, 156.63, 151.69, 145.61, 142.07, 134.03, 122.72, 115.24, 109.86, 104.96, 68.59, 31.73, 29.13(d,J=17.1 Hz), 25.96, 22.56, 14.04, 14.04, 13.75, 13.56; IRν: 1608.63(C=N), 1577.77(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 344{[M+H+]}。

2-(3,5-二甲基-1H-1-吡唑基)-6-辛氧基-1,3-硫氮雜茚(6e): 白色固體，收率62.78%, m.p.80～82 ℃;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.75(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.30(d,J=2.5 Hz, 1H), 7.04(dd,J=8.9 Hz, 2.5 Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 4.03(t,J=6.5 Hz, 2H), 2.77(s, 3H), 2.32(s, 3H), 1.96～1.73(m, 2H), 1.60～1.12(m, 10H), 0.90(t,J=7.0 Hz, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 159.00, 156.63, 151.70, 145.61, 142.08, 134.03, 122.72, 115.24, 109.86, 104.97, 68.60, 31.76, 29.24, 26.00, 22.61, 14.05, 14.05, 13.75, 13.56; IRν: 1608.63(C=N), 1577.77(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 358{[M+H+]}。

2-(3,5-二甲基-1H-1-吡唑基)-6-芐氧基-1,3-硫氮雜茚(6f): 白色固體，收率56.18%, m.p.117～119 ℃;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.77(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.58～7.34(m, 6H), 7.12(dd,J=8.9 Hz, 2.5 Hz, 1H), 6.05(s, 1H), 5.15(s, 2H), 2.77(s, 3H), 2.33(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 159.27, 156.19, 151.77, 145.97, 142.11, 136.64, 134.04, 128.55, 128.00, 127.44, 122.80, 115.45, 109.93, 105.57, 70.57, 13.76, 13.56; IRν: 1604.77(C=N), 1579.70(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 336{[M+H+]}。

2-(3,5-二甲基-1H-1-吡唑基)-6-(2-氟芐氧基)-1,3-硫氮雜茚(6g): 白色固體，收率61.18%， m.p.126～128 ℃;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.78(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.56(t,J=7.3 Hz, 1H), 7.42(d,J=2.4 Hz, 1H), 7.36(d,J=5.9 Hz, 1H), 7.22(d,J=7.5 Hz, 1H), 7.18～7.05(m, 2H), 6.05(s, 1H), 5.22(s, 2H), 2.78(s, 3H), 2.33(s, 3H3);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 162.02, 159.37, 158.74, 155.93, 151.79, 146.12, 142.12, 134.05, 129.68(dd,J=7.9 Hz, 6.1 Hz), 124.20(d,J=3.5 Hz), 122.81, 115.31(t,J=10.6 Hz), 109.94, 105.66, 64.34, 13.74, 13.54; IRν: 1604.77(C=N), 1577.97(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 354{[M+H+]}。

2-(3,5-二甲基-1H-1-吡唑基)-6-(3-氟芐氧基)-1, 3-硫氮雜茚(6h): 白色固體，收率63.36%, m.p.101～103 ℃;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.78(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.38(s, 2H), 7.28～7.15(m, 2H), 7.11(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.05(s, 1H), 6.05(s, 1H), 5.14(s, 2H), 2.77(s, 3H), 2.32(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 164.54, 161.27, 159.39, 155.86, 151.80, 146.14, 142.12, 139.26(d,J=7.3 Hz), 134.07, 130.08(dd,J=8.7 Hz, 3.9 Hz), 123.04～122.13(m), 115.33, 115.13(d,J=28.9 Hz), 114.66, 114.27, 113.98, 109.94, 105.65, 69.72, 13.71, 13.51; IRν: 1604.77(C=N), 1597.77(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 354{[M+H+]}。

2-(3,5-二甲基-1H-1-吡唑基)-6-(4-氟芐氧基)-1,3-硫氮雜茚(6i): 白色固體，收率72.10%, m.p.97～99 ℃;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.77(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.45(dd,J=8.4 Hz, 5.5 Hz, 2H), 7.38(d,J=2.5 Hz, 1H), 7.22～7.04(m, 3H), 6.05(s, 1H), 5.10(s, 2H), 2.77(s, 3H), 2.32(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 164.09, 160.82, 159.34, 155.99, 151.79, 146.06, 142.11, 134.05, 132.40, 129.27(d,J=8.1 Hz), 122.81, 115.47(d,J=14.5 Hz), 109.95, 105.59, 69.89, 13.72, 13.52; IRν: 1604.77(C=N); 1573.91(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 354{[M+H+]}。

2-(3,5-二甲基-1H-1-吡唑基)-6-(2-氯芐氧基)-1,3-硫氮雜茚(6j): 白色固體，收率52.52%, m.p.108～110 ℃;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.79(dd,J=8.8 Hz, 2.6 Hz, 1H), 7.67～7.58(m, 1H), 7.49～7.39(m, 2H), 7.32(dd,J=6.3 Hz, 3.1 Hz, 2H), 7.21～7.10(m, 1H), 6.05(s, 1H), 5.25(s, 2H), 2.77(s, 3H), 2.33(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 159.41, 155.89, 151.78, 146.17, 142.12, 134.24(d,J=22.1 Hz), 132.56, 129.32, 129.13～129.04(m), 128.85(d,J=21.1 Hz), 126.89, 122.83, 115.30, 109.93, 105.77, 67.74, 13.73, 13.53; IRν: 1602.82(C=N), 1573.91(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 370{[M+H+]}。

2-(3,5-二甲基-1H-1-吡唑基)-6-(3-氯芐氧基)-1, 3-硫氮雜茚(6k): 白色固體，收率78.96%, m.p.112～114 ℃;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.86～7.73(m, 1H), 7.56～7.47(m, 1H), 7.46～7.30(m, 4H), 7.18～7.05(m, 1H), 6.06(s, 1H), 5.13(s, 2H), 2.78(s, 3H), 2.33(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 159.52, 155.95, 151.92, 146.27, 142.24, 138.83, 134.57, 134.18, 129.91, 128.20, 127.45, 125.38, 122.96, 115.42, 110.08, 105.75, 69.80, 13.86, 13.66; IRν: 1602.85(C=N), 1573.91(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 370{[M+H+]}。

2-(3,5-二甲基-1H-1-吡唑基)-6-(4-氯芐氧基)-1,3-硫氮雜茚(6l): 白色固體，收率70.62%, m.p.110～112 ℃;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.77(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.42(d,J=9.8 Hz, 4H), 7.37(d,J=2.5 Hz, 1H), 7.10(dd,J=8.9 Hz, 2.5 Hz, 1H), 6.05(s, 1H), 5.11(s, 2H), 2.77(s, 3H3), 2.32(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 159.49, 156.02, 151.93, 146.22, 142.24, 135.25, 134.17, 133.88, 128.81, 122.95, 115.45, 110.09, 105.73, 69.87, 13.86, 13.66; IRν: 1604.77(C=N), 1573.91(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 370{[M+H+]}。

2-(3,5-二甲基-1H-1-吡唑基)-6-(2,6-二氯芐氧基)-1,3-硫氮雜茚(6m): 白色固體，收率52.80%, m.p.128～130 ℃;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.79(dd,J=8.9 Hz, 1.9 Hz, 1H), 7.47(d,J=2.3 Hz, 1H), 7.44～7.24(m, 3H), 7.21～7.11(m, 1H), 6.05(s, 1H), 5.36(s, 2H), 2.78(s, 3H), 2.33(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 159.59, 156.37, 151.87, 146.47, 142.25, 137.07, 134.14, 132.06, 130.77, 130.46, 128.50, 122.91, 115.79, 115.38, 110.01, 106.21, 66.13, 13.76, 13.59. IRν: 1602.85(C=N), 1573.91(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 404{[M+H+]}。

2-(3,5-二甲基-1H-1-吡唑基)-6-(4-三氟甲基芐氧基)-1,3-硫氮雜茚(6n): 白色固體，收率50.12%, m.p.142～144 ℃；1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.79(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.76(s, 1H), 7.67(d,J=7.3 Hz, 1H), 7.62(s, 1H), 7.56(d,J=7.5 Hz, 1H), 7.40(d,J=2.4 Hz, 1H), 7.13(dd,J=9.0 Hz, 2.4 Hz, 1H), 6.05(s, 1H), 5.19(s, 2H), 2.78(s, 3H), 2.33(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 159.57, 155.89, 151.97, 146.34, 142.26, 137.79, 134.19, 131.23, 130.61, 129.11, 127.40, 124.87(dd,J=7.4 Hz, 3.7 Hz), 124.10(dd,J=7.4 Hz, 3.6 Hz), 122.99, 115.38, 110.10, 105.74, 69.82, 13.84, 13.64; IRν: 1604.77(C=N), 1573.91(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 404{[M+H+]}。

2-(3,5-二甲基-1H-1-吡唑基)-6-(4-甲基芐氧基)-1, 3-硫氮雜茚(6o): 白色固體，收率72.52%, m.p.110～112 ℃;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 7.76(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.37(d,J=6.8 Hz, 3H), 7.23(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.11(dd,J=8.8 Hz, 2.2 Hz, 1H), 6.05(s, 1H), 5.10(s, 2H), 2.77(s, 3H), 2.39(s, 3H), 2.32(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 159.34, 156.40, 151.85, 146.04, 142.22, 137.89, 134.15, 133.72, 129.34, 127.70, 122.89, 115.61, 110.03, 105.67, 70.64, 21.26, 13.87, 13.68; IRν: 1606.70(C=N), 1577.77(C=C) cm-1; MS(EI)m/z: 350{[M+H+]}。

1.3 活性測(cè)試

參照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院(NIN)公布的“抗癲癇藥開發(fā)計(jì)劃”[16-17]的相關(guān)試驗(yàn)方法，進(jìn)行了化合物的活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。在抗癲癇新藥實(shí)驗(yàn)篩選模型中，最大電驚厥實(shí)驗(yàn)(MES)一直被認(rèn)為是最有效的重要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭籟18]。因此，本文采用MES模型評(píng)價(jià)了目標(biāo)化合物的抗癲癇活性，用旋轉(zhuǎn)棒法評(píng)價(jià)了化合物的神經(jīng)毒性(Tox)，用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)評(píng)價(jià)了化合物的細(xì)胞毒性。

(1) MES

采用昆明種小鼠，實(shí)驗(yàn)前24 h，以110 V， 50 Hz的交流電，耳電極刺激0.2 s進(jìn)行小鼠篩選，出現(xiàn)后肢強(qiáng)直表現(xiàn)的可以用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用腹腔注射藥物，使用相同的條件進(jìn)行電刺激，不出現(xiàn)后肢強(qiáng)直的為陽性，表明該化合物有抗癲癇作用[19]。

將受試化合物溶于DMSO中，腹腔注射首先選擇300 mg·kg-1劑量，每組選用3只小白鼠，分別在給藥0.5 h和4 h后進(jìn)行抗最大電驚厥活性短時(shí)效和長(zhǎng)時(shí)效評(píng)價(jià)，以及相應(yīng)時(shí)間的神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)。如果某個(gè)化合物在300 mg·kg-1劑量下，3只小鼠在接受測(cè)試化合物后，出現(xiàn)抗MES引起的癲癇現(xiàn)象，并且沒有表現(xiàn)出神經(jīng)毒性，則測(cè)試該化合物在100 mg·kg-1是否表現(xiàn)出抗癲癇活性。

(2) Tox

小鼠腹腔給藥后，將小鼠放置在以6 rpm旋轉(zhuǎn)的直徑為1 inch的波浪形表面的圓柱上，在連續(xù)3次實(shí)驗(yàn)中，每次均能保持1 min平衡而不落下的為神經(jīng)毒性陰性，反之為陽性[20]。

(3) 定量評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)方法

藥理學(xué)定量評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)是依照改良的寇氏法進(jìn)行抗驚厥活性的半數(shù)有效量(ED50)和半數(shù)神經(jīng)毒性(TD50)的計(jì)算，同時(shí)計(jì)算出相應(yīng)的95%可信限[21]。

(4) MTT

待測(cè)化合物使用DMSO助溶，使藥物濃度為20 μmol·L-1。另設(shè)置空白對(duì)照組(只含培養(yǎng)基)和陰性對(duì)照組(即0 μmol·L-1藥物濃度組)。每組均設(shè)有3個(gè)復(fù)孔。使用MTT染色，并根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞存活率[22]。本研究?jī)H使用了MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，針對(duì)其他種類細(xì)胞的毒性有待進(jìn)一步研究。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

目標(biāo)化合物的合成是以對(duì)甲氧基苯胺為起始原料，在液溴的催化下與硫氰酸銨反應(yīng)制得中間體2[23];2與水合肼在酸催化下進(jìn)行肼代反應(yīng)得到肼代物3，而后用乙酰丙酮進(jìn)行環(huán)合引入二甲基吡啶基團(tuán)得到化合物4;4在BBr3的作用下脫去6-位甲氧基上的甲基[24]并裸露酚羥基，然后采用具有不同取代基和取代位置的氯芐進(jìn)行反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物6a～6o。各反應(yīng)步驟均有較好收率。

2.2 活性

(1) 抗癲癇活性和安全性初篩

300 mg·kg-1劑量的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可以看出，化合物6a、6b、6c、6g、6i、6j以及6m在300 mg·kg-1的劑量下，表現(xiàn)出不同程度的抗癲癇作用，且未見神經(jīng)毒性。此外，化合物6m在4 h長(zhǎng)效評(píng)價(jià)中也表現(xiàn)出一定的癲癇作用。因此我們選取這7個(gè)化合物進(jìn)行100 mg·kg-1劑量下的抗癲癇活性測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

(2) 抗癲癇活性和安全性定量評(píng)價(jià)

根據(jù)初篩結(jié)果，選擇在100 mg·kg-1劑量下表現(xiàn)出活性的化合物6a、6b、6g和6m進(jìn)行定量藥理活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，以臨床常見藥物丙戊酸鈉作為對(duì)照藥物，測(cè)定其抗最大電驚厥實(shí)驗(yàn)的半數(shù)有效量ED50和半數(shù)神經(jīng)中毒劑量TD50，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可以看出，這四個(gè)化合物均表現(xiàn)與對(duì)照藥物相近甚至優(yōu)于丙戊酸鈉的活性，其中出化合物6g的活性相對(duì)較好，且毒性較低，保護(hù)指數(shù)為2.74，安全性優(yōu)于對(duì)照藥物丙戊酸鈉。

表1 抗癲癇活性篩選(300 mg·kg-1劑量)

a抗最大電驚厥試驗(yàn);b旋轉(zhuǎn)棒法神經(jīng)毒性實(shí)驗(yàn);c給藥與測(cè)試間隔時(shí)間;d陽性結(jié)果小鼠數(shù)目/被測(cè)小鼠數(shù)目。

表2 抗癲癇活性篩選(100 mg·kg-1劑量)

表3 抗癲癇活性定量評(píng)價(jià)

e半數(shù)有效量;f半數(shù)神經(jīng)毒性劑量;gPI=保護(hù)指數(shù)(TD50/ED50);h95%置信區(qū)間;i丙戊酸鈉。

(3) 細(xì)胞毒性

由臨床數(shù)據(jù)可知，抗癲癇藥物的治療窗一般較窄，因此在治療濃度下對(duì)細(xì)胞的毒性可以從用藥角度評(píng)價(jià)藥物的安全性。因此我們用MTT法對(duì)所得活性較好的化合物6g進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，結(jié)果見表4。由表4可知，被測(cè)化合物的給藥后細(xì)胞存活率超過85%，因此該系列化合物在細(xì)胞層面的安全性較高。

表4 細(xì)胞存活率

(4) 構(gòu)效關(guān)系

對(duì)于合成的目標(biāo)化合物活性評(píng)價(jià)的結(jié)果顯示，合成的二甲基吡啶聯(lián)1,3-硫氮雜茚系列化合物中，部分化合物表現(xiàn)出了較好的抗癲癇活性。其中在脂肪鏈取代的化合物中，6a和6b在0.5 h時(shí)表現(xiàn)出了一定的短時(shí)效抗驚厥活性，該活性在無取代基和甲基取代的化合物5和4中未發(fā)現(xiàn)，并且隨著碳鏈長(zhǎng)度的增加，活性消失，且即使增加到了8個(gè)碳取代，活性也未再出現(xiàn)。在不同取代的芳香性的芐基取代系列化合物中，鄰氟芐基取代的化合物6g和2,6-位二氯芐基取代的化合物6m在0.5 h給藥間隔表現(xiàn)出了一定的短時(shí)效抗癲癇活性，而該當(dāng)取代基的位置和取代基團(tuán)發(fā)生變化時(shí)活性消失，并且吸電子基取代的化合物活性好于推電子基團(tuán)。最大電驚厥定量評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，化合物6g的活性和保護(hù)指數(shù)均優(yōu)于對(duì)照藥物，而后的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，所有化合物表現(xiàn)出了較低的細(xì)胞毒性,。

本文以對(duì)甲氧基苯胺為起始原料，經(jīng)過一系列反應(yīng)合成得到17個(gè)3,5-二甲基取代吡唑-6-取代-1,3-硫氮雜茚系列化合物，并測(cè)試其抗電驚厥活性、神經(jīng)毒性以及細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，鄰氟芐基取代的化合物6g，活性和保護(hù)指數(shù)均優(yōu)于丙戊酸鈉，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中該化合物也未見明顯毒性。因此可以考慮作為潛在的抗癲劑或先導(dǎo)物進(jìn)行進(jìn)一步研究。