朱曉琳，趙海燕，楊吉林

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年重癥監(jiān)護病房 昆明 650032

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一種病情兇險、并發(fā)癥多、病死率較高的急腹癥，其中急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是SAP最常見的并發(fā)癥[1]。SAP與急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)有關(guān)，而ARDS是肺損傷的終末結(jié)局之一[2]。因此，早期防治ALI對于SAP的治療具有重要意義。黃芩素是黃芩的主要有效成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌、抑制胰蛋白酶活性等多種藥理作用[3]。有研究[4]表明，黃芩素對LPS、腸缺血再灌注等引起的肺損傷具有保護作用。有研究[5]顯示，黃芩素可明顯減少SAP大鼠腹水量，抑制炎癥反應(yīng)，改善胰腺病變，從而提高SAP大鼠生存率。本研究旨在探討黃芩素對SAP大鼠炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、肺組織細胞凋亡的影響，并探討可能的分子機制，為SAP的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器黃芩素購自上海麥克林生化科技有限公司，使用時用生理鹽水稀釋。牛磺膽酸鈉購自美國Sigma公司；MDA試劑盒、SOD試劑盒、考馬斯亮藍蛋白濃度測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；IL-6及TNF-α試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Clontech公司； Bcl-2、Bax和磷酸化p38 MAPK(p-p38MAPK)、GAPDH抗體均購自美國CST公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司。

1.2動物分組及處理SPF級SD大鼠60只，體重250～300 g，雌雄不限，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)溫度15～25 ℃，相對濕度45%～55%，保持環(huán)境清潔。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，術(shù)前12 h禁食，自由飲水。采用隨機數(shù)字表法分為3組，每組20只，每組又分為12、24 h兩個亞組(n=10)。假手術(shù)組：水合氯醛腹腔注射麻醉，僅翻動胰腺、翻轉(zhuǎn)腸管5 min后關(guān)腹，術(shù)后5 min尾靜脈注射DMSO 1 mL/kg。SAP組：采用?；悄懰徕c法[6]建立SAP模型，術(shù)后5 min尾靜脈注射DMSO 1 mL/kg。SAP+黃芩素組：制備SAP模型，術(shù)后5 min尾靜脈注射10 g/L的黃芩素(2 mL/kg)[7]。12 h后SAP+黃芩素組再次給予相同劑量黃芩素，假手術(shù)組和SAP組給予等體積生理鹽水。大鼠清醒后自由飲水，禁食。

1.3標本采集12、24 h后水合氯醛腹腔注射麻醉，開腹，心臟采血后處死大鼠。血清用于IL-6、TNF-α和淀粉酶檢測。處死大鼠后立即取雙側(cè)肺臟，用于SOD活性、MDA含量、肺組織細胞凋亡指數(shù)及Bcl-2、Bax、p-p38MAPK蛋白表達的檢測。

1.4血清IL-6、TNF-α、淀粉酶和肺組織MDA含量、SOD活性檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法。取大鼠血清，參照IL-6和TNF-α試劑盒說明書分別檢測血清中IL-6和TNF-α水平。血清淀粉酶檢測使用美國Beckman全自動生化分析儀完成。大鼠肺組織采用勻漿器研磨后，3 500 r/min離心10 min，保留上清液，參照MDA和SOD試劑盒說明書分別檢測肺組織中MDA含量和SOD活性。

1.5肺組織細胞凋亡的TUNEL法檢測取大鼠肺臟，經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋制備組織切片。二甲苯脫蠟、梯度乙醇洗脫后，PBS沖洗。體積分數(shù)0.3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原。滴加25 μL TUNEL反應(yīng)液，37 ℃孵育60 min，PBS沖洗3次，每次3 min。滴加25 μL 辣根過氧化物酶抗體，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次3 min。滴加DAB顯色液，室溫孵育10 min。PBS沖洗3次，每次3 min。經(jīng)蘇木精復(fù)染、乙醇脫水、干燥后中性樹脂封片。凋亡細胞的細胞核為棕色。選取5個400倍視野，對陽性細胞和總細胞進行計數(shù)。細胞凋亡指數(shù)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.6肺組織中Bcl-2、Bax和p-p38MAPK 蛋白表達的Western blot法檢測RIPA裂解液提取大鼠肺組織中總蛋白，Bradford法測定總蛋白濃度。將總蛋白與上樣緩沖液混勻，煮沸變性5 min。每孔上樣量50 μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳、電轉(zhuǎn)至PVDF膜及50 g/L脫脂奶粉液封閉后，加1∶1 000稀釋的Bcl-2、Bax和p-p38MAPK抗體，4 ℃孵育過夜，加1∶2 000稀釋的HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光顯色，拍照。采用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白相對表達量=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析。不同組間淀粉酶含量、IL-6和TNF-α水平、MDA含量、SOD活性、細胞凋亡指數(shù)及Bcl-2、Bax和p-p38MAPK蛋白相對表達量的比較均采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1血清淀粉酶、IL-6和TNF-α水平檢測結(jié)果見表1。由表1可知， SAP組術(shù)后12、24 h血清淀粉酶、IL-6和TNF-α水平均高于假手術(shù)組，SAP+黃芩素組各指標均低于SAP組。與12 h比較，24 h時血清淀粉酶升高，IL-6和TNF-α水平降低。

表1 3組大鼠血清淀粉酶含量、IL-6和TNF-α水平比較(n=10)

2.2肺組織MDA含量、SOD活性和細胞凋亡指數(shù)檢測結(jié)果見表2。由表2可知，SAP組術(shù)后12、24 h肺組織MDA含量、細胞凋亡指數(shù)高于假手術(shù)組，SOD活性低于假手術(shù)組；而SAP+黃芩素組MDA含量、細胞凋亡指數(shù)低于SAP組，SOD活性高于SAP組。與12 h比較，24 h時SAP組、SAP+黃芩素組肺組織MDA含量、細胞凋亡指數(shù)升高，SOD活性降低。

表2 3組大鼠肺組織MDA含量、SOD活性及細胞凋亡指數(shù)比較n=10)

2.3肺組織Bcl-2、Bax和p-p38MAPK蛋白表達檢測結(jié)果見圖1和表3。由圖1和表3可知，SAP組術(shù)后12、24 h肺組織Bcl-2表達低于假手術(shù)組，Bax和p-p38MAPK表達高于假手術(shù)組；而SAP+黃芩素組Bcl-2表達高于SAP組，Bax和p-p38MAPK表達低于SAP組。與12 h比較，24 h時SAP組、SAP+黃芩素組肺組織Bcl-2表達降低，Bax、p-p38MAPK表達升高。

3 討論

ALI發(fā)病機制復(fù)雜，與炎癥因子過度表達、氧化損傷、胰蛋白酶異常激活和釋放等有關(guān)[8]。TNF-α是SAP時最早升高的細胞因子之一，可增加肺毛細血管通透性，而肺毛細血管通透性增加是ARDS的一個重要特征[9]。IL-6主要由單核細胞在內(nèi)毒素、TNF-α等誘導(dǎo)下產(chǎn)生。研究[10]顯示，SAP患者血清中TNF-α和IL-6水平明顯升高，治療后血清TNF-α和IL-6水平降低。本研究結(jié)果顯示，SAP組大鼠血清IL-6和TNF-α水平升高，而黃芩素可降低IL-6和TNF-α水平，提示黃芩素可降低SAP大鼠的炎癥反應(yīng)。

A:12 h；B:24 h

表3 3組大鼠肺組織中Bcl-2、Bax和p-p38MAPK蛋白相對表達量的比較(n=10)

SAP發(fā)病后機體促炎細胞因子的表達也與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)[11]。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，可間接反映肺組織過氧化反應(yīng)的程度。SOD是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，對機體起保護作用，其活性可反映機體對氧自由基的清除能力[12]。有研究[7]顯示，黃芩素可通過降低大鼠心肌組織中MDA含量、提高SOD活力延緩大鼠心肌衰老。本研究結(jié)果顯示，黃芩素可降低SAP大鼠肺組織MDA含量，提高SOD活性，提示黃芩素可通過抑制SAP大鼠肺組織氧化應(yīng)激保護肺組織。

p38MAPK是細胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個主要通路，參與細胞凋亡、炎癥反應(yīng)等過程[13]。p38MAPK信號通路對細胞凋亡的影響與下游凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達有關(guān)。Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白。有研究[14]顯示，在SAP發(fā)生時，胰腺組織中Bcl-2表達降低，Bax表達升高。本研究結(jié)果顯示，黃芩素可降低SAP大鼠肺組織細胞凋亡指數(shù)，下調(diào)肺組織中p-p38MAPK和Bax表達，上調(diào)Bcl-2表達，提示黃芩素可能通過抑制p38MAPK信號通路，減少SAP大鼠肺組織細胞凋亡，進而保護SAP大鼠肺組織。

綜上所述，黃芩素可減弱SAP大鼠炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、肺組織細胞凋亡，從而對肺組織起保護作用，機制可能與抑制p38MAPK信號通路有關(guān)。