江梅花，陳先俠

早在20世紀(jì)70年代染色體G顯帶核型分析就已成為檢測胎兒染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)[1]，可以檢測3～10 Mb的大量非整倍體的重復(fù)、缺失及結(jié)構(gòu)重排[2]，但細(xì)胞培養(yǎng)周期長(10～14 d)、制片過程復(fù)雜,并且對結(jié)果的解讀多依賴于主觀經(jīng)驗[3]，不能發(fā)現(xiàn)亞顯微的缺失和重復(fù)。隨著染色體分析技術(shù)的發(fā)展，1969年P(guān)ardue和Gall[4]提出熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization, FISH),其不需要細(xì)胞培養(yǎng)，能快速檢測和定位染色體特定DNA序列的插入或缺失，是細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的第一次融合，為產(chǎn)前診斷學(xué)的發(fā)展提供了強大動力。然而，F(xiàn)ISH只針對特定的染色體區(qū)域，一次只能檢測一個染色體位點(如微缺失綜合征)或多個候選染色體位點(如亞端粒區(qū)域)。多重連接探針擴增、定量熒光PCR 和細(xì)菌人工染色體微珠技術(shù)的引入彌補了FISH技術(shù)的不足，可以快速檢測更多位點的染色體非整倍體和基因的微缺失、微重復(fù)，大大縮短了產(chǎn)前診斷的時間，同時也提高了染色體不平衡的檢出率，但遺憾的是只能檢測某一區(qū)域的基因序列，不能在全基因組范圍內(nèi)檢測染色體的不平衡。

染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis, CMA)可檢測全基因組的微缺失和微重復(fù)而應(yīng)用于臨床，主要作為對患有多種先天性異常、發(fā)育遲緩、智力殘疾和自閉癥譜系障礙的兒童進行出生后細(xì)胞遺傳學(xué)初步評估的第一層測試[5]，因其具有高通量、自動化程序高、分辨率高等優(yōu)點，自2008年起CMA開始從“產(chǎn)后”走向“產(chǎn)前”[6]。前瞻性隊列研究表明，在核型分析結(jié)果正常而超聲提示結(jié)構(gòu)異常和其他存在高危指征的孕婦中，CMA能夠分別額外發(fā)現(xiàn)6%和1.7%的臨床相關(guān)拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNVs)[7]，故2013年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師大會和母胎醫(yī)學(xué)學(xué)會建議將CMA作為對有重大結(jié)構(gòu)異常的胎兒進行細(xì)胞遺傳學(xué)評估的第一層測試[8]。最新指南推薦，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胎兒畸形或頸項透明層(nuchal translucency, NT)≥3.5 mm時，應(yīng)在快速非整倍體檢測后實施CMA，但后續(xù)結(jié)果需要由CMA專業(yè)人員給予遺傳咨詢[9]。

1 CMA概述

CMA也稱分子核型分析技術(shù)，通過檢測DNA的CNVs來診斷染色體異常。根據(jù)探針的設(shè)計原理不同，CMA分為比較基因組雜交微陣列(comparative genomic hybridization array, aCGH)和單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide polymorphism arrays， SNP arrays)。

aCGH最初應(yīng)用于癌癥領(lǐng)域[10]，即將患者和對照樣本的DNA進行不同的熒光標(biāo)記，并與芯片上的互補探針雜交，再利用熒光染料不同顏色的強度繪圖，通過患者與對照樣本的DNA異常比率顯示CNVs。通過差異雜交信號aCGH可以檢測整個基因組中3～10 Mb分辨率的不平衡染色體重排[3]，但因分辨率低和技術(shù)挑戰(zhàn)限制了臨床推廣。2006年Rickman等[11]用目標(biāo)DNA代替中期染色體，用金屬針或毛細(xì)玻璃管代替普通玻片，成功地在未培養(yǎng)的羊膜細(xì)胞上進行了aCGH研究，簡化了分析過程且縮短了周轉(zhuǎn)時間，進而顯著提高了分辨率。不同的aCGH分辨率取決于DNA探針的間距和長度，靶向微陣列主要用于檢測非整倍體、特征良好的微缺失和(或)微重復(fù)綜合征、亞端?；蚱渌黄胶馊旧w重排，以提高具有可變表型或外顯率的不確定臨床意義的變異(variant of uncertain significance， VOUS)或拷貝數(shù)變異(copy number variation， CNV)的檢測率。然而，aCGH可能會在缺乏探針覆蓋的基因組區(qū)域內(nèi)錯過潛在的具有重大臨床意義的CNV。此外，少量芯片為全基因組aCGH，因其探針可覆蓋整個基因組，因此能夠檢測出高分辨率的CNVs，同時VOUS的檢出率也大大增加，臨床使用時要考慮CMA平臺及其局限性。

SNP arrays主要使用由短序列(25～60 bp)核苷酸組成的單核苷酸探針，通過確定數(shù)百萬多態(tài)位點的基因型以識別缺失或重復(fù)的DNA片段。與aCGH相比，SNP arrays不需要參考樣本即可確定個體間高度多態(tài)基因組特定區(qū)域的基因型，通過評估陣列上的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism， SNP)等位基因模式，進而識別aCGH不能檢測到的三倍體。此外，SNP還可以額外檢測單親二倍體(ulrich's periodicals directory, UPD)、嵌合體、合子、母系細(xì)胞污染和親緣關(guān)系[12]。目前SNP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于先天性異常、認(rèn)知缺陷、發(fā)育延遲、生長異常或行為異常的臨床評估[13]。

2 CMA在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

2.1CMA在超聲檢查為異常胎兒中的診斷 隨著社會的發(fā)展，人們認(rèn)識到胎兒結(jié)構(gòu)異常與基因組失衡之間存在著密切的關(guān)聯(lián)性，特別是與唐氏綜合征、愛德華綜合征和帕托綜合征相關(guān)的結(jié)構(gòu)異常。與核型分析相比，產(chǎn)前檢查發(fā)現(xiàn)胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常時，CMA診斷常見非整倍體染色體異常的準(zhǔn)確率可達100%[14]。有研究指出，與CMA異常最密切相關(guān)的器官及系統(tǒng)主要包括心臟、腎臟、骨骼、泌尿生殖系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。國外研究表明，66.7%的心臟缺損患者為CNVs，而非22q11.2缺失[15-17]。此外，超聲檢查結(jié)果提示胎兒心臟結(jié)構(gòu)異常時，常使用FISH檢測其是否存在22q11.2缺失，往往忽略了超過2/3的基因組異常。因此，對于特定的心臟結(jié)構(gòu)異常，F(xiàn)ISH檢測的診斷率可能會大大降低[16]。有數(shù)據(jù)表明，CMA對心臟結(jié)構(gòu)異常和腎臟分離的診斷率較核型分析相比分別增加了10.6%和15.0%，診斷率位于胎兒單器官畸形診斷第一位[17]。最新一項研究證實,CMA對最常見的先天性心臟缺損(如室間隔缺損)的CMA致病性CNV檢出率明顯高于核型分析，且對孤立的心流出道異常檢出率(36.1%)顯著高于非孤立型(1.3%)[18]。Sun等[19]采用SNP arrays分析技術(shù)檢測到胎兒在4q35.2處出現(xiàn)0.72 Mb重復(fù)，與癲癇和心臟異常有關(guān)，同時在PARK 2基因的6q26處發(fā)現(xiàn)了0.13 Mb的缺失，且與常染色體隱性遺傳病(如青少年帕金森病)有關(guān)。國外研究表明，由UPD導(dǎo)致的部分腎臟疾病(如貝克德-威德曼綜合征和羅素-銀綜合征)可以表現(xiàn)為特殊的超聲結(jié)構(gòu)異常，此種情況只能由SNP arrays分析技術(shù)加以證實[20-21]。Borrell等[22]對CMA和核型分析在胎兒生長受限中的診斷率進行了系統(tǒng)回顧和meta分析，數(shù)據(jù)顯示，在非畸形和畸形的胎兒生長受限中，CMA較核型分析診斷率分別增加了4%和10%，最常見的致病性CNV為22q11.2型。

此外，涉及臨床顯著基因組區(qū)域的微缺失和微復(fù)制也與特定的遺傳綜合征有關(guān)，如77%的DiGeorge綜合征患兒是由于22號染色體近端長臂區(qū)的亞顯微缺失[23]、Miller Dieker綜合征為17號染色體短臂末端微缺失導(dǎo)致大腦皮層發(fā)育不足或發(fā)育不良、包含HNF1B基因的17q12微缺失與腎囊腫和糖尿病綜合征有關(guān)[20-21]。Srebniak等[24]通過SNP arrays分析技術(shù)對1033例超聲異常的胎兒進行研究，結(jié)果表明，約5.5%的患兒具有致病性CNV，其中58%與病因有關(guān)，35%為神經(jīng)發(fā)育障礙相關(guān)疾病，6%為意外發(fā)現(xiàn)的早發(fā)型疾病，建議孕婦將SNP arrays分析技術(shù)作為胎兒超聲檢查異常的第一層測試。

2.2CMA在核型分析及超聲檢查為正常胎兒中的診斷 在超聲檢查和核型分析正常的孕婦中，CMA能夠檢測出額外的非整倍染色體發(fā)生風(fēng)險，如亞顯微畸變導(dǎo)致的早發(fā)性疾病、攜帶神經(jīng)發(fā)育障礙易感位點及晚發(fā)性疾病[25]。Srebniak等[24]回顧10 614例核型分析正常的父母親的臨床資料，采用meta分析評估CMA技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.84%的高齡產(chǎn)婦(advanced maternal age, AMA)和有焦慮情緒的父母親出現(xiàn)了具有臨床意義的致病性CNV，且36歲以下的產(chǎn)婦患有致病性CNV的風(fēng)險高于唐氏綜合征的發(fā)生風(fēng)險(1∶180)。Li等[26]對72例NT>5 mm的孕婦進行研究，并在核型分析正常的情況下進行CMA，結(jié)果顯示，染色體缺陷胎兒12例，其中致病性CNVs 5例。目前NT測量在我國早已普及，當(dāng)NT異常時，孕婦會選擇無創(chuàng)DNA或核型分析，CMA雖然能夠識別超聲檢查和核型分析未能檢測出的染色體異常，但在AMA或早孕篩查異常的孕婦中暫未普及，其中最主要的原因是部分CNVs(如16p11.2微缺失)臨床暫時難以確定其基因型-表型相關(guān)性，但是伴隨時間的推移、遺傳學(xué)相關(guān)知識的不斷更新、共享數(shù)據(jù)庫內(nèi)容的擴充及與疾病有明確關(guān)聯(lián)性的基因組數(shù)量不斷地增加，終將使VOUS的發(fā)生率不斷降低，如最初美國兒童健康與人類生長發(fā)育研究所發(fā)現(xiàn)的致病性CNV和VOUS的發(fā)病率分別為0.9%和2.5%，而根據(jù)最新的研究結(jié)果及全球數(shù)據(jù)知識共享，發(fā)現(xiàn)致病性CNV的發(fā)病率增加到1.8%，VOUS的發(fā)生率減少到0.9%[27]。

2.3CMA在流產(chǎn)組織中的應(yīng)用 妊娠丟失是一個常見的生殖問題，臨床15%～20%的妊娠以自然流產(chǎn)告終，并且約1%的女性經(jīng)歷過多次流產(chǎn)[28]。Zachariah等[29]研究報道，流產(chǎn)病因分析對女性未來的生育計劃和未來妊娠的產(chǎn)前護理有重大影響。當(dāng)?shù)谝淮稳焉镆粤鳟a(chǎn)告終，再次妊娠的圍產(chǎn)期不良結(jié)局(如胎膜早破、早產(chǎn)、胎兒生長受限、子癇前期和剖宮產(chǎn))的發(fā)生風(fēng)險會增加。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)孕20周之前發(fā)生自然流產(chǎn)的女性中約50%是由染色體異常引起，主要表現(xiàn)為染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常，其中結(jié)構(gòu)畸變和嵌合體發(fā)生率則較低[17]。22q11.21和1p36.33缺失為最常見的致病性CNV[30]。傳統(tǒng)的核型分析需要先對新鮮的流產(chǎn)組織細(xì)胞進行培養(yǎng)，因培養(yǎng)周期長、失敗率高和母體細(xì)胞易污染等問題導(dǎo)致假陰性率較高。CMA具有較高的自動化程序和診斷率，并且對標(biāo)本的要求較低(無需新鮮的流產(chǎn)組織)，一方面可檢測非整倍染色體和更大的結(jié)構(gòu)變化，另一方面還能發(fā)現(xiàn)嵌合體及流產(chǎn)組織中微妙的染色體失衡，在流產(chǎn)組織分析中具有廣闊的應(yīng)用前景。Sahoo等[31]對8118例流產(chǎn)組織進行了CMA，結(jié)果顯示，CMA對新鮮標(biāo)本的診斷率達94.2%，對非新鮮標(biāo)本的診斷率達86.4%，可最大限度地提高敏感度，減少假陰性。有研究顯示，CMA對早期自然流產(chǎn)組織的診斷率明顯高于常規(guī)核型分析，并且CMA還能檢測出與臨床相關(guān)的遺傳信息[30]。

2.4CMA在著床前遺傳診斷(preimplantation genetic diagnosis, PGD)和植入前基因篩查(preimplantation genetic screening, PGS)中的應(yīng)用 目前PGD主要用于單基因遺傳疾病攜帶者(顯性和隱性、常染色體或X連鎖)和結(jié)構(gòu)染色體異常攜帶者的診斷；PGS主要用于輔助生殖治療，通過移植整倍體胚胎來提高妊娠成功率。在PGS應(yīng)用過程中，由于CMA不存在組織培養(yǎng)失敗、人為因素等問題，加之周轉(zhuǎn)時間較快，已逐漸取代FISH[32]。PGS聯(lián)合CMA除了能識別一般的染色體異常，還能識別復(fù)雜染色體重排。Frumkin等[33]對1例核型分析證實胎兒染色體正常的父母親進行分析，經(jīng)CMA檢測發(fā)現(xiàn)父親染色體出現(xiàn)46，XY，t(3；7；9)(q23；q22；q22)復(fù)雜易位，提示臨床可通過PGD聯(lián)合CMA選擇性移植1個染色體正常的胚胎，進而得到1個健康的嬰兒。

與FISH和aCGH相比，SNP arrays分析技術(shù)可以同時生成與整個染色體相關(guān)的定性(基因型)和定量(基因拷貝數(shù))數(shù)據(jù)，并且已經(jīng)應(yīng)用于植入前胚胎胚卵裂球和囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的遺傳學(xué)分析，主要用于檢測46條染色體的非整倍體。Yao等[34]通過SNP arrays分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)從不正常受精卵或質(zhì)量不佳的受精卵中提取的人類胚胎可以發(fā)育為囊胚，為將來胚胎的研究和臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

3 CMA的優(yōu)勢與局限性

與傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)診斷相比，CMA的優(yōu)勢如下：①可以分析更廣泛地組織類型，不需要進行組織培養(yǎng)，可對從未培養(yǎng)的絨毛、羊水、胎兒組織和血液中提取的DNA進行CMA，包括保存的標(biāo)本和石蠟切片[32]；②可以檢測到分辨率為0.05～0.1 Mb的亞顯微缺失和重復(fù)，而核型分析常識別分辨率為3～10 Mb的染色體改變[35]；③可以根據(jù)研究目的定制特異性平臺；④屬于客觀評價而非主觀評價；⑤數(shù)據(jù)結(jié)果與基因組數(shù)據(jù)庫相兼容；⑥易于自動化，從而使周轉(zhuǎn)時間更快，降低故障率，具有更高的成本效益分析[33]。

與其他技術(shù)一樣，CMA也存在局限性：①不能識別平衡易位(倒數(shù)和羅伯遜)和倒置；②不能檢測小于10%低水平的嵌合體[35]；③可能漏掉四倍體和(或)三倍體；④易遺漏在平臺覆蓋范圍之外的CNV；⑤不能發(fā)現(xiàn)點突變、基因表達和甲基化異常；⑥負(fù)陣列并不能100%排除由個體突變和其他基因組原因所造成的疾病[32]；⑦若發(fā)現(xiàn)VOUS，在遺傳咨詢過程中可能會引起臨床醫(yī)師的困惑和父母親焦慮。然而，相信在不久的將來，由于共享臨床數(shù)據(jù)庫收集的相關(guān)信息，將會使得先前不確定的發(fā)現(xiàn)被重新歸類為良性或致病性范疇，VOUS的發(fā)生率亦會不斷降低。

4 產(chǎn)前咨詢與結(jié)果解讀

產(chǎn)前咨詢是為了讓患者更好地了解各種檢測方法的優(yōu)點及其局限性，從而根據(jù)自身需求做出選擇。在絨毛膜采取、羊膜穿刺術(shù)后或PGS聯(lián)合絨毛膜采取時，均建議由遺傳學(xué)顧問、遺傳學(xué)專家或在遺傳咨詢方面具有專業(yè)知識的醫(yī)療保健提供者給予咨詢[36]。最新指南將CNVs解釋為致病、可能致病、不確定、可能是良性[37]。CNVs的醫(yī)學(xué)相關(guān)性與基因微缺失、基因復(fù)制功能有關(guān)，當(dāng)失衡區(qū)域發(fā)生于關(guān)鍵基因或重要的調(diào)控區(qū)域時，可能產(chǎn)生表型效應(yīng)。對于某些罕見的染色體畸變(14Q部分三體)或不確定意義的CNVs，因其需要對大量病例進行全面分析，故難以建立基因型-表型相關(guān)性，從而給臨床醫(yī)師向患者提供適當(dāng)咨詢方面增加了負(fù)擔(dān)[38]。此外，最新指南建議對于CMA結(jié)果的解讀可以借鑒文獻和公開數(shù)據(jù)庫中的結(jié)果，包括基因組變異數(shù)據(jù)庫、解密數(shù)據(jù)庫、國際細(xì)胞基因組陣列標(biāo)準(zhǔn)和人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫等。

5 展望

與常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷相比，CMA在分辨率、成本效益、自動化程序等方面展現(xiàn)了其獨特的優(yōu)勢，也逐漸應(yīng)用于臨床各個領(lǐng)域。雖然在臨床應(yīng)用時可能會存在VOUS,但隨著技術(shù)的不斷提高、CMA平臺的日漸成熟及更多大規(guī)模前瞻性隊列研究，CNV數(shù)據(jù)庫終將不斷完善，更多染色體疾病的基因型-表型關(guān)系將會闡明，逐漸解決臨床醫(yī)師所面臨的困難，相信CMA在未來產(chǎn)前診斷領(lǐng)域?qū)⒄宫F(xiàn)更大的應(yīng)用價值。