孫培鳴，王 麗，孫宏偉，楊建武，趙曉波，張 瑾，楊鶴鳴＊，崔 彥

（1.戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心 普通外科，北京 100101；2.中日友好醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，北京 100029；3.清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，北京 100016；4.戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心 病理科，北京 100101）

笑氣，即一氧化二氮（nitrous oxide，N2O），是室溫下無色、稍帶甜味的氣體。笑氣有輕微的麻醉作用，吸入后可使人喪失痛覺，感到欣快、發(fā)笑，甚至產(chǎn)生幻覺。臨床上笑氣常用作吸入性鎮(zhèn)痛麻醉藥物，較廣泛用于外科、婦產(chǎn)科及口腔科等[1，2]。近年來，笑氣在娛樂場所濫用[1～3]。目前國內(nèi)外對(duì)笑氣濫用危害的報(bào)道多集中于神經(jīng)損傷領(lǐng)域，對(duì)肝臟毒副作用的研究未見相關(guān)報(bào)道。但在臨床診療中我們發(fā)現(xiàn)部分患者的肝臟轉(zhuǎn)氨酶明顯增高，提示笑氣有導(dǎo)致肝功能損傷的可能。本研究擬探討長期笑氣吸入對(duì)大鼠肝臟功能、細(xì)胞凋亡及組織學(xué)特點(diǎn)的影響，從而提高對(duì)笑氣濫用危害的認(rèn)識(shí)，并為其防治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年（8 周齡）Wistar 雄性大鼠10 只，體重200～250g，購買自北京華阜生物科技有限公司，飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（SPF 級(jí)），自由進(jìn)食水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中日友好醫(yī)院研究倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究管理規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器

醫(yī)用氧氣及N2O （北京普萊克斯實(shí)用氣體有限公司），一步法TUNEL 細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒（KGA7073，凱基生物），小動(dòng)物氧濃度控制系統(tǒng)（動(dòng)物染毒箱，上海玉研科學(xué)儀器有限公司）、倒置熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)（Ci-S/ DS-U3，日本尼康公司）、全自動(dòng)生化分析儀（7180，日本日立公司）、正置顯微鏡BX51 及攝像頭DP72 （日本Olympus公司）。

1.3 動(dòng)物分組及笑氣吸入實(shí)驗(yàn)

將Wistar 大鼠隨機(jī)分為2 組：笑氣暴露組及吸氧對(duì)照組，每組5 只，置于動(dòng)物染毒箱內(nèi)。笑氣暴露組暴露在N2O 和O2（1：1）混合氣體中，吸氧對(duì)照組暴露在氧氣中，氧濃度控制在50%。2 組氣流速度均為1.5L/min，吸入時(shí)間120min/d，連續(xù)60d。

1.4 大鼠肝功能檢測

笑氣連續(xù)吸入60d 后，自大鼠股靜脈采集血液約2ml，離心10min（3000r/min），留取血清。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的水平，分析比較2 組大鼠肝功能變化。

1.5 大鼠肝細(xì)胞凋亡檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，選取肝臟左外葉組織，大小約1.5cm×1cm×0.2cm。采用TUNEL 細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒檢測大鼠肝細(xì)胞凋亡。肝臟組織常規(guī)石蠟包埋、切片后，按照試劑盒步驟進(jìn)行TUNEL 檢測。然后利用倒置熒光顯微鏡觀察并在200 倍視野下采集圖像。利用ImageJ 軟件，統(tǒng)計(jì)視野下細(xì)胞亮綠色光的光密度（IOD=IntDen/Area），每張切片統(tǒng)計(jì)3 個(gè)視野。比較分析2 組間肝細(xì)胞凋亡的差異。

1.6 大鼠肝臟組織學(xué)觀察

常規(guī)石蠟包埋切片后HE 染色。利用正置顯微鏡觀察肝臟的組織學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采集圖像并比較分析2 組的差異。

圖1 2 組大鼠肝功能檢測結(jié)果的比較（n=5）

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，做圖軟件采用Graphpad Prism 5。計(jì)量資料以±s 表示，2 組間比較采用t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝功能的改變

大鼠肝功能檢測表明笑氣暴露組ALT、AST的水平均高于吸氧對(duì)照組。圖1 示，笑氣暴露組及吸氧對(duì)照組大鼠ALT 檢測值分別為：98.80±21.37U/L，74.40±6.07 U/L，2 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.04）。

笑氣暴露組及吸氧對(duì)照組大鼠AST 檢測值分別為：270.20±44.24U/L，220.60±20.87U/L，2 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.309）。

2.2 大鼠肝臟細(xì)胞凋亡的比較

TUNEL 檢測結(jié)果（圖2A、2B，見封二）顯示大鼠肝細(xì)胞凋亡，2 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。笑氣暴露組大鼠肝臟細(xì)胞IOD 值為0.0486±0.0055，吸氧對(duì)照組為0.0338±0.0015。

2.3 大鼠肝臟組織學(xué)觀察

顯微鏡下觀察，與吸氧對(duì)照組（圖3A，見封二）相比，笑氣暴露組（圖3B，見封二）大鼠肝臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)無明顯改變。HE 染色顯示2 組大鼠肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索以小葉靜脈為軸心放射狀排列，匯管區(qū)位于小葉周圍，分布規(guī)律，均未見肝細(xì)胞變性壞死及炎癥細(xì)胞浸潤。

圖2 2組大鼠肝細(xì)胞凋亡的比較。TUNEL檢測結(jié)果顯示笑氣暴露組（圖2A）和吸氧對(duì)照組（圖2B）大鼠肝細(xì)胞的IOD值間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.408）。圖3 2組大鼠肝臟組織學(xué)特點(diǎn)比較（HE×200）。HE染色顯示，與吸氧對(duì)照組（圖3A）相比，笑氣暴露組（圖3B）大鼠肝臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)無明顯改變。大鼠肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)正常，未見肝細(xì)胞變性壞死及炎癥細(xì)胞浸潤。

3 討論

3.1 笑氣濫用在國內(nèi)外呈逐步增多趨勢

18 世紀(jì)后期，Joseph Pruestly 首先認(rèn)識(shí)并人工合成了N2O，隨后Humphrey Davy 發(fā)現(xiàn)該氣體能夠使人感到欣快、發(fā)笑并喪失痛覺，故稱之為“笑氣”。因吸入后可以使人產(chǎn)生短暫的欣快感，從19 世紀(jì)開始笑氣就被用于娛樂性消費(fèi)并曾一度在歐洲上流社會(huì)圈非常流行。近年來，國內(nèi)外的娛樂場所為了迎合青少年追求刺激的心態(tài)，將N2O 氣體微型壓縮裝置（“笑氣彈”或“whippets”）中的氣體充入氣球中吸食，以獲得身體上的欣快感和迷幻效果[3]。2016年世界毒品調(diào)查報(bào)告顯示，笑氣已成為世界第七大流行濫用藥物。文獻(xiàn)報(bào)道在歐美等西方國家，笑氣的使用人群約占29.4%～38.6%[4]。目前，小罐裝笑氣（8g/罐）在歐美等國家及地區(qū)的娛樂場所濫用。數(shù)據(jù)顯示笑氣濫用人群的平均年齡約在24.3 歲，其中青少年濫用率可達(dá)12%～20%，國內(nèi)笑氣濫用的病例報(bào)道也呈逐步增多趨勢[1，5，6]。

3.2 笑氣濫用對(duì)肝臟的毒副作用及機(jī)制尚不明確

笑氣較為穩(wěn)定，吸入后絕大部分以原藥形式呼出體外，其余由皮膚蒸發(fā)，或排至尿道和腸道中，經(jīng)腸道細(xì)菌的生物作用轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽和氮等[6]。笑氣的擴(kuò)散性較強(qiáng)，吸入后可導(dǎo)致肺泡內(nèi)氧稀釋，氧分壓下降，引起彌漫性缺氧。研究表明，長期接觸、濫用笑氣可導(dǎo)致慢性中毒，包括貧血和神經(jīng)系統(tǒng)損害等臨床癥狀[7]。近年來國內(nèi)外研究認(rèn)為笑氣導(dǎo)致的慢性中毒主要與其影響體內(nèi)維生素B12（鈷胺素）的代謝相關(guān)[8]。另一可能原因?yàn)樾馕雽?dǎo)致的缺氧引起神經(jīng)系統(tǒng)供氧不足，同時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)興奮、耗氧增加，進(jìn)一步加重了缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷[9]。

目前國內(nèi)外對(duì)笑氣濫用危害的報(bào)道多集中于神經(jīng)損傷領(lǐng)域，而對(duì)其肝臟毒副作用關(guān)注較少。肝臟是人體最重要的消化器官，具有合成、代謝及解毒等重要的生理功能。其解毒機(jī)制為外來或體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，在肝臟轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒或溶解度大的物質(zhì)，隨膽汁或尿液排出體外，以保護(hù)機(jī)體、維持正常的生理功能[10]。笑氣吸入對(duì)肝臟的毒副作用及機(jī)制尚不明確。綜合國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，多數(shù)笑氣中毒患者的肝功能無異常，部分患者出現(xiàn)肝功能損傷，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶的升高，經(jīng)對(duì)癥治療后可逐步恢復(fù)正常[11～13]。其可能的原因?yàn)椋庵卸局饕绊懢S生素B12的代謝，而肝臟是體內(nèi)貯備維生素B12的主要器官，約占總量的80%～90%，在維生素的代謝中發(fā)揮重要作用[14]。因此肝臟可能為笑氣吸入中毒潛在的神經(jīng)系統(tǒng)外靶器官。另一方面，長期笑氣吸入可導(dǎo)致缺氧。肝臟是高代謝、高耗氧器官，急慢性缺氧均可影響肝臟功能。研究表明，缺氧狀態(tài)下肝細(xì)胞三羧酸循環(huán)抑制，無氧酵解代償性增強(qiáng)，乳酸分泌增多，產(chǎn)生氧自由基，引起肝細(xì)胞變性甚至壞死[15]。另外缺氧也可導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡增加，引起肝功能損傷[16，17]。ALT 和AST 能敏感提示肝細(xì)胞損傷及其程度，其中ALT 主要反映急性肝細(xì)胞損傷，AST 主要反應(yīng)肝細(xì)胞損傷程度。有文獻(xiàn)指出，肝臟功能損傷可引起維生素B12的貯備障礙和釋放增加，導(dǎo)致血清維生素B12水平升高[18]。這有可能是臨床診療過程中，笑氣中毒神經(jīng)系統(tǒng)損傷患者的血清維生素B12水平正?；蛏叩脑蛑?。

3.3 笑氣吸入可導(dǎo)致大鼠肝功能損傷

研究中我們利用小動(dòng)物氧濃度控制系統(tǒng) （動(dòng)物染毒箱） 觀察長期笑氣吸入對(duì)大鼠肝臟的毒副作用及可能機(jī)制。結(jié)果顯示：（1）大鼠肝功能損傷，表現(xiàn)為笑氣暴露組ALT 和AST 的檢測值均高于吸氧對(duì)照組，其中ALT 的升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；（2）大鼠肝細(xì)胞凋亡趨勢增加，TUNEL 檢測結(jié)果顯示笑氣暴露組大鼠肝細(xì)胞凋亡值高于吸氧對(duì)照組，但兩者相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；（3）大鼠肝臟組織學(xué)特點(diǎn)變化不明顯，HE 染色未見明確病理學(xué)改變。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，長期笑氣吸入對(duì)肝臟毒副作用為導(dǎo)致肝功能損傷，引起肝細(xì)胞凋亡趨勢增加，但并未導(dǎo)致肝細(xì)胞變性或壞死等組織病理學(xué)改變。且從轉(zhuǎn)氨酶數(shù)據(jù)分析，笑氣對(duì)肝臟毒副作用為急性肝損傷，肝細(xì)胞損傷程度并不嚴(yán)重。故臨床上笑氣中毒導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷合并肝功能損傷的患者經(jīng)保肝藥物等對(duì)癥治療后，肝功能可恢復(fù)正常。同時(shí)因肝臟有較強(qiáng)的代償功能，若肝功能損傷在其代償范圍之內(nèi)，肝臟轉(zhuǎn)氨酶可不出現(xiàn)異常。這可能是多數(shù)笑氣中毒神經(jīng)系統(tǒng)損傷患者肝功能正常的原因。有關(guān)笑氣引起肝功能損傷和神經(jīng)損傷之間的關(guān)系，笑氣引起肝功能損傷、肝細(xì)胞凋亡趨勢增加的機(jī)制及兩者之間的關(guān)系尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)的不足之處為沒有觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，如線粒體等細(xì)胞器。樣本量較偏少，仍需大樣本實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在長期笑氣吸入患者的臨床診治中應(yīng)警惕肝功能損傷的可能，加強(qiáng)對(duì)肝功能的監(jiān)測和保護(hù)。