趙昱瑋 盛雪 唐超 劉健 劉秀華 曹揚 高其品

[摘要]目的 采用高效液相色譜法測定保健食品五味子猴菇口服液中葛根素的含量，為進(jìn)一步提高其質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法 采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus Cl8（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相，檢測波長為250nm。結(jié)果 葛根素在8.48106～42.4053μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（r>0.9990）;平均加樣回收率（n=6）分別為101.47%。結(jié)論 建立了五味子猴菇口服液中葛根素的含量測定的方法，方法重復(fù)性良好，為該保健食品的產(chǎn)品質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜法;五味子猴菇口服液;葛根素;含量測定

[中圖分類號]R917

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]2095-0616（2020）01-39-04

五味子猴菇口服液以吉林省道地中藥材五味子、東北特產(chǎn)猴頭菇為主要原料，以及對肝損傷有保護(hù)作用的銀耳、葛根、甘草、枳棋子等原料開發(fā)的一種對酒精性肝損傷具有輔助保護(hù)作用的保健食品。五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲等均有降低因化學(xué)物質(zhì)引起的血清轉(zhuǎn)氨酶升高、誘導(dǎo)肝臟藥物代謝酶的作用。五味子對BCG+LPS誘發(fā)的肝損傷有顯著的防治作用，從免疫機(jī)制的角度證明了五味子的保肝降酶作用[1-4]。猴頭菇其藥效成分主要有多糖、低聚糖、猴頭菇素和猴頭菇酮等，具有保肝養(yǎng)胃、增強(qiáng)免疫力、降血糖、保護(hù)神經(jīng)、抗癌和抗氧化等功效。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，猴頭菇中多糖成分在胃黏膜保護(hù)方面作用尤為突出[5-7];銀耳多糖口服或腹腔注射能對抗谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的升高，緩解肝細(xì)胞損傷[8-9];葛根提取物（主要成分為葛根總黃酮和葛根素）能提高小鼠對酒精的耐受閾值和醉酒潛伏期，加速酒精代謝、降低其肝毒性[10-11];甘草浸膏口服，對四氯化碳所致大鼠肝損傷有明顯保護(hù)作用[12-13];枳棋子有顯著的解酒、保肝、抗肝纖維化等作用，水提取液可顯著縮短小鼠酒醒時間、加快乙醇代謝，對乙醇所致肝損傷的預(yù)防作用等[14-16]。我國保健食品市場對于酒精肝損傷的護(hù)肝保肝產(chǎn)品需求量很大，盡管市場該類產(chǎn)品的研發(fā)很多，但大多數(shù)產(chǎn)品的功效不顯著。本研究采用HPLC對保健食品五味子猴菇口服液中葛根素的含量進(jìn)行測定，為進(jìn)一步提高產(chǎn)品質(zhì)量控制提供有利依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料

高效液相色譜儀（1260型，美國安捷倫）;超聲波清洗器（KQ-500型，昆山市超聲儀器有限公司）;電子天平（BSA224S-CW型，賽多利斯電子天平），電子天平（QUINTIX125D-1CN型，賽多利斯電子天平）。

純凈水（娃哈哈），乙腈（色譜純），其他試劑均為分析純。葛根素對照品（含量均大于95.4%，110752-201615，中國食品藥品檢定研究院）。五味子猴菇口服液（規(guī)格為：25mL/瓶;批號分別為：20181201， 20181202， 20181203，自制）。

1.2方法

1.2.1色譜條件 1260型Agilent高效液相色譜儀，色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6mm×250mm，5μm）;進(jìn)樣量：10μL;柱溫：25℃;檢測波長：250nm;流動相：乙腈-0.05%磷酸溶液（12：88）;流速：1.0mL/min。

1.2.2溶液的制備[17]

1.2.2.1供試品溶液的制備 吸取五味子猴菇口服液5mL，置25mL容量瓶中，精密稱定，加70%甲醇至刻度，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）5min，放冷，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2.2對照品溶液制備 精密稱取葛根素對照品8.89mg（純度為95.4%），于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取l.OmL于25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為16.96212μg/mL的對照品溶液。

2 結(jié)果

2.1線性關(guān)系

精密吸取“1.2.2.2”對照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，分別至25mL容量瓶中，加甲醇的定容至刻度，按“1.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，以各對照品濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，計算得線性方程為Y=45.167X+4.2168，r=0.9999，結(jié)果表明葛根素濃度在8.48106～42.4053μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。見表1、圖1。

2.2穩(wěn)定性試驗

取批號為20181201的五味子猴菇口服液，照“1.2.2.1”制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48h按“1.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果葛根素含量的RSD分別為0.4%。

2.3精密度試驗

取同一供試品（20181201），按“1.2.1”項下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果葛根素含量的RSD分別為0.3%。

2.4重復(fù)性試驗

取批號為20181201的五味子猴菇口服液，照“1.2.2.1”方法制備6份供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果葛根素含量的RSD分別為1.4%。

2.5加樣回收率試驗

取已知含量的同一批五味子猴菇口服液（20181201）6份各5mL，精密稱定，分別加入葛根素對照品1mL（濃度為0.424053mg/mL）按“1.2.2.1”制備供試品溶液，按“1.2.1”條件進(jìn)行測定，進(jìn)行加樣回收率考察，平均回收率為101.47%，RSD為1.10%（n=6），表明本方法測定葛根素準(zhǔn)確率較高，回收率結(jié)果見表2。

2.6樣品含量測定

按“1.2.2.1”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項條件進(jìn)行測定，計算葛根素的含量，見表3。

3 討論

3.1流動相和樣品前處理的考察

本試驗參照“GB/T 22251-2008保健食品中葛根素的測定”，對流動性洗脫系統(tǒng)、樣品前處理進(jìn)行了考察[10]。

3.1.1流動相選擇 考察了乙腈一磷酸溶液及甲醇一磷酸溶液流動相系統(tǒng)，乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相的洗脫系統(tǒng)，色譜峰形好，分離度較好，因此選擇乙腈-0.05%磷酸溶作為流動相系統(tǒng)。

3.1.2試樣處理 對“GB/T 22251-2008保健食品中葛根素的測定”中試樣處理的兩種方法進(jìn)行了比較，結(jié)果試樣加適量70%甲醇，超聲提取，定容后分析的方法優(yōu)于試樣上D101大孔吸附樹脂層析柱，再用70%甲醇洗脫，蒸干定容的方法，原因在于五味子猴菇口服液為口服液，上D101大孔吸附樹脂層析柱進(jìn)行柱層析方法繁瑣，回收率較低、重復(fù)性較差，故選擇前者為試樣處理方法。

3.2色譜柱考察

對不同廠家色譜柱進(jìn)行了考察，選用了Diamonsil（鉆石）C18（4.6mm×250mm，5μm）、Shimadzu C18（4.6mm×250mm，5μm）、AgilentZORBAX Eclipse Plus C18（4.6mm×250mm，5μm）三種不同色譜柱，結(jié)果Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6mm×250mm，5μm）對葛根素的分離效果最好。

西醫(yī)目前主要從戒酒、營養(yǎng)支持和藥物治療兩個方面治療酒精性肝損傷，但作用較局限;以中藥原料在對化學(xué)性肝損傷又輔助保護(hù)功能的保健食品中應(yīng)用較為普遍，劑型的選擇以服用方便、便于攜帶為主[18-20]。五味子猴菇口服液以五味子、猴頭菇、銀耳、葛根、甘草、枳棋子等原料，經(jīng)過制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)合藥理活性篩選的最佳處方，以保證其安全、有效、合理，為開發(fā)保健食品提供理論依據(jù)。

本研究建立了高效液相色譜法測定五味子猴菇口服液中葛根素的含量方法，通過方法學(xué)的考察確定以250nm為檢測波長，70%甲醇為提取液，超聲提取5min，葛根素在8.48106～42.4053μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（r>0.9990），平均加樣回收率（n=6）分別為101.47%，結(jié)果準(zhǔn)確，方法可操作性強(qiáng)。

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（收稿日期：2019-05-31）

[基金項目]吉林省中醫(yī)藥科技項目（2019155）;吉林省科技發(fā)展計劃項目（20180623037TC）。