于芳 馬香書 霍麗靜 趙培 馬倩 于悅卿 路永剛 帖彥清

心血管疾病由于發(fā)病人數(shù)多并且逐漸年輕化，危險因素廣泛，病程時間長,并發(fā)癥多，縮短人類的壽命和降低人民生活質量。動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是導致心血管疾病的主要病理學基礎[1]。巨噬細胞攝取脂蛋白，在細胞內聚積脂質，形成泡沫細胞，釋放不同的酶、催化劑、抑制劑和生物活性介質，在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[2]。在眾多細胞胞內信號通路的調節(jié)中，蛋白酪氨酸磷酸化與去磷酸化是其中的一種重要方式，其中SHP2(Src homology2 domain-containg protein tyrosine phosphatase 2，SHP2)是蛋白酪氨酸磷酸酶的重要組成部分[3]。在樹突細胞及巨噬細胞中，激活dectin-1、dectin-2/3和Mincle受體后，SHP2能被高度磷酸化。在巨噬細胞敲除SHP2基因后，dectin誘導的Syk磷酸化程度明顯減弱，進一步與之對應的是它們所誘導的細胞因子和趨化因子的表達下調[4]。已有研究顯示，酪氨酸家族在肝臟，肌肉和脂肪組織中參與血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的增殖與遷移，SHP2在VSMC中大量增殖[5]。PHPS1作為SHP2的滲透性抑制劑，能夠抑制SHP2的磷酸化水平和SHP2介導的細胞功能和多種人腫瘤的細胞系生長[6]。PHPS1是治療SHP2相關腫瘤及其他疾病的新的突破點，PHPS1的亞硫酸部分可能形成七個格子的氫鍵連接在SHP2-PTP的環(huán)狀結構上，破壞SHP2的結構從而抑制SHP2的磷酸化水平[1]。使用SHP2抑制劑PHPS1對于動脈粥樣硬化斑塊的影響筆者未知，PHPS1能否減少泡沫細胞的產生？本實驗通過建立ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化動物模型，探討SHP2抑制劑PHPS1在動脈粥樣硬化中的發(fā)展及其作用機制。通過體外培養(yǎng)RAW246.7，觀察使用了PHPS1后，SHP2的表達水平與巨噬細胞的增殖情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 p-Shp2抗體(貨號：ab62322)，p-Syk抗體(貨號：ab192587)，CD36抗體(貨號：133625)，顯微鏡顯微鏡(型號：ECLIPSE E100)購于尼康儀器(上海)有限公司；PBS緩沖液購自BI生物公司；組織包埋機(型號：EG11508)、石蠟切片機(型號：RM2135)均購自Leica公司；Western Blot電泳槽(型號：DYCZ-24DN型)、轉移電泳儀(型號：DYY-7B型)及恒溫循環(huán)器(型號：WD-9412A型)均購自北京六一生物科技有限公司；制冰機(型號：SIM-F124型)購自日本5ANY0有限公司；實時熒光定量PCR儀器；RAW246.7。

1.2 體內實驗方法

1.2.1 動物分組與造模處理:將ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)5周，建立動脈粥樣硬化模型并將其隨機分為模型組與PHPS1組，每組10只。PHPS1組腹腔注射SHP2抑制劑PHPS1 3 mg·kg-1·d-1，模型組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液3 mg·kg-1·d-1。注射1次/d，注射20 d。

1.2.2 標本取材與處理:20 d后，在無菌條件、生理壓力下，使用異戊巴比妥麻醉小鼠，小心分離主動脈及心臟。4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，連續(xù)切片。

1.2.3 通過Movat染色分析斑塊面積:石蠟切片脫蠟至水，5%硫代硫酸鈉 5 min，蒸餾水洗；滴加1%阿爾辛藍水溶液30 min，蒸餾水洗；預熱氨水乙醇中20 min，蒸餾水洗；滴加Weigert蘇木精溶液工作液20 min，蒸餾水洗；滴加藏紅花/酸性品紅工作液15 min，蒸餾水洗；5%磷鎢酸水溶液5 min；直接轉入1%冰醋酸，蒸餾水洗；95%乙醇；無水乙醇5 min；乙醇藏紅花溶液3 min；無水乙醇2 min；常規(guī)脫水、透明后中性樹膠封片，顯微鏡下拍照及圖像統(tǒng)計分析。

1.2.4 通過天狼星紅染色分析膠原所占比例:石蠟切片脫蠟至水，滴加天狼星紅染色液3 h，自來水沖洗1 min，常規(guī)脫水、透明后中性樹膠封片，顯微鏡下拍照及圖像統(tǒng)計分析。

1.2.5 通過免疫組化分別分析巨噬細胞與平滑肌細胞的表達量:切片常規(guī)脫蠟至水后用PH 6.0檸檬酸修復液高壓修復3 min，保溫30 min，H2O2孵育30 min，取出組織的過氧化物酶，山羊血清封閉30 min，封閉天然抗體非特異性表達，滴加一抗Galectin3(abcam 貨號1∶200)/SMA(abcam 貨號1∶200)，4℃過夜，第2天洗滌后滴加辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗與抗鼠二抗30 min后DAB顯色，蘇木素復染細胞核，常規(guī)脫水、透明后中性樹膠封片，顯微鏡下拍照及圖像統(tǒng)計分析。

1.3 通過Western Blotting檢測p-SHP2、p-Syk、CD36蛋白磷酸化水平 小鼠主動脈勻漿后，提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量。按照每孔20 μg蛋白量進行加樣，SDS-PAGE凝膠電泳初始電壓為80 V，待溴酚藍至分離膠后，加大電壓至120 V，繼續(xù)電泳至溴酚蘭達到膠底部位置時結束電泳，分離的蛋白轉至PVDF膜，以50 g/L脫脂奶粉進行封閉，分別加入p-SHP2(1∶1 000),p-Syk(1∶500)，CD36(1∶1 000)抗體，4℃過夜。第2天洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h后洗膜，ECL顯影系統(tǒng)定影顯色，掃描分析條帶灰度值，數(shù)目以目的條帶灰度值與內參GAPDH(1∶1 000)灰度值的比值代表檢測p-SHP2、p-Syk及CD36各蛋白磷酸化水平。

1.4 體外實驗方法

1.4.1 通過免疫熒光檢測細胞內CD36的表達量:4%的多聚甲醛固定15 min。爬片，首先將貼壁的RAW246.7胰酶消化后制成細胞懸液，將無菌細胞爬片放置于六孔板底部后滴加500 μl細胞懸液，置于5%CO2細胞培養(yǎng)箱孵育2 h使RAW246.7貼于細胞爬片上；培養(yǎng)基加1 200 μl 2%FBS，繼續(xù)孵育8 h。0.1%Triton進行細胞打孔，雙氧水孵育30 min(去除過氧化物酶)，含有Tween-20的3%牛血清白蛋白/TBS緩沖液封閉2 h，一抗過夜孵育。第2天，用TBS緩沖液清洗2次，二抗孵育30 min，用TBS緩沖液清洗2次，再用1 μg/mlDAPI復染。在100×的油鏡下使用Zeiss顯微鏡及運用Axio Vision4.8軟件對圖像進行觀測和獲取。所有操作步驟都在室溫下進行。每次至少檢驗100個形態(tài)學完整的細胞。

1.4.2 熒光微球吞噬實驗檢測巨噬細胞的內吞能力:①細胞培養(yǎng)與處理：每孔接種細胞7.0×104個/cm2的平板，37℃5%CO2孵育24 h，最佳孵育至50%～70%匯合。取出培養(yǎng)基，將細胞暴露于試驗材料中。37℃，5%CO2孵育24 h。②乳膠珠的制備：用蒸餾水和10 000 g的顆粒在室溫下洗滌乳膠珠8 min。將乳膠珠重新懸浮于含25 mm Na3PO4(pH值6.0)的3%BSA中，在室溫下用浴聲法孵育15 min。用含5%胎牛血清的培養(yǎng)基清洗1次。將珠子在濃度為2.0%的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，4℃避光保存。③化驗：實驗用6孔板，每孔用15 μl珠料加1 ml培養(yǎng)基。將珠子充分攪拌，取出105 μl，加入7 ml培養(yǎng)基中。在黑暗中，在室溫下浸泡10 min(珠子工作液)。每孔用PBS洗2次，換成珠狀工作液，6孔板1 ml/孔，12孔板0.4 ml/孔。在37℃黑暗中培養(yǎng)80～120 min。去除珠子工作液，用PBS清洗3次，去除多余的珠子。用刮刀或胰蛋白酶法將細胞提起，并按PBS的要求清洗細胞。用PI(4 μg/ml最終濃度)染色并進行FACS。

1.4.3 通過Western Blotting檢測各組細胞中p-SHP2、p-Syk、CD36蛋白磷酸化水平:將細胞制成單細胞懸液，待細胞貼壁后換液，給予ox-LDL刺激。24 h后終止反應，用刮匙將細胞刮下(尤其是培養(yǎng)瓶邊緣)，加入細胞裂解液，震蕩離解細胞，離心后提取上清。BCA測濃度，進行Western blot檢測。按照每孔20 μg蛋白量進行加樣，SDS-PAGE凝膠電泳初始電壓為80 V，待溴酚藍至分離膠后，加大電壓至120 V，繼續(xù)電泳至溴酚藍達到膠底部位置時結束電泳，分離的蛋白轉至PVDF膜，以50 g/L脫脂奶粉進行封閉，分別加入p-SHP2(1∶1 000),p-Syk(1∶500)，CD36(1∶1 000)抗體，4℃過夜。第2天洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h后洗膜，ECL顯影系統(tǒng)定影顯色，掃描分析條帶灰度值，數(shù)目以目的條帶灰度值與內參GAPDH(1∶1 000)灰度值的比值代表檢測p-SHP2、p-Syk及CD36中各蛋白磷酸化水平改變。

2 結果

2.1 體內實驗結果

2.1.1 通過Movat染色分析斑塊面積:Movat染色顯示PHPS1組動脈粥樣硬化斑塊面積明顯小于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Movat染色分別評估斑塊面積、膠原所占比例(×40)

表1 Movat染色分析斑塊面積與天狼星紅染色分析膠原所占比例

表1 Movat染色分析斑塊面積與天狼星紅染色分析膠原所占比例

染色方法模型組PHPS1組Movat染色 541 700±36 580 293 200±33 520*天狼星紅染色118 600±11 36071 360±5 138*

注：與模型組比較，*P<0.01

2.1.2 通過天狼星紅染色分析膠原所占比例:天狼星紅染色顯示，PHPS1組動脈粥樣硬化斑塊內膠原纖維的含量較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.1.3 通過免疫組化分別分析巨噬細胞與平滑肌細胞的表達量:免疫組化結果顯示PHPS1組平滑肌細胞與巨噬細胞較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3，表2。

圖3 免疫組化分別分析巨噬細胞與平滑肌細胞的表達量(×40)

表2 2組不同染色方法巨噬細胞與平滑肌細胞表達量比較

表2 2組不同染色方法巨噬細胞與平滑肌細胞表達量比較

染色方法模型組PHPS1組Galectin-3染色1 653±238723±72*α-SMA染色 850±68424±61*

注：與模型組比較，*P<0.01

2.1.4 通過Western Blotting檢測p-SHP2、p-Syk、CD36蛋白磷酸化水平:Western Blotting檢測結果顯示，PHPS1組p-SHP2、p-Syk、CD36蛋白的磷酸化水平較模型組均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4，表3。

圖4 Western Blotting檢測p-SHP2、p-Syk、CD36蛋白磷酸化水平

表3 p-SHP2、p-Syk及CD36蛋白的表達水平

2.2 體外實驗結果

2.2.1 通過免疫熒光檢測細胞內CD36的表達量：PHPS1組巨噬細胞內CD36的熒光強度明顯低于ox-LDL組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4，圖5。

表4 各組CD36的熒光強度比較

圖5 免疫熒光檢測細胞內CD36的表達量

2.2.2 通過熒光微球吞噬實驗檢測巨噬細胞的內吞能力：熒光微球吞噬實驗結果顯示PHPS1組巨噬細胞熒光強度明顯低于ox-LDL組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6，表5。

圖6 熒光微球吞噬實驗檢測巨噬細胞的內吞能力

表5 巨噬細胞吞噬熒光微球的含量

2.2.3 通過Western Blotting檢測對各組細胞中p-SHP2、p-Syk、CD36蛋白磷酸化水平:Western Blotting檢測結果顯示，RAW246.7+ox-LDL+PHPS1組p-SHP、p-Syk、CD36蛋白磷酸化水平較RAW246.7+ox-LDL組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表6，圖7。

表6 各組p-SHP、p-Syk、CD36蛋白的表達水平

圖7 Western Blotting檢測3組細胞中p-SHP2、p-Syk、CD36蛋白磷酸化水平

3 討論

易損斑塊是指動脈粥樣硬化斑塊中發(fā)展迅速、具有血栓形成傾向的不穩(wěn)定性高危斑塊,易發(fā)生臨床不良事件的罪犯病變[7]。在粥樣斑塊形成的過程中，大量活化的巨噬細胞會產生蛋白水解酶，降解膠原，破壞纖維帽結構，使斑塊穩(wěn)定性下降，更容易發(fā)生破裂[8]。SHP2作為酪氨酸磷酸酶之一，對其功能的研究及其在疾病中的作用的研究越發(fā)激烈。Chepelenko等[9,10]報告VSMC參與并促進AS的發(fā)生發(fā)展。實驗發(fā)現(xiàn)SHP2能夠促進VSMC增殖[11,12]。因此本實驗以SHP2作為研究靶點，探討SHP2抑制劑PHPS1對AS及巨噬細胞的影響，已證實SHP2對AS及巨噬細胞的發(fā)展進程密切相關，抑制劑PHPS1對于高脂誘導的AS形成及巨噬細胞的吞噬功能有明顯的抑制作用。 本實驗首先進行造模處理，小鼠高脂飼料喂養(yǎng)，AS發(fā)病率高且實驗費用低，易于操作，為后續(xù)步驟做準備。ApoE能夠調控LDL的胞吞作用，其敲除必然會導致AS，乳糜微粒代謝紊亂和清除障礙，從而導致游離膽固醇堆積，脂質代謝紊亂[13]。氧化低密度脂蛋白(oxLDL-C)具有細胞毒性，能夠上調巨噬細胞數(shù)量并被過度攝取,導致胞內大量膽固醇聚集進而形成泡沫細胞,大量泡沫細胞停留在血管壁內,使AS斑塊形成[14]。 蛋白磷酸化與去磷酸化是細胞信號轉導的基本事件之一，他們分別受蛋白激酶與蛋白磷酸酶調控，與細胞分化、增殖、移動等過程有關。SHP2是蛋白磷酸酶家族成員之一[15]。SHP2 受到ROS的調控，通過正向調控Syk的磷酸化水平，促進VSMC遷移與內膜增生[16]。刺激因素作用于SHP2后，使得SHP2被磷酸化,激活Syk，巨噬細胞內吞脂質增多，生成大量泡沫細胞。 應用PHPS1后的病理結果：斑塊是動脈內膜上積聚的呈黃色粥樣的脂質，主要累及大中型動脈。應用PHPS1可抑制粥樣斑塊形成。血管內皮層存在大量的VSMCs，形成纖維帽起到穩(wěn)定斑塊的作用，在AS形成早期大量存在，PHPS1可抑制VSMCs形成。膠原纖維由VSMCs分泌，PHPS1可抑制膠原纖維形成。AS病理改變的一個重要特點是巨噬細胞在內皮損害部位的聚集，吞噬了脂質的巨噬細胞成為泡沫細胞[17]。應用PHPS1可降低巨噬細胞的內吞功能。巨噬細胞通過CD36攝取大量的OX-LDL形成泡沫細胞，PHPS1可降低巨噬細胞的內吞功能，CD36量也會下降。刺激因素作用于SHP2后，使得SHP2被磷酸化,激活Syk，巨噬細胞內吞脂質增多，生成大量泡沫細胞。應用PHPS1后p-SHP2，p-Syk，CD36表達水平降低。 因此PHPS1通過抑制p-SHP2，影響p-Syk表達從而抑制巨噬細胞內吞脂質形成泡沫細胞，減小斑塊面積，減少VSMCs及膠原纖維形成，阻止動脈粥樣硬化斑塊的形成。本實驗證實PHPS1能夠起到抗動脈粥樣硬化作用。