努爾阿米娜·依明尼亞孜 帕力旦·艾沙 阿依姆妮薩·阿卜杜熱合曼

急性淋巴細胞白血病屬于血液系統(tǒng)性疾病，其主要特征是細胞惡性增殖、細胞凋亡受抑[1]。因而如何抑制白血病細胞增殖及促進細胞凋亡成為目前研究重點問題。研究表明奇果菌素(grifolin，Gri)可通過誘導人骨肉瘤細胞凋亡從而抑制骨肉瘤細胞生長[2]。奇果菌素還可抑制胃癌細胞增殖及侵襲，誘導細胞凋亡[3]。但奇果菌素對白血病細胞增殖、凋亡的影響尚未可知。研究表明微小RNA-646(microRNA-646，miR-646)在結(jié)直腸癌、胃癌、骨肉瘤組織及細胞中下調(diào)表達，并可抑制細胞增殖及遷移[4-6]。但miR-646對白血病細胞增殖、凋亡的影響尚未可知。TargetScan預測顯示解聚素-金屬蛋白酶17(a disintegrin and metalloprotease 17，ADAM17)可能是miR-646的靶基因，研究表明ADAM17在食管鱗狀細胞癌組織和細胞中呈高表達，其高表達量與細胞侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)[7]。沉默ADAM17表達可抑制人甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、遷移及侵襲[8]。但筆者發(fā)現(xiàn)miR-646與ADAM17的靶向關(guān)系，以及奇果菌素是否通過調(diào)控miR-646/ADAM17通路影響白血病細胞的增殖和凋亡尚未可知。本研究以白血病K562細胞為研究對象，深入探討奇果菌素對白血病細胞的增殖和凋亡影響及其對miR-646/ADAM17通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 奇果菌素購自上海赫澎生物科技有限公司；白血病細胞K562購自美國ATCC細胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)基購自上海源葉生物科技有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)細胞增殖試劑盒購自上海齊一生物科技有限公司；細胞凋亡試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；Trziol試劑、反轉(zhuǎn)錄與實時熒光定量PCR試劑盒與聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchonininc acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、蛋白提取試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；miR-646 模擬物(mimics)、陰性對照(miR-NC)、miR-646抑制劑(anti-miR-646)、anti-miR-NC、ADAM17小干擾RNA(si-ADAM17)、亂序無意義陰性對照序列(si-NC)購自上海吉瑪基因；Lipofectamine2000購自上海北諾生物科技有限公司；兔抗人細胞周期蛋白1(CyclinD1)、P21一抗購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗人ADAM17、 B淋巴細胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)單克隆抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗處理與分組:白血病K562細胞培養(yǎng)于RPMI 1640完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清)，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，每24小時更換一次培養(yǎng)液，待細胞生長匯合至90%時進行傳代培養(yǎng)。用10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋奇果菌素，稀釋濃度為25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L[9]。選取對數(shù)生長期白血病K562細胞，用終濃度為25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L的奇果菌素分別作用24 h，分別為Gri 25 μmol/L組、Gri 50 μmol/L組、Gri 75 μmol/L組，未經(jīng)任何處理的K562細胞作為Con組。同時將miR-646 mimics(miR-646組)、miR-NC(miR-NC組)、si-ADAM17(si-ADAM17組)、si-NC(si-NC組)分別轉(zhuǎn)染至K562細胞，各組細胞培養(yǎng)48 h。后續(xù)實驗中將anti-miR-646、anti-miR-NC分別轉(zhuǎn)染至K562細胞后，用終濃度為75 μmol/L的奇果菌素作用24 h。

1.2.2 細胞增殖能力檢測:取對數(shù)生長期K562細胞，加入RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為1×104個/ml，接種于96孔板(3×104個/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照“1.2.1”分組處理，同時設(shè)置空白對照組，每組設(shè)置3個復孔，各組處理24 h時每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，低速振蕩10 min，應用酶標儀檢測各孔吸光度值(A值)，計算細胞抑制率=[1-(試驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)]×100%，實驗重復3次。

1.2.3 細胞凋亡實驗:取各組對數(shù)生長期K562細胞，(室溫條件下)1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min，棄上清，PBS清洗后加入500 μl結(jié)合緩沖液，加入5 μl Annexin V-FITC，充分混勻后加入5 μl PI，室溫避光孵育10 min，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測細胞中miR-646、ADAM17 mRNA表達水平:取各組K562細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，應用nanodrop微量核酸測定儀測定RNA濃度，取2 ng RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應，嚴格按照試劑盒說明書配置反應體系，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板配置qRT-PCR反應體系，反應條件為95℃ 2 min(循環(huán)1次)，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s(循環(huán)35次)，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，qRT-PCR反應所用儀器為ABI 7500型熒光定量PCR儀，反應結(jié)束后，miR-646以U6為內(nèi)參，ADAM17以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-646、ADAM17 mRNA相對表達量。miR-646正向引物為5’-ATAGGCCGGCATAGACGCGTCTGGCT-3’，反向引物為：5’-AAAGATCCTTTATTAAGCTTAATGGGA-3’；ADAM17正向引物為5’-ATCAAACCCTTTCCTGCG-3’，反向引物為：5’-CAAACCCATCCTCGTCCA-3’。

1.2.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測ADAM17、CyclinD1、Bcl-2、p21、Bax蛋白表達:收集各組K562細胞，參照蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，嚴格按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白濃度，蛋白高溫變性，SDS-PAGE電泳的加樣孔內(nèi)加入變性蛋白(30 μg/孔)，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h，加入一抗(1∶1 000)，搖床上4℃孵育過夜，TBST洗滌3次×10 min，加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次×10 min，滴加ECL顯影，應用凝膠成像分析系統(tǒng)與ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測:構(gòu)建野生型熒光素酶報告載體WT-ADAM17與突變型熒光素酶報告載體MUT-ADAM17，WT-ADAM17、MUT-ADAM17分別與miR-646 mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染至K562細胞，置于37℃恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞后檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 奇果菌素對白血病K562細胞增殖、凋亡的影響 與Con組相比，Gri 25 μmol/L組、Gri 50 μmol/L組、Gri 75 μmol/L組白血病K562細胞抑制率顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，p21、Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，Gri 不同劑量組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且呈劑量依賴效應。見圖1,表1。

圖1 奇果菌素對白血病K562細胞增殖、凋亡的影響;A 增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表1 奇果菌素對白血病K562細胞增殖、凋亡的影響

2.2 奇果菌素對白血病K562細胞中miR-646和ADAM17表達的影響 實驗結(jié)果顯示，相對于Con組，Gri 25 μmol/L組、Gri 50 μmol/L組、Gri 75 μmol/L組白血病K562細胞中miR-646的表達低水平顯著升高(P<0.05)，ADAM17的表達水平顯著降低(P<0.05)，奇果菌素不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且呈劑量依賴效應。見圖2,表2。

圖2 ADAM17蛋白表達

表2 奇果菌素對白血病K562細胞中miR-646和ADAM17表達的影響

2.3 miR-646靶向調(diào)控ADAM17的表達 TargetScan預測顯示ADAM17的3’UTR中含有與miR-646互補的核苷酸序列，見圖3A。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，miR-646過表達可抑制含miR-646結(jié)合位點熒光報告載體的強度(P<0.05)，而含突變結(jié)合位點的熒光報告載體的強度無顯著性變化。Western blot實驗結(jié)果顯示，miR-646組白血病K562細胞中ADAM17的表達水平顯著低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-646組白血病K562細胞中ADAM17的表達水平顯著高于anti-miR-NC組(P<0.05)。見圖3,表3、4。

圖3 miR-646靶向調(diào)控ADAM17的表達;A ADAM17的3’UTR中含有與miR-646互補的核苷酸序列；B ADAM17蛋白表達

表3 雙熒光素酶報告實驗

表4 miR-646調(diào)控ADAM17蛋白的表達

2.4 miR-646過表達對白血病K562細胞增殖、凋亡的影響 與miR-NC組相比，miR-646組白血病K562細胞抑制率與細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)，CyclinD1、Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)，p21、Bax蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)。見表5,圖4。

表5 miR-646過表達對血病K562細胞增殖、凋亡的影響

圖4 增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達

2.5 干擾ADAM17表達對白血病K562細胞增殖、凋亡的影響 相較于si-NC組，si-ADAM17組白血病K562細胞抑制率與細胞凋亡率均顯著增加(P<0.05)，CyclinD1、Bcl-2蛋白表達下調(diào)(P<0.05)，p21、Bax蛋白表達上調(diào)(P<0.05)。見圖5,表6。

圖5 ADAM17和增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達

表6 干擾ADAM17表達對血病K562細胞增殖、凋亡的影響

2.6 抑制miR-646表達逆轉(zhuǎn)了奇果菌素(75 μmol/L)對白血病K562細胞增殖、凋亡的作用 相對于Gri+anti-miR-NC組，Gri+anti-miR-646組白血病K562細胞中ADAM17蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，細胞抑制率與細胞凋亡率均顯著減低(P<0.05)，CyclinD1、Bcl-2蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)，p21、Bax蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)。見表7,圖6。

表7 抑制miR-646表達逆轉(zhuǎn)了奇果菌素對白血病K562細胞增殖、凋亡的作用

圖6 ADAM17和增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達

3 討論

白血病發(fā)生發(fā)展過程涉及基因遺傳、基因突變等多種因素，臨床采用骨髓移植、干細胞移植等治療白血病，但移植過程中極易引發(fā)炎癥從而影響患者生存質(zhì)量[10]。分子靶向治療為白血病的治療提供新方向，研究顯示miRNA可通過調(diào)控下游靶基因表達從而參與白血病發(fā)生過程，miRNA可能作為靶向治療白血病的潛在靶點[11]。因此，本研究試圖尋找新型藥物用于治療白血病，深入分析其是否可能通過調(diào)控miRNA及下游靶基因表達而發(fā)揮作用，旨在為靶向治療白血病藥物的研發(fā)提供實驗依據(jù)。 奇果菌素是從奇果菌中分離的一種多糖，其具有抗炎、抗腫瘤等作用，研究表明奇果菌素可抑制宮頸癌細胞增殖及促進細胞凋亡[12]。研究表明奇果菌素可通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC1α)與Fra-1/LSF-MMP2/CD44軸之間的相互作用從而抑制腫瘤細胞生長及遷移，還可通過抑制ERK1/2表達從而抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[13,14]。本研究結(jié)果顯示不同濃度的奇果菌素作用于白血病細胞后，細胞抑制率與細胞凋亡率顯著升高，提示奇果菌素可抑制白血病細胞增殖及促進其凋亡。研究報道指出細胞分裂是細胞增殖的基礎(chǔ)，細胞周期異常與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，p21是細胞周期素依賴性激酶的抑制因子并可負向調(diào)控細胞周期進程從而抑制腫瘤細胞生長，CyclinD1可正向調(diào)控細胞周期進程從而促進腫瘤細胞生長[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，奇果菌素作用于白血病細胞后可顯著促進p21表達而抑制CyclinD1的表達，且呈一定劑量依賴性，隨著藥物濃度的增加，細胞增殖的抑制作用顯著增強，提示奇果菌素可能通過上調(diào)p21的表達及下調(diào)CyclinD1的表達從而抑制白血病細胞增殖。細胞凋亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，目前大多數(shù)抗白血病藥物的主要作用機制是誘導白血病細胞凋亡，Bcl-2是抑制細胞凋亡的基因，其可通過參與鈣離子依賴的蛋白磷酸化過程而發(fā)揮作用，Bax是促細胞凋亡的基因，其可通過激活線粒體途徑從而發(fā)揮作用[16]。本研究結(jié)果顯示奇果菌素可誘導白血病細胞凋亡，Bax蛋白的表達水平隨著奇果菌素濃度的增加而顯著升高，而Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低，提示奇果菌素可能通過上調(diào)Bax蛋白表達及下調(diào)Bcl-2蛋白表達從而誘導白血病細胞凋亡。 miR-646過表達可通過抑制p-EGFR、p-Akt蛋白表達從而降低肺癌細胞增殖能力[17]。研究表明miR-646過表達可通過抑制表皮生長因子受體(EGFR)通路激活從而降低骨肉瘤細胞增殖及遷移能力[18]。本研究結(jié)果顯示奇果菌素可顯著上調(diào)白血病細胞中miR-646的表達，進一步研究顯示miR-646過表達可顯著降低白血病細胞增殖能力，同時可促進細胞凋亡，抑制CyclinD1、Bcl-2蛋白表達，促進p21、Bax蛋白表達，提示奇果菌素可能通過上調(diào)miR-646表達而抑制白血病細胞增殖及誘導細胞凋亡，其可通過上調(diào)p21、Bax的表達及CyclinD1、Bcl-2的表達而發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)奇果菌素可抑制ADAM17表達，研究表明沉默ADAM17表達可抑制乳腺癌細胞增殖，還可降低胰腺癌細胞遷移能力[19,20]。本研究通過TargetScan預測顯示ADAM17可能是miR-646的靶基因，本研究通過雙熒光素酶報告實驗證實miR-646可靶向結(jié)合ADAM17，并可負性調(diào)控ADAM17的表達及活性，進一步研究顯示干擾ADAM17表達對白血病細胞增殖具有明顯抑制作用，并可促進細胞凋亡，提示奇果菌素可能通過上調(diào)miR-646表達而抑制ADAM17表達從而調(diào)控白血病細胞增殖及凋亡。為驗證上述推測，本研究在白血病細胞中轉(zhuǎn)染miR-646抑制劑后用奇果菌素處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞抑制率與細胞凋亡率均明顯降低，促進CyclinD1、Bcl-2蛋白表達，而抑制p21、Bax蛋白表達，提示抑制miR-646表達可逆轉(zhuǎn)奇果菌素對白血病細胞增殖、凋亡的作用。研究結(jié)果證實奇果菌素可通過上調(diào)miR-646表達而抑制ADAM17表達從而抑制白血病細胞增殖，誘導細胞凋亡。 綜上所述，奇果菌素可通過上調(diào)miR-646表達及下調(diào)ADAM17表達從而發(fā)揮抗白血病的作用，為奇果菌素在白血病的治療方面的應用提供理論依據(jù)。但奇果菌素是否可通過調(diào)控其他基因表達或相關(guān)信號通路尚需進一步研究。