范 霞， 李 飛， 黃 璜

(貴州省人民醫(yī)院兒外科， 貴州 貴陽 550001)

性發(fā)育障礙(disorders of sexual development，DSD)是常見的出生缺陷疾病之一，影響了近3%的新生兒[1]。DSD的高發(fā)病率可歸因于一系列復(fù)雜的發(fā)育障礙，這些發(fā)育問題從性分化開始一直持續(xù)到性功能成熟時期[2]。隱睪、尿道下裂和陰囊不完全融合是男性常見的性發(fā)育障礙[2-3]，而女性中，DSD通常表現(xiàn)為先天性子宮異常及陰道缺陷[4-5]。盡管DSD在男性和女性身上都具有臨床表現(xiàn)，但缺乏等效的動物模型。

尿道下裂是常見的DSD癥狀之一，在新生兒出生中發(fā)病率為1∶300～1∶250[6]。尿道下裂發(fā)生的原因尚未確定，易感基因與外源性內(nèi)分泌干擾物的相互作用是尿道下裂的誘發(fā)因素[7]，孕期外源性內(nèi)分泌干擾物暴露可導(dǎo)致子代尿道下裂以及生殖器官發(fā)育異常[8]。男性胎兒生殖器尿道溝閉合和陰莖的完整器官形成均需雙氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT) 的刺激，而DHT是睪酮在5α-還原酶(5α-reductase，5α-RDA)的作用下轉(zhuǎn)化而來的[9]。因此，睪酮和5α-RDA異常會影響尿道溝的閉合，產(chǎn)生尿道下裂。非那雄胺是5α-RDA抑制劑，臨床上主要治療男性前列腺肥大以及雄性激素脫發(fā)以及替代治療方案用于女性脫發(fā)[10]。然而目前，非那雄胺在女性尤其是孕婦接觸后對子代生殖器官發(fā)育影響的研究尚不完整。

本研究中，雌鼠懷孕0～17 d給予非那雄胺處理，觀察其子代雄性小鼠生殖器官發(fā)育情況。由于小鼠在幼年期可能存在生殖器官發(fā)育遲緩的問題，本研究觀察了子代小鼠成年后生殖器官的發(fā)育情況并通過HE染色以及免疫熒光染色研究了孕期非那雄胺暴露對子代小鼠睪丸發(fā)育以及精子生成的影響。本研究結(jié)果提示，孕期避免非那雄胺接觸將有利于胎兒的性腺和生殖器官發(fā)育。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)試劑

HE染色試劑盒與PAS染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；抗原脫膜液購于Vector Laboratories；抗GATA-1抗體、細(xì)胞色素P450scc(cholesterol side-chain cleavage enzyme)抗體、Alexa Fluor?488偶聯(lián)的熒光 II 抗與DAPI染液購于Cell Signaling Technology；抗Ki67抗體購于Thermo Fisher Scientific；抗caspase-3抗體與抗沙漠刺猬因子(desert hedgehog,Dhh)抗體購于Santa Cruz；抗MVH(mouse Vasa ho-mologue)抗體購于Abcam。

2 實(shí)驗(yàn)動物

8周齡SPF級雌性與雄性CD-1小鼠(各20只，♂30 g～32 g，♀26 g～28 g)購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心 [SCXK(黔)2018-0001]。小鼠飼養(yǎng)在SPF級動物房中，自由進(jìn)食進(jìn)水，溫度(23±1)℃，光照明暗交替12 h。所有動物實(shí)驗(yàn)均通過本院倫理委員會審查，并符合動物福利3R原則。

3 方法

3.1藥物處理 實(shí)驗(yàn)動物在飼養(yǎng)環(huán)境中適應(yīng)1周后配種，1只雄性CD-1與3只動情期雌性CD-1同籠飼養(yǎng)。第2天早上檢查小鼠陰栓，檢查到陰栓認(rèn)為交配成功。孕鼠隨機(jī)分為對照組與非那雄胺組。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及文獻(xiàn)描述的方法[11]進(jìn)行換算，孕期非那雄胺暴露組母鼠在交配成功后0～17 d內(nèi)每天經(jīng)灌胃給予非那雄胺的劑量為8.0 mg/kg，對照組母鼠給予同體積生理鹽水灌胃。分娩后，對照組中隨機(jī)取18只子代雄性崽鼠，孕期非那雄胺暴露組隨機(jī)取22只子代雄性崽鼠，繼續(xù)飼養(yǎng)4個月。

3.2宏觀形態(tài)學(xué)觀察 直接采用D750型相機(jī)(Nikon)拍攝對照組以及非那雄胺組子代雄性小鼠下腹外生殖器部圖像，宏觀觀察包皮、陰囊和尿道口的發(fā)育情況；采用ImageJ軟件測量肛門與生殖器間距離(anogenital distance，AGD)。對子代雄性小鼠麻醉后，在小鼠下腹部進(jìn)行生殖器官解剖，拍照獲得圖像，宏觀觀察睪丸位置、陰莖/尿道大小與位置；采用ImageJ軟件測量陰莖與睪丸的長度。

3.3組織學(xué)染色 分離的陰莖與睪丸，在4 ℃下固定在4%多聚甲醛中。脫水嵌入石蠟后，陰莖石蠟組織制作成5 μm厚縱向切片；睪丸石蠟組織制作成5 μm厚腸橫向切片。隨后將切片脫水、再水化，行常規(guī)HE染色，并隨機(jī)拍攝6個視野圖像。按照Rodriguez E等[12]所述方法，采用ImageJ軟件測量雄性泌尿系統(tǒng)交配隆突(male urogenital mating protube-rance，MUMP)長度、MUMP尖端至尿道口距離、MUMP陰莖海綿體(MUMP corpus cavernosum，MCC)長度和陰莖骨長度。每只小鼠選擇6張睪丸組織HE染色圖像并對生精小管計數(shù)和量化生精小管管腔與間質(zhì)間隙大小，取平均值。睪丸石蠟組織切片行常規(guī)PAS染色，計數(shù)生精小管官腔內(nèi)精子。

3.4免疫熒光染色 每組隨機(jī)選8～10只子代雄性小鼠的睪丸組織石蠟切片脫水后再水化，在10%甲醇中用3%的H2O2對內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行滅活，隨后將載玻片在抗原脫膜液中煮沸。分別滴加 I 抗[GATA-1(1∶200)、P450scc(1∶100)、Ki67(1∶100)、caspase-3(1∶500)、Dhh(1∶100)和MVH(1∶200)]，4 ℃下孵育過夜。次日，PBS洗3次后，滴加熒光 II 抗(1∶500)，室溫避光孵育1 h。熒光顯微鏡下觀察并拍攝選擇5個視野。利用ImageJ軟件量化生精小管的陽性GATA-1熒光強(qiáng)度用于評估每個生精小管的睪丸支持細(xì)胞(Sertoli細(xì)胞)數(shù)；量化間質(zhì)間隙區(qū)陽性P450scc熒光強(qiáng)度用于評估睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig細(xì)胞)數(shù)；量化陽性MVH熒光強(qiáng)度用于評估精原細(xì)胞數(shù)；同時量化陽性Ki67、caspase-3與Dhh的熒光強(qiáng)度。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組與組之間比較采用雙尾t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 孕期非那雄胺暴露對子代雄性小鼠外生殖器官畸形的影響

對照組子代雄性小鼠包皮發(fā)育正常，陰囊完全融合，AGD和尿道口發(fā)育正常，孕期非那雄胺暴露組子代雄性小鼠陰囊融合不完全、AGD顯著縮短(P<0.01)，見圖1，且有6只小鼠發(fā)生尿道下裂現(xiàn)象(黑色箭頭示)。進(jìn)一步對陰莖分離并檢測，結(jié)果顯示，對照組子代雄性小鼠陰莖與龜頭發(fā)育正常，孕期非那雄胺暴露組子代雄性小鼠陰莖和龜頭均畸形；統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組相比，孕期非那雄胺暴露組子代雄性小鼠MUMP長度、MUMP尖端至尿道口距離、MCC長度和陰莖骨長度均顯著縮短(P<0.01)，見圖2。

Figure 1. The effects of finasteride exposure during pregnancy on external genital malformation in offspring male mice. Black arrow indicates hypospadias; A: anus; P: prepuce; S: scrotal sac; T: tail; AGD: anogenital distance. Mean±SD.**P<0.01vscontrol group.

圖1 孕期非那雄胺暴露對子代雄性小鼠外生殖器官畸形的影響

2 孕期非那雄胺暴露對子代雄性小鼠睪丸發(fā)育的影響

對照組子代雄性小鼠睪丸位于正常的陰囊位置并在陰莖水平線以下,見圖3A；孕期非那雄胺暴露組子代雄性小鼠睪丸不同程度的不完全下降，見圖3B，其中15只小鼠雙側(cè)睪丸下降，7只小鼠單側(cè)睪丸下降。且相比于對照組，孕期非那雄胺暴露組子代雄性小鼠睪丸長度顯著縮短(P<0.01),見圖3C、D和I。HE結(jié)果顯示，對照組子代雄性小鼠睪丸發(fā)育正常,見圖3E；孕期非那雄胺暴露組子代雄性小鼠睪丸發(fā)育不良，見圖3F；統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組相比，孕期非那雄胺暴露組子代雄性小鼠睪丸生精小管密度顯著降低(P<0.01),見圖3J，生精小管管腔和間質(zhì)間隙均顯著增大(P<0.01),見圖3K、L。PAS染色顯示，與對照組相比，孕期非那雄胺暴露組子代雄性小鼠睪丸的生精小管管腔成熟精子數(shù)顯著降低(P<0.01)，見圖3G、H和M。

3 孕期非那雄胺暴露對子代雄性小鼠精子生成的影響

通過GATA-1和P450scc熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，孕期非那雄胺暴露組子代雄性小鼠Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞密度均顯著降低(P<0.01)，并且對照組成熟精子所在的生精小管管腔有較強(qiáng)的DAPI信號(P450scc對照組染色圖片白色虛線內(nèi))。Caspase-3、Ki67與Dhh熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，孕期非那雄胺暴露組子代雄性小鼠睪丸中生精小管細(xì)胞caspase-3熒光強(qiáng)度顯著增加(P<0.01)，Ki67與Dhh熒光強(qiáng)度均顯著降低(P<0.01)。MVH熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，孕期非那雄胺暴露組子代雄性小鼠睪丸中精原細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.01)，且生精小管管腔中基本沒有成熟精子生成(MVH非那雄安組染色圖片白色虛線內(nèi))。見圖4。

Figure 2. The effects of finasteride exposure during pregnancy on penile structure and morphology of offspring male mice. MUMP: male urogenital mating protuberance; CCG: corpus cavernosum glandis; MCC: MUMP corpus cavernosum; MRG: MUMP ridge groove; GP: glans penis; GR: glanular ridge; UR: urethra; UM: urethral meatus; PB: penile body; P: penis; S: scrotum; B: bone; C: cartilage. Mean±SD.**P<0.01vscontrol group.

圖2 孕期非那雄胺暴露對子代雄性小鼠陰莖結(jié)構(gòu)及形態(tài)的影響

討 論

DSD是成因復(fù)雜、臨床表型多樣的一類疾病。在DSD中，不同病因可能有相同或相似的臨床表現(xiàn)，且同一病因也會導(dǎo)致不同的臨床表型。隱睪、尿道下裂和不完全陰囊融合與男性新生兒先天性生殖異常有關(guān)[2-3]，而這其中具體的作用機(jī)理并不清楚。本研究主要研究孕期非那雄胺暴露與子代DSD的關(guān)系。有研究報道， 10 mg/kg非那雄胺連續(xù)喂養(yǎng)新西蘭大白兔7 d，尿道下裂發(fā)生率達(dá)90%[13],這些結(jié)果提示，非那雄胺具有對動物性腺發(fā)育不良的影響，然而孕期接觸非那雄胺對子代的生殖器官發(fā)育影響的報道尚少。

現(xiàn)在普遍認(rèn)為，孕期宮內(nèi)雌激素暴露或雄激素缺乏均可導(dǎo)致子代尿道下裂。臨床分析結(jié)果也提示，女性妊娠前服用避孕藥與子代尿道下裂發(fā)生相關(guān)[14]。而非那雄胺是睪酮代謝成為更強(qiáng)的DHT過程中5α-RDA的特異性抑制劑，可作替代方案用于治療女性脫發(fā)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)在孕期非那雄胺暴露組的子代雄性小鼠中出現(xiàn)尿道下裂和生殖器官發(fā)育異?，F(xiàn)象。

陰莖結(jié)構(gòu)畸形導(dǎo)致其無法正常與雌性交配，而這些子代的精子生成能力卻并不明確。本研究結(jié)果顯示，非那雄胺暴露組雄性子代的睪丸顯示出較少的生精小管數(shù)與增加的間質(zhì)間隙和生精小管管腔空間，并且其管腔中成熟精子數(shù)極低，提示，非那雄胺暴露組雄性子代的精子發(fā)育產(chǎn)生缺陷。隨后本研究對孕期非那雄胺暴露影響子代雄性小鼠生育能力的細(xì)胞發(fā)育機(jī)制進(jìn)行了研究。Sertoli細(xì)胞是為發(fā)育中的精子提供保護(hù)和營養(yǎng)的細(xì)胞，精子發(fā)育的各個階段都是發(fā)生在Sertoli細(xì)胞表面[15-16]。Leydig細(xì)胞是分泌雄性激素的內(nèi)分泌細(xì)胞，主要調(diào)節(jié)雄性性器官的發(fā)育和成熟，維持雄性第二性特征，并在精子發(fā)生中起到重要作用[17-18]。本研究結(jié)果顯示，非那雄胺暴露組子代雄性小鼠中Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞都普遍減少。Dhh在雄性性腺分化中起作用[19]，研究表明，Dhh缺陷與部分性腺發(fā)育不全有關(guān)[20]。在睪丸中，Dhh作為精母細(xì)胞活化因子起作用，對于睪丸發(fā)育至關(guān)重要[21]。本研究還發(fā)現(xiàn)，非那雄胺暴露組子代雄性小鼠睪丸中生精小管細(xì)胞caspase-3陽性信號增加，生精小管細(xì)胞Dhh陽性信號與增殖標(biāo)志物Ki67陽性信號降低，精母細(xì)胞減少。這些研究結(jié)果提示，非那雄胺暴露組子代雄性小鼠睪丸中維持精子發(fā)生與發(fā)育相關(guān)的生精小管細(xì)胞受損，其凋亡水平增加，而生長水平降低，進(jìn)一步說明孕期非那雄胺暴露可抑制子代雄性小鼠的精子生成。而有研究報道，在不育癥人群中，接受非那雄胺治療者在停藥后精子計數(shù)較治療前顯著升高[22]，與之相關(guān)的有關(guān)非那雄胺對成熟性腺中精子生成產(chǎn)生影響的機(jī)制尚不明了。本研究結(jié)果提示孕期非那雄胺暴露可能通過導(dǎo)致子代雄性的性器官發(fā)育異常，進(jìn)而影響精子發(fā)生與發(fā)育，而孕期非那雄胺暴露是否對雄性胎鼠在性腺發(fā)育過程中產(chǎn)生影響，還需要進(jìn)一步研究。

Figure 3. The effects of finasteride exposure during pregnancy on testicular development in offspring male mice. A, B: gross dissection of the lower abdomen and genital region of offspring male mice; C, D: representative macroscopic images of isolated testes of offspring male mice; E, F: representative HE staining images of testicular tissues of offspring male mice; G, H: representative PAS staining images of seminiferous tubules of offspring male mice. The black dashed line separating luminal space of seminiferous tubule; I～M: statistical results of testicular development including testicular length (I), seminiferous tubule count (J), relative luminal space size of seminiferous tubules (K), relative interstitial space size of testises (L), relative mature spermatozoa count of seminiferous tubules (M). Black arrow indicates testis; green arrow indicates penis. Mean±SD.**P<0.01vscontrol group.

圖3 孕期非那雄胺暴露對子代雄性小鼠睪丸發(fā)育的影響

綜上所述，本研究目前結(jié)果顯示，孕期非那雄胺暴露可導(dǎo)致子代成年雄性小鼠性器官發(fā)育異常與精子發(fā)生，這一研究結(jié)果為DSD的病因提供了新的研究方向，并且提示，孕期應(yīng)盡量避免非那雄胺接觸。

Figure 4. The effects of finasteride exposure during pregnancy on spermatogenesis in offspring male mice. Mean±SD.**P<0.01vscontrol group.

圖4 孕期非那雄胺暴露對子代雄性小鼠精子生成的影響

[9] Drobnis EZ, Nangia AK. 5α-Reductase inhibitors (5ARIs) and male reproduction[J]. Adv Exp Med Biol, 2017, 1034:59-61.

[10] Hu AC, Chapman LW, Mesinkovska NA. The efficacy and use of finasteride in women: a systematic review[J]. Int J Dermatol, 2019, 58(7):759-776.

[11] Bowman CJ, Barlow NJ, Turner KJ, et al. Effects of in utero exposure to finasteride on androgen-dependent reproductive development in the male rat[J]. Toxicol Sci, 2003, 74(2):393-406.

[12] Rodriguez E Jr, Weiss DA, Yang JH, et al. New insights on the morphology of adult mouse penis [J]. Biol Reprod, 2011, 85(6):1216-1221.

[13] Kurzrock EA, Jegatheesan P, Cunha GR, et al. Urethral development in the fetal rabbit and induction of hypospadias: a model for human development [J]. J Urol, 2000, 164(5):1786-1792.

[14] 張干林， 張金明. 尿道下裂病因?qū)W研究進(jìn)展[J]. 中華小兒外科雜志, 2014, 35(3):230-232.

[15] 陳秀芳, 金麗琴, 董敏, 等. 葛根素對糖尿病大鼠睪丸的保護(hù)作用[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(10):2033-2039.

[16] Ghaffari R, Di Bona KR, Riley CL, et al. Copper transporter 1 (CTR1) expression by mouse testicular germ cells, but not Sertoli cells, is essential for functional spermatogenesis[J]. PLoS One, 2019,14(4):e215522.

[17] 林中民, 王芳, 張泉波, 等. 姜黃素衍生物B06對2型糖尿病大鼠睪酮合成的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(2):352-358.

[18] 劉素嬛, 王忠山, 許宗革, 等.青春期糖尿病大鼠生殖腺內(nèi)5α-還原酶(2型)的基因表達(dá)[J]. 中國病理生理雜志, 2004, 20(9):1580-1582.

[19] Martin LJ. Cell interactions and genetic regulation that contribute to testicular Leydig celldevelopment and differentiation[J]. Mol Reprod Dev, 2016, 83(6): 470-487.

[20] Paris F, Flatters D, Caburet S, et al. A novel variant of DHH in a familial case of 46, XY disorder of sex development: insights from molecular dynamics simulations[J]. Clin Endocrinol (Oxf), 2017, 87(5):539-544.

[21] O′Hara WA, Azar WJ, Behringer RR, et al. Desert hedgehog is a mammal-specific gene expressed during testicular and ovarian development in a marsupial[J]. BMC Dev Biol, 2011, 11:72.

[22] Samplaski MK, Lo K, Grober E, et al. Finasteride use in the male infertility population: effects on semen and hormone parameters[J]. Fertil Steril, 2013, 100(6):1542-1546.