李金晶，薛勁松，蔣 沁，徐英男

0 引言

角膜膠原交聯(lián)術(shù)(corneal collagen cross-linking，CXL)是一種針對原發(fā)或繼發(fā)性圓錐角膜等角膜疾病的新療法[1]。角膜基質(zhì)主要由大量排列規(guī)則的膠原纖維組成，正常情況下，這些膠原纖維與相鄰膠原之間存在著相互連接，為角膜基質(zhì)提供一定的機(jī)械強(qiáng)度，而在圓錐角膜患者中，膠原間的相互連接減少，角膜機(jī)械強(qiáng)度減弱。Wollensak等[2]首次提出，通過角膜膠原交聯(lián)治療可使角膜強(qiáng)度增加，形態(tài)穩(wěn)定，有效阻止或延緩圓錐角膜的進(jìn)展。此外，膠原交聯(lián)還可增加膠原纖維的直徑，提高角膜基質(zhì)對多種降解酶的抵抗作用。

核黃素作為光敏劑，在角膜膠原交聯(lián)中起到非常重要的作用：核黃素在370nm波長的紫外線照射下會(huì)產(chǎn)生單線態(tài)氧和活性氧，后者與各種分子間相互反應(yīng)，誘導(dǎo)膠原纖維的氨基之間發(fā)生化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而增加角膜機(jī)械強(qiáng)度、滯后量、阻力因子等生物力學(xué)特性。核黃素還可以使紫外線的能量在透過角膜時(shí)得以衰減，使角膜組織對紫外線的吸收率從32%提到至95%[3]，在核黃素存在時(shí)僅有7%的UVA能通過角膜[4]。

1 角膜膠原交聯(lián)術(shù)的臨床應(yīng)用及進(jìn)展

角膜膠原交聯(lián)術(shù)主要包括兩個(gè)步驟，一是將核黃素滲透到角膜膠原內(nèi)；二是紫外線照射治療。通過改變核黃素的浸入方式和照射能量等條件可對經(jīng)典的去上皮角膜膠原交聯(lián)術(shù)做出改良。

1.1加速交聯(lián)法經(jīng)典去上皮角膜膠原交聯(lián)通常在去上皮后使用0.1%核黃素液滴眼，370nm波長的UVA照射30min，輻照度為3mW/cm2(能量劑量5.4J/cm2)。已有文獻(xiàn)證實(shí)，經(jīng)典去上皮角膜膠原交聯(lián)可有效穩(wěn)定圓錐角膜的進(jìn)展，提高患者視力[5-8]。但經(jīng)典去上皮角膜交聯(lián)方法耗時(shí)較長，存在患者依從性不佳等問題。Bunsen-Roscoe互易定律指出，無論施加的輻照度和時(shí)間如何，紫外光的光化學(xué)生物效應(yīng)與所傳遞的總能量劑量成正比[9]。加速交聯(lián)法(accelerated CXL)作為一種改良方式，即在UVA交聯(lián)的背景下，遞送相同能量劑量，通過施加更高的輻照度來縮短治療時(shí)間，加速交聯(lián)在阻止角膜擴(kuò)張的進(jìn)展方面是安全有效的[10]。

大量臨床文獻(xiàn)對不同能量強(qiáng)度和不同照射時(shí)間的加速交聯(lián)方案進(jìn)行了對比。Jeremy等[11]在對體外組織的角膜交聯(lián)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Bunsen-Roscoe互易定律僅在照射強(qiáng)度40～45mW/cm2以內(nèi)有效，照射時(shí)間需超過2min。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包含了10組不同的能量強(qiáng)度和照射時(shí)間的對比，總能量劑量均為5.4J/cm2，與經(jīng)典方法一致。當(dāng)加速交聯(lián)的能量強(qiáng)度在40～45mW/cm2以內(nèi)時(shí)，可以觀察到與經(jīng)典交聯(lián)等效的楊氏模量增加。對比研究使用6mW/cm2照射15min、9mW/cm2照射10min、20mW/cm2照射4.5min、34mW/cm2照射2.65min、45mW/cm2照射2min的5組實(shí)驗(yàn)中，楊氏模量增加值與3mW/cm2照射30min的經(jīng)典交聯(lián)法相似，說明以上加速交聯(lián)方案可達(dá)到與經(jīng)典交聯(lián)治療的類似效果；而當(dāng)能量強(qiáng)度超過50mW/cm2，即照射時(shí)間短于2min時(shí)，并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上楊氏模量的增加。證明能量強(qiáng)度并非越高越好，而是有一定的限度。這可能是由于加速交聯(lián)中高通量的照射治療會(huì)影響氧氣在基質(zhì)中的滲透，從而改變經(jīng)典交聯(lián)中基質(zhì)共價(jià)鍵合成的有效性和治療的生物力學(xué)效率[12]。氧氣在角膜中的分布并不均勻，角膜各層的透氧性不同，氧氣通過角膜組織層的擴(kuò)散是一個(gè)時(shí)間依賴的過程[13]。Kamaev等[14]在經(jīng)典交聯(lián)法中測量了100μm深度下氧氣的滲透作用，發(fā)現(xiàn)在前10～15s，該層的氧氣濃度迅速下降，而在10min后隨著氧氣在組織中的滲透擴(kuò)散，氧濃度逐漸上升。加速交聯(lián)縮短了操作時(shí)間，從而減少了氧在角膜中的滲透時(shí)間，影響了交聯(lián)反應(yīng)的有效性。

Tomita等[15]使用30mW/cm2強(qiáng)度照射3min的加速交聯(lián)在遠(yuǎn)視力及角膜曲率扁平化方面可達(dá)到與經(jīng)典交聯(lián)相似的效果。Kymionis等[16]使用9mW/cm2強(qiáng)度照射10min發(fā)現(xiàn)經(jīng)典交聯(lián)的治療深度大于加速交聯(lián)。當(dāng)總能量劑量調(diào)整為126J/cm2時(shí)，使用9mW/cm2強(qiáng)度照射14min[17]和18mW/cm2強(qiáng)度照射7min[18]均觀察到與經(jīng)典治療的交聯(lián)線深度無差異，證明不同總能量劑量條件下的加速治療方案也可以達(dá)到與經(jīng)典交聯(lián)相似的效果。

1.2跨上皮交聯(lián)經(jīng)典角膜膠原交聯(lián)術(shù)在手術(shù)中需要去除中央8mm范圍內(nèi)的角膜上皮，術(shù)后有可能出現(xiàn)角膜上皮愈合遲緩、haze、角膜感染的風(fēng)險(xiǎn)，且上皮的缺失可能導(dǎo)致患者術(shù)后2～3d出現(xiàn)角膜刺激癥狀。

Lorelei等[19]首次提出了使用丁卡因破壞角膜上皮細(xì)胞間的緊密連接，而保留角膜上皮的交聯(lián)方法(transepithelial cornealcollagen cross-linking，TECXL)。術(shù)前使用丁卡因和核黃素溶液每隔5min滴眼一次，持續(xù)15min，兩種溶液滴眼之間等待1min。使用丁卡因滴眼替代去上皮操作可使核黃素進(jìn)入基質(zhì)，使大分子穿透上皮細(xì)胞。術(shù)中則將丁卡因和核黃素溶液浸透在兩塊海綿上，每10min將用丁卡因浸泡的海綿施于角膜表面，同時(shí)每3min將用核黃素浸泡的海綿施于角膜表面，UVA照射(3.0mW/cm2，370nm)，整個(gè)過程持續(xù)30min。

Filippello等[20]設(shè)計(jì)了角膜表面放置硅膠環(huán)，加長核黃素溶液在角膜表面的潴留時(shí)間，并以氨基丁三醇和 EDTA 作為核黃素促滲劑，治療雙眼發(fā)病的20例角膜厚度為380～444μm的圓錐角膜患者，術(shù)后未出現(xiàn)角膜基質(zhì)混濁、感染等副作用，患者的角膜刺激癥狀大大減輕。術(shù)后9mo OCT 檢查發(fā)現(xiàn)Bowman氏膜以下的基質(zhì)術(shù)后較術(shù)前增厚近100μm，術(shù)后18mo裸眼視力、最佳矯正視力、模擬角膜K值、角膜頂點(diǎn)屈光力以及高階像差等指標(biāo)均有明顯改善。

Wollensak等[21]對14只金吉拉兔分別施行跨上皮角膜膠原交聯(lián)和經(jīng)典去角膜上皮膠原交聯(lián)，結(jié)果顯示去上皮組楊氏模量增加102.45%，低價(jià)促滲劑的跨上皮組楊氏模量增加21.30%。組織形態(tài)學(xué)顯示在去上皮組角膜全層都存在細(xì)胞和內(nèi)皮的缺失，而跨上皮組在接近200μm內(nèi)有角膜細(xì)胞不均勻的缺失。該結(jié)果表明促滲劑聯(lián)合跨上皮膠原交聯(lián)改變角膜生物力學(xué)的效果僅為經(jīng)典去上皮膠原交聯(lián)的近1/5，分析認(rèn)為即使增加了促滲劑，但核黃素在角膜內(nèi)的彌散程度還是明顯弱于去上皮組。

除促滲劑幫助核黃素導(dǎo)入角膜基質(zhì)外，采用低滲核黃素溶液或者等滲核黃素溶液離子導(dǎo)入的方式是臨床上開展的另一種跨上皮交聯(lián)的方法。離子導(dǎo)入角膜膠原交聯(lián)術(shù)(iontophoresis corneal collagen cross linking，I-CXL)是利用電泳效應(yīng)使攜帶核黃素的緩沖鹽在電場中運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)核黃素在角膜中彌散，增加基質(zhì)核黃素，從而增加交聯(lián)效應(yīng)。離子導(dǎo)入方法為將電極貼置于前額正中，罩杯置于角膜正中，抽吸負(fù)壓吸引空針使罩杯吸附于角膜表面，將核黃素注入罩杯內(nèi)，通電后導(dǎo)入核黃素。Mastropasqua等[22]觀察比較了低滲CXL與I-CXL 5min組、I-CXL 10min組之間的早期療效。低滲組采用低滲核黃素點(diǎn)眼30min，離子導(dǎo)入組分別導(dǎo)入 5、10min，導(dǎo)入結(jié)束后使用與低滲CXL相同的紫外光照射儀，能量強(qiáng)度為10mW/cm2，照射時(shí)間為9min。術(shù)后1wk觀察，低滲CXL組分界線深度為152.7±42.9μm，I-CXL 5min 組分界線深度為213.6±42.3μm，I-CXL 10min組分界線深度為237.0±46.4μm；隨訪6mo后，UDVA、CDVA、Kmax在三組中基本保持穩(wěn)定或有一定改善，其中以I-CXL 10min組的CDVA變化最顯著，這可能是因?yàn)殡x子導(dǎo)入組中的角膜基質(zhì)核黃素濃度較低滲組高。

1.3 CXL在薄角膜中的應(yīng)用UVA照射在核黃素的保護(hù)下，角膜細(xì)胞毒性輻照度水平僅為0.5mW/cm2，而無核黃素保護(hù)下的UVA照射，細(xì)胞毒性輻照度高為5mW/cm2，前者僅為后者的十分之一。在人角膜中使用核黃素-UVA聯(lián)合方法(表面輻照度為3mW/cm2)可將角膜損傷深度控制在角膜前300μm厚度以內(nèi)[23]。Wollensak等[2]在一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中表明，角膜內(nèi)皮細(xì)胞毒性UVA劑量低于0.65J/cm2是行核黃素-UVA治療的安全劑量，在厚度大于350μm的角膜表面，使用的UVA照射劑量為3.6J/cm2(3mW/cm2，照射30min)，此時(shí)到達(dá)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的UVA照射劑量僅為0.54J/cm2，并認(rèn)為該劑量是能產(chǎn)生有效機(jī)械加強(qiáng)效果并增加對酶消化的抵抗力的最低劑量,350μm也被認(rèn)為是角膜膠原交聯(lián)術(shù)的角膜安全厚度[24]。

經(jīng)典角膜膠原交聯(lián)術(shù)的適應(yīng)證為去除角膜上皮后角膜厚度大于400μm，源于紫外線照射對角膜內(nèi)皮的損傷，但是在臨床上很多圓錐角膜及LASIK術(shù)后角膜膨隆患者的角膜厚度達(dá)不到這一要求。為避免這種限制，Hafezi等[25]針對薄角膜患者提出另一種替代治療方案，即低滲核黃素溶液配合UVA照射治療。使用低滲核黃素溶液可使角膜厚度增加到400μm，可治療角膜最小基質(zhì)厚度為320μm[26-27]，因此在核黃素-UVA處理之前應(yīng)對角膜厚度進(jìn)行測量，以確定不適合的病例。

分界線表示淺層交聯(lián)區(qū)與深層未交聯(lián)區(qū)的界限，代表圓錐角膜CXL治療中的有效深度，這可以作為觀測交聯(lián)深度的重要指標(biāo)之一。在經(jīng)典交聯(lián)治療后最早2wk左右，可以發(fā)現(xiàn)在角膜300μm處出現(xiàn)一條分界線，在裂隙燈處或使用前段光學(xué)相干斷層掃描(AS-OCT)檢測角膜基質(zhì)分界線，其在交聯(lián)后的前3mo最明顯。Caporossi等[28]對人眼交聯(lián)術(shù)后進(jìn)行了共聚焦顯微鏡觀察，通過識別270～330μm深度的明顯垂直和橫向過渡區(qū)域，檢測到有效治療深度，在分界線之前觀察到角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡。發(fā)現(xiàn)前基質(zhì)層(手術(shù)治療區(qū)域)表現(xiàn)為僅有少量角膜細(xì)胞核和水腫反射率，而后基質(zhì)層(未治療區(qū)域)顯示常規(guī)角膜細(xì)胞群和正常反射率。治療后基質(zhì)的角質(zhì)細(xì)胞再增殖于術(shù)后1mo開始，并于術(shù)后6mo結(jié)束，術(shù)后6mo角膜內(nèi)皮顯示出規(guī)則的形態(tài)。蘇云娟等[29]在對CXL術(shù)后患者角膜微結(jié)構(gòu)變化的觀察中發(fā)現(xiàn)，術(shù)后12mo基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量幾乎恢復(fù)至術(shù)前水平，術(shù)后角膜基質(zhì)層后部細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的大小及形態(tài)未受影響。

基質(zhì)線的深度取決于核黃素溶液的濃度和UVA的強(qiáng)度。已有文獻(xiàn)指出，根據(jù)擴(kuò)散梯度，核黃素濃度隨著角膜深度的增加而呈線性下降[30]。在基質(zhì)前部濃度最高，施用核黃素30min后濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，并在深層基質(zhì)中呈線性降低[31]。CXL效應(yīng)主要取決于UVA照射的強(qiáng)度，在較小程度上取決于核黃素的濃度，65%的UVA在角膜基質(zhì)前200μm內(nèi)被吸收，所以在角膜基質(zhì)前200～250μm中硬化效果最大[32]。

Gu等[33]觀察了早期薄角膜病變患者施行該術(shù)后的角膜并發(fā)癥及其變化。術(shù)中使用的低滲核黃素溶液是通過生理鹽水稀釋0.5%維生素B2-核黃素-5-磷酸所得。去上皮后采用370nm波長的UVA照射直徑9mm區(qū)域內(nèi)的角膜，能量密度為3.0mW/cm2。低滲核黃素每隔3min施用于角膜，持續(xù)30min，以維持核黃素在角膜基質(zhì)中的飽和度。納入患者6例8眼的數(shù)據(jù)進(jìn)行研究分析：術(shù)前的平均角膜厚度(MTCT)為408.5±29.0μm，去上皮后MTCT為369.8±24.8μm。施用低滲核黃素后，MTCT增加至445.0±26.5μm，與術(shù)前參數(shù)相差不大。術(shù)后3mo圓錐角膜頂端的平均K值下降，BCVA平均值增加，平均內(nèi)皮細(xì)胞密度(ECD)下降，未發(fā)現(xiàn)角膜基質(zhì)感染及其他并發(fā)癥。

有文獻(xiàn)指出，為了保護(hù)內(nèi)皮免受非常高的照射強(qiáng)度，在角膜厚度小于400μm表面上最薄的部位，不去除上皮細(xì)胞的跨上皮角膜交聯(lián)[34]。但可能導(dǎo)致沒有足量的核黃素滲透入角膜深部，從而不會(huì)形成明確的交聯(lián)分界線。另有文獻(xiàn)提出，可將核黃素濃度增加至0.2%，使UVA在角膜前基質(zhì)更加充分地吸收，從而減少對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[18]。

1.4 CXL聯(lián)合手術(shù)準(zhǔn)分子激光上皮瓣下角膜磨鑲術(shù)(laserinsitukeratomileusis,LASIK)是目前常用于激光矯正視力的手術(shù)方法之一，首先通過飛秒激光或使用角膜板層刀制作一個(gè)角膜瓣，掀開后在暴露的角膜基質(zhì)床上進(jìn)行準(zhǔn)分子激光切削，以達(dá)到矯正視力的目的。LASIK術(shù)具有精確度高、安全有效等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也會(huì)存在屈光回退和術(shù)后角膜膨隆等并發(fā)癥，影響患者視覺質(zhì)量。因此，有學(xué)者提出應(yīng)用聯(lián)合角膜交聯(lián)術(shù)對LASIK術(shù)后角膜膨隆進(jìn)行治療，旨在延緩角膜膨隆病情進(jìn)展的同時(shí)對患眼進(jìn)行屈光重建，從而提高患者的視覺質(zhì)量。

角膜膠原交聯(lián)術(shù)主要作用于角膜前基質(zhì)層，即是LASIK術(shù)中角膜被切削的部分。已有研究證實(shí)，角膜交聯(lián)術(shù)對于治療LASIK術(shù)后角膜膨隆具有肯定的效果[35-36]，聯(lián)合治療術(shù)后UCVA顯著提高，Kmax值顯著降低，證明了該方法的有效性。在與單純行LASIK術(shù)的對照中發(fā)現(xiàn)，CXL聯(lián)合LASIK手術(shù)對于屈光不正的患者具有更好的療效，優(yōu)于單純LASIK治療組[37]。在對近視患者的預(yù)防性治療中，CXL聯(lián)合LASIK術(shù)可以有效地預(yù)防屈光回退和潛在的角膜擴(kuò)張[36]，且術(shù)后角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量與術(shù)前相比并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證明了該手術(shù)方法的安全性。但是當(dāng)前對于聯(lián)合手術(shù)的研究較少，觀察時(shí)間較短，其長期療效與生物力學(xué)的評價(jià)有待進(jìn)一步的研究。

2 總結(jié)及展望

角膜膠原交聯(lián)術(shù)經(jīng)典方法耗時(shí)較長，可能存在角膜上皮愈合不良、感染等術(shù)后并發(fā)癥，近年來已有多項(xiàng)研究對經(jīng)典方式進(jìn)行了改良。

加速交聯(lián)法可取得與經(jīng)典去上皮法相同的治療深度，但總照射劑量的個(gè)性化選擇以及照射能量和照射時(shí)間的優(yōu)化匹配，以及在安全性和有效性上還需要進(jìn)一步的長期觀察。為了提高核黃素的浸潤效率以及加快核黃素的浸潤時(shí)間，各種促滲劑及促滲方法的運(yùn)用實(shí)現(xiàn)了保留角膜上皮的跨上皮角膜膠原交聯(lián)，但是目前其改變角膜生物力學(xué)的效果與經(jīng)典去上皮角膜膠原交聯(lián)還有一定的差距，并不作為圓錐角膜的常規(guī)治療方案。該治療方法使角膜細(xì)胞的損傷位于角膜前200μm基質(zhì)，減少了去上皮所致的術(shù)后并發(fā)癥，如何提高交聯(lián)的療效對于跨上皮角膜交聯(lián)還需要長期進(jìn)一步改良和優(yōu)化。對角膜厚度薄于400μm的圓錐角膜患者多采用低滲核黃素配合UVA治療，如何進(jìn)行有效的角膜角膜交聯(lián)，既保護(hù)好內(nèi)皮細(xì)胞，又能增強(qiáng)角膜的生物力學(xué)，延緩圓錐角膜的病情，為將來驗(yàn)配RGP或選擇深板層角膜移植提供有力的支撐，也是角膜膠原交聯(lián)改良術(shù)式未來發(fā)展的趨勢。CXL聯(lián)合LASIK手術(shù)治療可以有效預(yù)防單純LASIK術(shù)后出現(xiàn)的角膜擴(kuò)張和屈光回退等并發(fā)癥，為角膜交聯(lián)手術(shù)與其他手術(shù)方式的聯(lián)合應(yīng)用提供了新的治療思路。