李泉，王占聚，孟潔，高文風(fēng)，王愛紅，陳蕾

濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濰坊 261031

淋巴瘤(NHL)是常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，近年發(fā)病呈逐漸上升的趨勢(shì)，傳統(tǒng)的治療方案不能獲得滿意的治療效果，目前迫切需要新的治療策略[1,2]。三七總皂苷(PNS)是中藥五加科人參屬植物三七的主要成分，含有多種單體皂苷，具有擴(kuò)血管、降低心肌耗氧量、抗炎以及抗氧化等作用[3,4]。近年來，PNS的抗腫瘤作用備受關(guān)注，有研究證實(shí)其可抑制肝癌、直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖，然而有關(guān)PNS對(duì)NHL細(xì)胞的影響報(bào)道較少。2018年1月～2019年2月，我們選用Raji細(xì)胞系為研究對(duì)象，探討不同劑量PNS對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等方面的影響，并檢測(cè)VEGF以及PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的變化是否為其可能機(jī)制，以期為NHL的治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、試劑 人NHL Raji細(xì)胞系購于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。PNS購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗購自Invitrogen公司；MTT試劑盒、Annexin-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海生工生物工程公司；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司，引物由上海賽百盛生物公司合成；PI3K-p85、p-AKT、p-mTOR、β-actin以及HRP標(biāo)記的二抗購自CST公司；蛋白裂解液、脫脂奶粉、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒以及顯色試劑盒購自碧云天生物科技公司。

1.2 Raji細(xì)胞系培養(yǎng)、分組及PNS干預(yù)方法 Raji細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，并將細(xì)胞分為PNS低、中、高濃度組及陰性對(duì)照組，PNS低、中、高濃度組分別加入終濃度為100、200、400 μg/mL的PNS溶液，陰性對(duì)照組加入細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.3 Raji細(xì)胞系增殖抑制率測(cè)算方法 采用MTT法。將細(xì)胞以1×104/孔的密度接種于96孔板中(200 μL/孔)，不同濃度PNS作用24、48、72 h，后每孔中加入20 μL的MTT(5 mg/mL)，孵育4 h后棄去上清液，加入200 μL的DMSO，酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm處吸光度(OD)值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%，其中PNS低、中、高濃度組為實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組設(shè)定對(duì)照組。

1.4 Raji細(xì)胞系凋亡率測(cè)算方法 采用流式細(xì)胞技術(shù)。正常條件下孵育細(xì)胞，不同濃度PNS作用作用24、48、72 h，后收集細(xì)胞，PBS輕洗3次后以195 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC試劑，4 ℃避光孵育30 min，離心棄上清，加入190 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入10 μL PI混勻，4 ℃避光孵育5 min，1 h內(nèi)送檢分析，采用Cell Quest軟件分析細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)。

1.5 Raji細(xì)胞系VEGF mRNA檢測(cè)方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。不同濃度PNS作用24、48、72 h后，TRIzol法抽提總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明制備cDNA，以cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×SYBR Premix ExTaqTM12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足體積至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃、30 s，50 ℃、30 s，72 ℃、45 s，共30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后再72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后分析擴(kuò)增曲線、熔解曲線和CT值，將待測(cè)基因以及內(nèi)參β-actin的Ct值代入公式2-ΔΔCt公式進(jìn)行計(jì)算，分析待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列：VEGF上游引物5′-AGGGCAGAATCATCACGAAGT-3′，下游引物5′-AGGGTCTCGATTGGATGGCA-3′；β-actin上游引物5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′，下游引物5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′。

1.6 Raji細(xì)胞系PI3K-AKT-mTOR蛋白檢測(cè)方法 采用Western blotting法。不同濃度PNS作用48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白并測(cè)定蛋白濃度。細(xì)胞蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入PI3K-p85(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)以及p-mTOR(1∶1 000)抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TPST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影、定影后將膠片拍照，以β-actin作內(nèi)參照，Bio-Rad成像分析軟件計(jì)算目的蛋白灰度比值，分析細(xì)胞信號(hào)通路的變化。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)點(diǎn)各組細(xì)胞增殖抑制率比較 不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率比較見表1。

表1 不同時(shí)點(diǎn)各組細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與PNS低濃度組比較，aP<0.05；與PNS中濃度組比較，bP<0.05；與同組24 h比較，cP<0.05；與同組48 h比較，dP<0.05。

2.2 不同時(shí)點(diǎn)各組細(xì)胞凋亡率比較 不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡率見表2。

表2 不同時(shí)點(diǎn)各組細(xì)胞凋亡率比較

注：與PNS低濃度組比較，aP<0.05；與PNS中濃度組比較，bP<0.05；與同組24 h比較，cP<0.05；與同組48 h比較，dP<0.05。

2.3 不同時(shí)點(diǎn)各組VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 不同時(shí)點(diǎn)VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較見表3。

表3 不同時(shí)點(diǎn)各組VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與PNS低濃度組比較，aP<0.05；與PNS中濃度組比較，bP<0.05；與同組24 h比較，cP<0.05；與同組48 h比較，dP<0.05。

2.4 藥物作用48 h各組PI3K-AKT-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 藥物作用48 h PI3K-AKT-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見表4。

表4 藥物作用48 h各組PI3K-AKT-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與PNS低濃度組比較，aP<0.05；與PNS中濃度組比較，bP<0.05。

3 討論

NHL是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，臨床主要表現(xiàn)為無痛性淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大等，全身各組織器官均可受累[2]。目前，NHL的治療以化療方案為主，環(huán)磷酰胺、柔紅霉素、長(zhǎng)春新堿和潑尼松組成了經(jīng)典的CHOP化療方案[5]。近年來，新型方案不斷出現(xiàn)，如利妥昔單抗可有效提高NHL患者的緩解率。Galiximab(抗CD80抗體)單用或與利妥昔單抗聯(lián)合應(yīng)用可對(duì)各種NHL細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤活性[6]。蛋白酶體抑制劑和免疫調(diào)節(jié)藥物如硼替佐米和來那度胺，已經(jīng)證實(shí)在NHL的治療中具有良好療效。但上述治療策略均存在不足，部分患者對(duì)治療方案無反應(yīng)或接受治療后復(fù)發(fā)，因此尋找新的NHL治療策略成為當(dāng)務(wù)之急。Raji細(xì)胞系即NHL細(xì)胞，也稱黑人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞，是常用于基礎(chǔ)研究的NHL細(xì)胞[7]。

PNS是從中藥三七中提取出的一組有效成分，具有活血祛淤、通脈止血、保護(hù)脊髓、視神經(jīng)及心腦缺血性損傷等作用，在臨床中得到廣泛的應(yīng)用[8]。研究證實(shí)，PNS可以通過抗炎和免疫調(diào)節(jié)的途徑發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[9]。有學(xué)者應(yīng)用PNS治療慢性阻塞性肺病以及肝纖維化等疾病，均取得良好的效果[10,11]。近年來，有關(guān)PNS抗腫瘤作用備受關(guān)注，有研究證實(shí)其可通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性、促進(jìn)細(xì)胞自噬、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多種方式起到抗腫瘤作用[3,12,13]，目前已證實(shí)PNS可明顯抑制宮頸癌、乳腺癌以及結(jié)直腸癌等腫瘤細(xì)胞的增殖[14,15]。然而有關(guān)PNS治療NHL方面的報(bào)道較少，尤其是涉及PNS抗腫瘤的具體分子機(jī)制目前尚不明確。本文結(jié)果顯示，PNS能顯著抑制體外培養(yǎng)Raji細(xì)胞系增殖，且具有濃度和時(shí)間依賴性，隨著PNS濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，Raji細(xì)胞系增殖抑制率也明顯增高；PNS可促進(jìn)Raji細(xì)胞系凋亡，且隨著作用濃度和作用時(shí)間的增加，細(xì)胞凋亡率顯著升高。上述結(jié)果證實(shí)，PNS可抑制Raji細(xì)胞系增殖并促進(jìn)其凋亡，提示PNS對(duì)NHL可能具有一定治療作用。

本研究進(jìn)一步檢測(cè)了PNS作用后NHL細(xì)胞VEGF、PI3K-p85、p-AKT、p-mTOR變化。VEGF是一種重要的多功能血管生成因子，具有強(qiáng)大的促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用，可通過刺激毛細(xì)血管增生而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，其表達(dá)活性與腫瘤的發(fā)展與發(fā)展有密切關(guān)系[16,17]。有研究[18]表明，VEGF在NHL Raji細(xì)胞系中呈高表達(dá)現(xiàn)象并在炎癥因子TNF-α的輔助下促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。PI3K-p85、p-AKT以及p-mTOR均為PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路蛋白，此通路廣泛存在于各種真核細(xì)胞內(nèi)，在腫瘤細(xì)胞中多呈高度活化狀態(tài)，可通過磷酸化多種底物而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[19～21]。有學(xué)者證實(shí)，PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路在NHL中存在異?；罨那闆r[22]，通過特異性信號(hào)通路抑制劑抑制此通路活性，可抑制NHL的發(fā)展[23,24]。有研究[14,25]證實(shí)，PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路可通過VEGF促使腫瘤微血管形成并促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本文結(jié)果證實(shí)，PNS作用于Raji細(xì)胞系后，細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)水平以及PI3K-p85、p-AKT、p-mTOR蛋白活性均顯著下降，提示PNS可能通過PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路抑制VEGF表達(dá)抑制NHL的發(fā)展。

總之，PNS能抑制NHL Raji細(xì)胞系的增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能與其可通過PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路抑制VEGF表達(dá)而完成，其在NHL治療中具有一定的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步深入研究。