姚蓉飛，劉鵬，任秋月，周勝男，常柏

1天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院，天津 300134；2天津市內(nèi)分泌研究所；3國家健康委員會激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4天津醫(yī)科大學(xué)；5天津中醫(yī)藥大學(xué)；6泰達(dá)國際心血管病醫(yī)院

隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，糖尿病的患病率呈現(xiàn)迅猛增長趨勢，其中2型糖尿病(T2DM)約占糖尿病患者的90%。大血管病變是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致糖尿病患者致殘和致死的主要原因。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，就有可能改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況，從而延緩糖尿病大血管病變的發(fā)生和發(fā)展。以往大量研究證實(shí)，他汀類藥物在抗血管炎癥、抗血栓、抗氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能及抗凋亡等有顯著效果[1]。周衛(wèi)鳳等[2]通過建立體外高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)，但其作用機(jī)制尚不明確。糖尿病大血管病變主要涉及心、腦血管等，因此本研究選取糖尿病大鼠胸主動脈為研究對象。本研究通過制備大鼠T2DM模型，并灌胃給予辛伐他汀，觀察T2DM大鼠辛伐他汀灌胃治療后胸主動脈壁病理組織學(xué)、細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、ROS表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SD大鼠60只，4周齡，體質(zhì)量(100.3±2.2)g，由天津?qū)嶒?yàn)動物中心提供[動物合格證號：SCXK(津)2014-001]。

1.2 藥物、試劑及儀器 鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；辛伐他汀片購自輝瑞制藥有限公司(10 mg/片，產(chǎn)品批號國藥準(zhǔn)字J20070060)。超純RNA提取試劑盒購自天津生化科技有限公司,大鼠活性氧(ROS)ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。PCR擴(kuò)增儀；5810R臺式低溫高速離心機(jī)；JEM-1230透射電子顯微鏡。

1.3 T2MD模型制備、分組及辛伐他汀灌胃方法 取SD雄性大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機(jī)選取40只大鼠，給予高脂飼料(20%蔗糖+1%膽固醇+10%豬油+5%蛋黃粉+0.2%膽酸鈉+63.8%普通飼料)喂養(yǎng)，8周后采用尾靜脈注射STZ(30 mg/kg)誘導(dǎo)方法制備T2DM模型[3]；制模3 d后，對大鼠尾靜脈采血測血糖，隨機(jī)血糖超過16.9 mmol/L的大鼠視為T2MD大鼠模型成功制備；最終造模成功的大鼠34只，未成模大鼠直接剔除；成模后的T2DM大鼠，按體質(zhì)量、血糖分層隨機(jī)分為辛伐他汀組、模型組各17只。另選取20只大鼠作為正常對照組，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。根據(jù)人鼠等效劑量，辛伐他汀組以1.05 mg/(kg·d)辛伐他汀溶液灌胃1次，模型組和正常對照組每日給予等量無菌飲用水灌胃1次，各組大鼠灌胃時間均為16周。

1.4 大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞透射電鏡病理變化 16周后，各組大鼠以頸椎脫臼處死后，每組解剖7只大鼠，分離胸主動脈組織2 cm左右。標(biāo)本切成0.9 mm3大小，在4 ℃下用2%戊二醛固定后，脫水處理，用環(huán)氧樹脂812浸泡、包埋，經(jīng)檸檬酸鉛雙重染色后切片。在透射電鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞病理改變。

1.5 大鼠胸主動脈Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA檢測方法 每組取10只大鼠處死，取胸主動脈組織，采用Real-time PCR法檢測胸主動脈組織中Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA。用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA。取5 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測RNA的完整性。使用DNase Ⅰ試劑盒對RNA中殘留的基因組DNA進(jìn)行消化處理后，HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。所用引物序列如下：Apaf-1 PCR擴(kuò)增片段長度為149 bp，上游引物5，-TATGCAAGAACTCTGCCATC-3′，下游引物5′-GAATGCCACGTACTCAAGGT-3′；Bcl-2擴(kuò)增片段長度為112 bp，上游引物5′ -TGCCACCTGTGGTCCATCTG-3′，下游引物5′-TGAAGAGTTCCTCCACCA-3′；Bax擴(kuò)增片段長度為129 bp，上游引物5′-TCATCCAGGATCGAGCAG-3′，下游引物5′-CGTGTCCACGTCAGCAATCA-3′；AIF擴(kuò)增片段長度為137 bp，上游引物5，-TAAGCCATACTGGCATCAGTC-3，下游引物5′-ACTCTCCGAACGGATACCAG-3′；Caspase-3擴(kuò)增片段長度為142 bp，上游引物5′-TACTGCCGGAGTCTGACTG-3′，下游引物5′-CTCCAGGAATAGTAACCAGG-3′。應(yīng)用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采取2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

1.6 大鼠胸主動脈ROS檢測方法 處死各組大鼠前1 h，股動脈取血3 mL，使自然凝固后離心，取上層血清，用于酶聯(lián)免疫吸附法檢測。用梯度稀釋的方式加樣，混勻，然后按照ROS ELISA試劑盒使用說明書進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果以O(shè)D值表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞電鏡下變化 正常對照組內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核清晰，形態(tài)完整，有條索樣連接緊密、連續(xù)(圖1a)；模型組內(nèi)皮細(xì)胞可見明顯細(xì)胞核固縮、線粒體腫脹，及內(nèi)皮細(xì)胞碎片(圖1b)；辛伐他汀組較模型組病理損傷較輕，內(nèi)皮細(xì)胞相對連續(xù)，完整，有輕度腫脹，但未見明顯細(xì)胞核固縮(圖1c)。

圖1 各組大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞電鏡下形態(tài)

2.2 各組大鼠胸主動脈Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA及ROS表達(dá)比較 大鼠胸主動脈Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA及ROS表達(dá)比較見表1。

表1 各組大鼠胸主動脈Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA及ROS表達(dá)比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

3 討論

研究[4,5]顯示，糖尿病已成為嚴(yán)重危害我國人民健康的三大慢性疾病之一，而高糖環(huán)境誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是糖尿病導(dǎo)致動脈粥樣硬化病變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。糖尿病大血管病變導(dǎo)致的心、腦、下肢動脈及外周大血管損傷，是糖尿病患者死亡的主要原因。臨床常見心血管疾病包括急性冠狀動脈綜合征，陳舊性心肌梗死、穩(wěn)定性或不穩(wěn)定性心絞痛等，糖尿病都是其獨(dú)立危險因素。而糖尿病導(dǎo)致的以下肢麻木、靜息痛、間歇性跛行、皮溫低等明顯癥狀的下肢血管病變，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。根據(jù)大量臨床試驗(yàn)研究顯示，單純嚴(yán)格控制血糖對糖尿病大血管病變在短期內(nèi)無明顯獲益[6]。

辛伐他汀是糖尿病、心血管不良事件一線預(yù)防藥物，廣泛應(yīng)用于臨床。他汀類藥物含有羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，其能夠有效降低總膽固醇的合成，同時通過促進(jìn)LDL-c的分解，從而降低LDL-c水平。根據(jù)美國糖尿病學(xué)會(ADA)的建議，無論基線低密度脂蛋白膽固醇濃度如何，糖尿病患者和年齡在40～75歲的心血管病史都應(yīng)給予他汀類藥物[7]。一些大規(guī)模的隨機(jī)對照試驗(yàn)證實(shí)，他汀類藥物在預(yù)防糖尿病患者心血管疾病發(fā)病率和病死率方面的功效[8]。一項(xiàng)薈萃研究顯示，他汀類藥物可使糖尿病患者的冠狀動脈事件減少21%，中風(fēng)減少36%[9]。同時臨床試驗(yàn)表明，辛伐他汀能夠有效降低T2DM患者體內(nèi)炎癥因子如白介素-6、腫瘤壞死因子α等的釋放，從而降低其全身炎癥反應(yīng)[10]。任天舒等[11]發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可以有效提升超氧化物歧化酶高活性，從而增強(qiáng)機(jī)體對自由基的能力清除能力，減少氧化形成氧化型低密度脂蛋白生成，減少其對組織的損傷，最終抑制血管斑塊的形成。本研究顯示，在電鏡下，模型組大鼠內(nèi)皮細(xì)胞可見明顯細(xì)胞核固縮、線粒體腫脹；而辛伐他汀組內(nèi)皮細(xì)胞損傷則明顯較模型組輕，內(nèi)皮細(xì)胞相對完整。說明辛伐他汀能夠有效保護(hù)血管內(nèi)皮，延緩糖尿病大血管病變的發(fā)展。

文獻(xiàn)[12]報道，血管內(nèi)皮損傷在糖尿病前期就已存在，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是糖尿病大血管病變的始動因素。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡不僅造成血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的損害，還嚴(yán)重影響內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能，促進(jìn)血管病變的發(fā)生。細(xì)胞凋亡的經(jīng)典通路中，而線粒體通路是最為主要的。當(dāng)細(xì)胞受到一定刺激誘導(dǎo)線粒體通透轉(zhuǎn)換孔開通，引起線粒體外膜透化(MOMP)，后線粒體膜電位(MMP)去極化，MMP的丟失可觸發(fā)線粒體釋放細(xì)胞色素C和膜間蛋白AIF被釋放將進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中[13,14]。AIF在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生AIF線粒體核轉(zhuǎn)位，引起DNA裂解[15～17]。而Apaf-1在細(xì)胞凋亡途徑中通過與細(xì)胞色素C的相互作用，形成凋亡小體，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生標(biāo)志酶Caspase-3的活化引起Caspase級聯(lián)反應(yīng)[18]，進(jìn)而裂解核蛋白、細(xì)胞骨架、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，造成典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。Bcl-2家族蛋白也在細(xì)胞凋亡過程中起到了重要作用。Bcl-2家族蛋白是由促凋亡和抗凋亡兩部分組成，能夠抑制或激活MOMP，從而決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。其中Bcl-2與Bax分別為抑制細(xì)胞凋亡因子和促進(jìn)細(xì)胞凋亡因子，其作用完全相反。Bcl-2作用于線粒體外膜，其抗凋亡作用主要是通過抑制細(xì)胞色素C釋放和Caspases的激活。而Bax作為Bcl-2家族蛋白之一，能夠?qū)е翸OMP促使細(xì)胞凋亡，這可能是由于其構(gòu)象發(fā)生改變造成寡聚化，在線粒體外模形成孔道而產(chǎn)生的。同時Bcl-2能夠直接或間接阻止Bax與MOMP結(jié)合，從而抑制細(xì)胞凋亡。ROS是含氧化合物的總稱。研究發(fā)現(xiàn)，高糖能夠刺激細(xì)胞ROS的生產(chǎn)，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷后，ROS可引起細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，最終誘發(fā)細(xì)胞膜的雙層結(jié)構(gòu)斷裂，促使細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比較，辛伐他汀組Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax mRNA及ROS表達(dá)降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)升高，說明在高糖環(huán)境下辛伐他汀可以有效的下調(diào)促細(xì)胞凋亡基因，升高抑制細(xì)胞凋亡基因表達(dá)水平，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡進(jìn)而延緩T2DM大血管病變發(fā)生發(fā)展。

總之，辛伐他汀可抑制T2DM)大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能為其可下調(diào)Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax mRNA及ROS表達(dá)，上調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)。