張霖，耿慶，范濤，馮浩潔，沈小康

1武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢 430060；2湖北省人民醫(yī)院

肺缺血再灌注損傷(LIRI)是指多種因素導(dǎo)致肺缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流灌注后肺組織損傷加重的現(xiàn)象。LIRI是醫(yī)療中常見的狀況，可見于肺移植、肺動脈血栓剝脫術(shù)、體外循環(huán)等外科手術(shù)和操作[1～3]。LIRI是肺移植術(shù)后出現(xiàn)呼吸衰竭的重要原因，影響肺移植成功率。尋找防治IRI的措施，對提高肺移植成功率及移植后患者的遠期生存率具有重要的臨床意義[4]。香草乙酮(APO)是一種NAPDH氧化酶抑制劑，可通過對微小血管活性氧的抑制，減輕急性肺損傷[5]。APO在創(chuàng)傷誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷模型、大腦中動脈閉塞誘導(dǎo)的小鼠缺血性腦卒中模型、小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中均被證明對相應(yīng)器官有保護作用[6～8]。APO在急性肺損傷模型中的保護作用涉及對NAPDH氧化酶(NOX)的抑制，但其在大鼠在體肺缺血再灌注模型中的作用尚無研究報道。本研究通過建立大鼠LIRI模型，建模前提前靜注APO，觀察APO對LIRI的預(yù)防作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)；Apocynin(Santa Cruz公司)；抗NOX2抗體、抗NOX4抗體(Thermo Fisher公司)；MPO抗體、免疫熒光二抗(Abcam 公司)；MDA試劑盒、SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)；EliVision Super檢測試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；超氧化物陰離子熒光探針(DHE)試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗動物分組、APO靜注方法及LIRI模型制備 SPF級健康雄性SD大鼠24只(由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供)，體質(zhì)量 200～250 g。大鼠均在標準環(huán)境下自由進食、進水。適應(yīng)性飼養(yǎng) 3～4 d后，所有大鼠隨機分為APO組、LIRI組、SO組各8只。APO組大鼠在制模前30 min經(jīng)股靜脈注射10%DMSO溶解的APO(50 mg/kg)[9～11]。APO組和LIRI組均參照楊世疆等[12]的方法制備LIRI模型，即大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉，后將大鼠仰臥固定，消毒氣管周圍皮膚，并行氣管插管；調(diào)節(jié)呼吸機參數(shù)，使呼吸比1.0∶1.5；左胸第4肋間入胸，游離左肺門后，尾靜脈注射肝素300 U/kg，5 min后以無創(chuàng)血管鉗夾閉左肺門，以肺門部血管無收縮、左肺無通氣為阻斷成功的指征；60 min后松開血管鉗，形成再灌注；再灌注120 min。SO組僅游離左肺門，不夾閉，其余同LIRI組。制模120 min時放血處死動物，并取左肺組織。

1.3 肺組織病理觀察及病理評分 取部分左肺組織以4%多聚甲醛固定24 h，進行石蠟包埋；取部分石蠟包埋切片，經(jīng)HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察其病理改變并進行病理評分，評分標準參考Pan等[13]的研究，總共0～9分(正常肺組織計0分，最嚴重損傷的肺組織計9分)。

1.4 肺組織濕干重比(W/D)測算 切取約1/3新鮮左肺組織，無菌生理鹽水沖洗表面，并用濾紙吸干后，立即稱重，作為濕重(W)；將此塊肺組織放入70 ℃干燥箱內(nèi)烘烤48 h后，稱重作為干重(D)；計算W/D。

1.5 肺組織活性氧簇(ROS)檢測 采用DHE法。取部分左肺組織，置于液氮凍存后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存；取部分凍存的肺組織行冰凍切片，復(fù)溫至室溫后，按DHE試劑盒進行操作，熒光顯微鏡觀察肺組織中熒光強度，以平均熒光強度表示大鼠肺組織中ROS水平。

1.6 肺組織MDA、SOD檢測 取部分新鮮左肺組織，制備勻漿，以MDA試劑盒和SOD試劑盒測定，分別用硫代巴比妥酸(TBA)法和水溶性四唑鹽-1(WST-1)法測定MDA和SOD，均按說明書進行操作，兩種指標的結(jié)果分別以濃度(nmol/mg)和活性(U/mg)表示。

1.7 肺組織MPO、TNF-α、IL-1β、IL-6檢測 采用免疫熒光法。選取合適的石蠟包埋切片，經(jīng)脫蠟、水化、孵育、煮片、Ⅰ 抗及Ⅱ抗的結(jié)合、胞核染色、封片。暗室下用正置熒光顯微鏡(×400)觀察TNF-α、IL-1β、IL-6、MPO的表達并拍片。使用專業(yè)圖像分析軟件 Image Pro Plus 6.0 對結(jié)果進行分析和統(tǒng)計。以平均熒光強度表示TNF-α、IL-1β、IL-6的相對表達量，以陽性細胞數(shù)表示MPO的相對表達量。

1.8 肺組織NOX2、NOX4檢測 采用免疫組化法。選取合適的石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、封閉、一抗孵育過夜、二抗孵育、DAB顯色，復(fù)染、脫水、封固后，于正置顯微鏡下(×400)閱片。以組織被染成棕黃色為陽性，使用專業(yè)圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0對結(jié)果進行分析和統(tǒng)計，以積分光密度值(IOD)表示NOX2和NOX4的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織病理變化 SO組肺間質(zhì)及肺泡結(jié)構(gòu)清晰、完整，未見明顯充血、水腫及炎性浸潤；LIRI組肺間質(zhì)水腫增寬，炎癥細胞浸潤，肺泡毛細血管擴張，肺泡內(nèi)可見較多紅細胞滲出，損傷明顯；APO組的上述改變減輕(詳見圖1)。

注：A為SO組，B為LIRI組，C為APO組。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化(HE×200)

2.2 各組肺組織W/D、病理學(xué)評分比較 肺組織W/D、病理學(xué)評分比較見表1。

表1 各組肺組織W/D、病理學(xué)評分比較

注：與SO組比較，*P<0.05；與LIRI組比較，#P<0.05。

2.3 各組肺組織ROS平均熒光強度、MDA濃度、SOD活性、MPO陽性細胞數(shù)比較 肺組織ROS平均熒光強度、MDA濃度、SOD活性、MPO陽性細胞數(shù)比較見表2。

表2 各組肺組織ROS平均熒光強度、MDA濃度、SOD活性、MPO陽性細胞數(shù)比較

注：與SO組比較，*P<0.05；與LIRI組比較，#P<0.05。

2.4 各組肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6平均熒光強度比較 肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6平均熒光強度比較見表3。

表3 各組肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6平均熒光強度比較

注：與SO組比較，*P<0.05；與LIRI組比較，#P<0.05。

2.5 各組肺組織NOX2、NOX4蛋白IOD值比較 肺組織NOX2、NOX4蛋白IOD值比較見表4。

表4 各組肺組織NOX2、NOX4蛋白IOD值

注：與SO組比較，*P<0.05；與LIRI組比較，#P<0.05。

3 討論

缺血再灌注損傷(IRI)是器官在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，在再灌注血流帶來的炎癥細胞、炎癥因子及自由基的作用下，組織損傷加重，甚至發(fā)生不可逆損傷的現(xiàn)象。肺移植、心肺復(fù)蘇和溶栓、介入治療等手術(shù)和操作都可引起LIRI[14]。LIRI的臨床表現(xiàn)類似于急性呼吸窘迫綜合征的急性階段，其特征性表現(xiàn)為微血管通透性增加、肺血管阻力增加、肺動脈高壓以及肺水腫形成等[15]。目前，尚無治療措施被證明可以有效預(yù)防LIRI，也沒有任何單一治療手段被證明可以治療LIRI，其治療主要包括呼吸機的使用以及液體復(fù)蘇等對癥處理[16]。LIRI的機制較為復(fù)雜，目前認為LIRI使機體產(chǎn)生有害的氧自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，這在LIRI病程中發(fā)揮重要作用[17]。

APO是NOX的特異性抑制劑，NOX是體內(nèi)ROS的重要來源;先前研究表明，APO可減輕小鼠潰瘍性結(jié)腸炎中腸道的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷[8]。在沙鼠腦缺血再灌注模型中，APO可抑制早期IRI中的ROS產(chǎn)生以及由此而導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷[19]；在創(chuàng)傷誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷模型中，APO可以通過降低肺毛細血管通透性及NOX、MPO活性減輕肺損傷[6]；在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷模型中，APO可通過減輕氧化應(yīng)激以及抑制NF-κB、TLR4通路減輕炎癥反應(yīng)及肺損傷[20]。但目前尚無文獻報道APO在在體肺缺血再灌注模型中的作用。

氧化應(yīng)激在LIRI中發(fā)揮重要作用，ROS是誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要因素，體內(nèi)氧化應(yīng)激水平主要以產(chǎn)生ROS的多少來反應(yīng)[21]。SOD是體內(nèi)主要的抗氧化酶和自由基清除劑，其活性高低可反映機體清除氧自由基的能力。MDA是脂質(zhì)過氧化和組織氧化應(yīng)激損傷的重要參考指標。MPO不僅是中性粒細胞的功能標志和激活標志，還能間接反應(yīng)組織氧化應(yīng)激損傷的程度。在本研究中，LIRI組和APO組中SOD表達均較SO組降低，APO組中SOD較LIRI組升高。MPO和MDA則呈現(xiàn)出與SOD相反的趨勢。上述結(jié)果說明LIRI可促進大鼠肺組織氧自由基和活性氧生成，提高中性粒細胞活化水平，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，進而導(dǎo)致肺損傷。而APO作為NOX的抑制劑，可降低體內(nèi)ROS含量，減輕氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，進而減輕肺損傷。肺組織濕干比、HE染色和肺病理評分均是反映肺損傷的直觀指標，TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子可反映組織的炎癥損傷。本研究結(jié)果顯示，LIRI組大鼠出現(xiàn)明顯的急性肺損傷改變與炎癥因子升高，而APO組的肺組織干濕比、肺部病理改變、評分及TNF-α、IL-1β、IL-6均較LIRI組出現(xiàn)了不同程度的改善和降低，說明了APO對大鼠LIRI的保護作用。

NOX2又叫g(shù)p91phox，是NOX家族的一種，主要在巨噬細胞和中性粒細胞中表達。而NOX4是內(nèi)皮細胞內(nèi)ROS的主要來源。NOX由兩種膜蛋白(gp91phox/NOX2和p22phox)和若干種細胞溶質(zhì)型蛋白(p47phox，p67phox，p40phox和GTP酶Rac1)組成。受到刺激后，上述4種細胞溶質(zhì)性蛋白轉(zhuǎn)位至細胞膜，并與上述膜蛋白組裝，進而增加NOX的活性。APO作為一種 NOX 特異性抑制劑，通過在細胞內(nèi)形成同二聚體diapocynin，抑制上述亞基轉(zhuǎn)位，進而抑制 NOX 的活化以及ROS形成。NOX是產(chǎn)生ROS的關(guān)鍵酶，也是ROS合成的主要來源。IRI時組織內(nèi)NOX被激活，產(chǎn)生大量ROS，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致組織氧化損傷。在本研究中，NOX2和NOX4在LIRI組的表達增加，而在APO組表達較LIRI組顯著降低，且ROS與之表達趨勢相同，說明LIRI升高了肺組織氧化應(yīng)激水平，并促進NOX和ROS的表達，而APO的使用抑制了NOX和ROS的表達。

總之，APO能夠有效預(yù)防大鼠LIRI，其機制可能是抑制肺組織NOX2、NOX4蛋白表達。