李燕華，梁月琴，夏洪穎，王崇靜，李仲昆

昆明市延安醫(yī)院，昆明 650051

免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子共同組成了免疫系統(tǒng)，是對抗感染和腫瘤至關(guān)重要的因素[1]。近年來，由環(huán)境污染、生態(tài)失衡等所引發(fā)的免疫抑制性疾病的發(fā)病率逐年上升，而建立適合的免疫抑制模型對進(jìn)一步研究該類疾病尤為重要[2]。環(huán)磷酰胺(CY)是一種抗腫瘤藥物，其也具有顯著的免疫抑制作用[3]，是治療免疫疾病的常用藥物，特別在作為聯(lián)合應(yīng)用的免疫調(diào)節(jié)劑和抗腫瘤藥物方面已廣泛應(yīng)用[4,5]。CY在抑制癌細(xì)胞增殖的同時，也抑制免疫細(xì)胞的增殖，可造成機體免疫應(yīng)答(包括體液免疫和細(xì)胞免疫)的全面抑制。因此，許多國家和國際機構(gòu)均推薦CY作為免疫毒性的陽性物[6～8]。采用CY建立免疫抑制模型的方法常采用單次大劑量(100、150 mg/kg)和多次小劑量[20、40、80 mg/(kg·d)]兩種給藥方法，但是較大劑量[80 mg/(kg·d)]腹腔連續(xù)注射3 d后可造成實驗后期動物的死亡[9]。為減少實驗動物的病死率，提高造模的成功率，為免疫抑制實驗?zāi)Ｐ偷慕⑻峁﹨⒖?，本研究采用單次大劑量注射和小劑量多次注射的給藥方法制備小鼠免疫抑制模型，并對小鼠的體質(zhì)量及末次注射CY后24 h的臟器指數(shù)、腸道黏膜派氏結(jié)(PPs)計數(shù)、腸道黏膜PPs淋巴細(xì)胞表型、腸道黏膜SIgA含量等免疫指標(biāo)進(jìn)行比較，旨在為選擇CY制備免疫抑制模型時的合適劑量提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級ICR雄性小鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK(湘)2011-0003。

1.2 藥物、試劑及儀器 0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號ad160201b2)；注射用CY(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司生，批號17102525)；DAB試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司)?？剐∈驝D3e-FITC、抗小鼠CD19-PE、CD69-PE-CYTM7(美國BD-Pharmingen公司，批號分別為553062、557399、552879)；Anti-TLR4 antibody試劑盒(Abcam公司，批號GR325034-5)；胎牛血清(FBS)(法國Biowest公司，批號020413-UY)；改良型RPMI1640培養(yǎng)基[賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司，批號NAC1361]。FACSCalibur流式細(xì)胞儀(FC-500)(美國Beckman公司)；全自動酶標(biāo)儀Model 550(美國BIO-RAD公司)；LEGEND MICRO 17臺式微量離心機(美國 Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(BDS200)(重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)；TD5M低速多管架自動平衡離心機(長沙萬佳森儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)；光學(xué)顯微鏡(Nikon50i)：日本Nikon公司；FA2004電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；血球計數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司)；Cell Strainer(100 μm,70 μm)(美國Falcon公司)；眼科剪、眼科鑷。

1.3 實驗動物分組及免疫抑制模型制備 將ICR健康雄性小鼠適應(yīng)性暫養(yǎng)1周后，稱重、標(biāo)記，后隨機分為單次組、多次組、對照組各10只。單次組在實驗第7天腹腔注射100 mg/kg的CY，多次組在實驗第1、3、5、7 d腹腔注射50 mg/(kg·d)的CY，以免疫抑制模型；對照組在實驗第1、3、5、7 d腹腔注射等量生理鹽水。各注射后自由取食飲水。

1.4 小鼠體質(zhì)量測定 采用電子秤測定實驗第1、3、5、7、8 d每只小鼠的體質(zhì)量，并記錄。

1.5 小鼠處死及相關(guān)指標(biāo)測定 實驗第8 d，以頸椎脫臼法處死小鼠30只，按下列步驟測定小鼠臟器指數(shù)、腸黏膜PPs計數(shù)、腸黏膜CD3+、CD19+細(xì)胞比例測算、小鼠腸道黏膜SIgA。

1.5.1 小鼠臟器指數(shù)測定 沿胸部和腹部中線切開小鼠，按解剖位置摘取脾臟和胸腺，小心剔除其周圍的筋膜及組織，濾紙吸干殘余的血液后進(jìn)行稱重(g)，將稱得的重量(g)除以小鼠體質(zhì)量(g)，計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，脾臟指數(shù)(%)=脾臟重量(g)/小鼠體質(zhì)量×100，胸腺指數(shù)(%)=胸腺重量(g)/小鼠體質(zhì)量×100。

1.5.2 小鼠腸黏膜PPs計數(shù) 打開小鼠腹腔，取出全段小腸，迅速放入含有5%胎牛血清(5%FBS)的RPMI1640液的培養(yǎng)皿中，剔除腸系膜及腸黏膜表面的脂肪組織，在外腸壁上可看見麥粒樣的圓形突起，即為PPs[10]，肉眼計數(shù)并記錄PPs數(shù)目。

1.5.3 小鼠腸黏膜CD3+細(xì)胞比例、CD19+細(xì)胞比例測算 PPs淋巴細(xì)胞獲取及表型測定 肉眼計數(shù)并記錄PPs數(shù)目完成后，將小鼠腸腔沖洗干凈，迅速放入含5%FBS的RPMI1640液的培養(yǎng)皿中；用眼科鑷和眼科剪小心分離出PPs；將其浸入含5%FBS的RPMI1640液的培養(yǎng)皿中，先用5%FBS的RPMI1640液浸潤120目細(xì)胞篩，并將PPs小心移入細(xì)胞篩中，用研磨棒以適當(dāng)?shù)牧Χ容p輕研磨，再用5%FBS的RPMI1640液沖洗細(xì)胞篩過濾；以上濾液用200目細(xì)胞篩過濾；收集濾液，加至5 mL，以2 000 r/min速度離心10 min，棄上清液，加入5%FBS的RPMI1640液約3 mL，重懸細(xì)胞即得PPs細(xì)胞懸液。將收集到的PPs細(xì)胞計數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×107/mL，分別取100 μL細(xì)胞加入流式檢查專用試管中進(jìn)行熒光標(biāo)記，每管依次加入抗小鼠CD3e-FITC、CD19-PE單克隆抗體各0.5 μg，混勻后4 ℃避光孵育30 min，用PBS洗滌細(xì)胞兩次(1 500 r/min，5 min)，棄上清，用PBS 300 μL重懸后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測[10]。

1.5.4 小鼠腸道黏膜SIgA測定 取出全段小腸，用帶有灌胃針的10 mL注射器向腸腔內(nèi)注入NS約3 mL，并在小腸內(nèi)保留3 min，輕輕晃動使腸腔內(nèi)的內(nèi)容物充分溶解，將腸腔內(nèi)灌洗液收集于EP管中，以3 000 r/min的速度離心10 min，收集上清液于凍存管，-80 ℃儲存，編號備用。待樣本收齊后，嚴(yán)格按酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)鼠SIgA試劑盒說明書操作[10]，即取100 μL不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、陽性對照品和空白分別加入酶標(biāo)板，37 ℃孵育2 h；用拍板紙拍干板子，不洗板；提前20 min配制Detection reagent A工作液；加入100 μL Detection reagent A工作液到酶標(biāo)板，輕輕震蕩混勻，37 ℃孵育60 min；洗板3次；每個孔加300 μL 1×洗液工作液放置2 min后用拍板紙拍干板子；提前20 min配制Detection reagent B工作液；加入100 μL Detection reagent B工作液到酶標(biāo)板，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光孵育30 min；洗板5次；加入90l顯色底物(TMB)到酶標(biāo)板，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光孵育15 min；加入50 μL終止液到酶標(biāo)板，輕輕震蕩混勻，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測標(biāo)準(zhǔn)品和樣本OD值；以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出濃度。

2 結(jié)果

2.1 不同時點各組小鼠體質(zhì)量比較 不同時點小鼠體質(zhì)量比較見表1。

表1 不同時點各組小鼠體質(zhì)量比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與多次組比較，bP<0.05。

2.2 各組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比較 脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比較見表2。

2.3 各組腸黏膜PPs計數(shù)、CD3+細(xì)胞比例、CD19+細(xì)胞比例、腸道黏膜SIgA含量比較 腸黏膜PPs計數(shù)、CD3+細(xì)胞比例、CD19+細(xì)胞比例、腸道黏膜SIgA含量比較見表3。

表2 各組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與多次組比較，bP<0.05。

表3 各組腸黏膜PPs計數(shù)、CD3+細(xì)胞比例、CD19+細(xì)胞比例、腸道黏膜SIgA含量比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與多次組比較，bP<0.05。

3 討論

免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞、組織和器官的組成成分和功能的正常是機體免疫功能的基本保證，任何一方面的缺陷都將導(dǎo)致免疫功能障礙。機體自發(fā)、病原或藥物、營養(yǎng)因素、環(huán)境因素均可引起免疫系統(tǒng)的功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致功能障礙、免疫應(yīng)答和保護(hù)功能的降低或消失，最后引發(fā)機體喪失抵抗感染能力或形成免疫性疾病，容易受到細(xì)菌、病毒、真菌等感染，甚至容易長腫瘤[11～13]。目前，對免疫抑制性疾病的治療主要以調(diào)整機體的自身免疫功能為主，免疫增強劑在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注[14]。中藥免疫增強劑是目前使用較多的免疫增強劑，它可激活免疫活性細(xì)胞，增強機體的免疫功能；還可作為輔助藥物與一些疫苗合用，增強免疫應(yīng)答，提高免疫效應(yīng)；主要用于一些免疫功能缺陷及難治性感染。但其僅在動物飼料添加中使用較為廣泛；在臨床使用方面，受到一定的限制，需要進(jìn)入深入的研究開發(fā)[15]。為此，建造安全有效的免疫抑制動物模型顯得尤為重要。在生命科學(xué)研究中，免疫抑制動物模型建造的主要方法包括去胸腺動物模型、基因敲除動物模型、輻射損傷模型和免疫抑制劑模型等[16～18]，其中使用免疫抑制劑進(jìn)行建模的方法由于總體成本較低、操作簡便并且重復(fù)性好，因此在目前的研究中廣泛應(yīng)用。用于建立免疫抑制動物模型的免疫抑制劑包括微生物酵解產(chǎn)物類、激素類、抗代謝物類、抗體類、烷化劑類等，其中烷化劑類免疫抑制劑是建立的免疫抑制模型研究中最常用的方法。烷化劑按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為氮芥類、磺酸酯及多元醇類、亞硝基脲類、三氮烯咪唑類和胼類、乙撐亞胺類。

CY是一種抗腫瘤藥物，對白血病和實體瘤都有效，是第一個所謂“潛伏化”廣譜抗腫瘤藥。CY是一種無活性的前藥，在氮芥部分上連有一個吸電子的環(huán)狀磷?；?，降低了烷基化的能力，體外幾乎無活性，當(dāng)其進(jìn)入人體后，被肝臟或腫瘤內(nèi)存在的過量的磷酰胺酶或磷酸酶水解，變?yōu)榛罨饔眯偷牧柞０返娑鹱饔玫牡骖愌苌?。磷酰胺氮芥作為烷化劑的一種在體內(nèi)能和細(xì)胞的蛋白質(zhì)和核酸相結(jié)合，使蛋白質(zhì)和核酸失去正常的生理活性，發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，同時由于其非特異性，也會產(chǎn)生針對骨髓、胃腸道上皮和生殖系統(tǒng)等生長旺盛的細(xì)胞毒性；此外，還對免疫器官和敏感的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生影響，進(jìn)而對免疫功能產(chǎn)生明顯抑制。可用于乳腺癌、惡性淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤、白血病、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、支氣管癌、肺癌等腫瘤的化療；還可作為免疫抑制劑用于各種自身免疫性疾病，如天皰瘡以及潰瘍性結(jié)腸炎、嚴(yán)重類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、多發(fā)性肉芽腫、特發(fā)性血小板減少性紫癜、兒童腎病綜合征等，以及用于器官移植時抗排斥反應(yīng)[19～23]。CY因其效果穩(wěn)定、較易獲得同時成本不高，常用于建立免疫抑制模型并有較多的文獻(xiàn)報道，因而被廣泛接受并應(yīng)用于藥物藥效學(xué)評價和安全性評價。

文獻(xiàn)[6]報道，實驗動物腹腔注射CY后，可導(dǎo)致動物體質(zhì)量不同程度的降低，這與使用CY的劑量和時間有關(guān)，尤其是在注射后的第1周，但大劑量單次注射體質(zhì)量明顯高于小劑量連續(xù)注射組。與空白組比較，單詞組實驗第8天及多次組實驗第3、5、7、8天體質(zhì)量降低；與多次組比較，單次組實驗第3、5、7、8天體質(zhì)量升高。脾臟是機體最大的外周免疫器官，當(dāng)抗原刺激機體后，免疫細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)過度增生，導(dǎo)致其體積增大；胸腺是機體的中樞免疫器官，是T細(xì)胞分化成熟的場所；而機體免疫抑制時，使得淋巴組織萎縮，免疫器官的體積縮小。故免疫器官的臟器指數(shù)體現(xiàn)了其發(fā)育情況，可間接的反映機體的免疫狀態(tài)。本研究顯示，單次組和多次組均出現(xiàn)了脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的降低，且單次組較多次組明顯，間接說明兩組實驗動物均存在免疫抑制，且單次組較多次組明顯。PPs是沿著小腸縱向分布位于膜系膜固有層和黏膜下層的微小淋巴樣組織，含有胸腺源性T細(xì)胞和B細(xì)胞，其中心區(qū)域富含B細(xì)胞，是誘導(dǎo)腸道黏膜進(jìn)行免疫應(yīng)答的重要部位，PPs淋巴細(xì)胞數(shù)量和活性狀態(tài)等可以反映腸道黏膜局部的免疫功能狀態(tài)。CD3+T淋巴細(xì)胞代表總的T淋巴細(xì)胞，而CD19+是B淋巴細(xì)胞表面抗原，除了漿細(xì)胞外的B細(xì)胞譜系所有發(fā)育階段都有CD19分布，CD19也是CD19/CD21/CD81信號復(fù)合物的重要組成部分，故CD19+代表了PPs內(nèi)除了漿細(xì)胞外的B細(xì)胞譜系不同發(fā)育階段B細(xì)胞的總和。在既往的研究中，不同的CY造模實驗均可導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞、Th細(xì)胞、Ts細(xì)胞比例升高，B淋巴細(xì)胞比例下降[6]。本文發(fā)現(xiàn)，單次組和多次組均出現(xiàn)了CD3+細(xì)胞比例升高，CD19+細(xì)胞比例降低，且單次組較多次組更為明顯，進(jìn)一步說明兩組實驗動物均存在免疫抑制，造模成功且單次組效果更佳。有研究[9,24]表明，大劑量CY(100 mg/kg)制造免疫抑制模型效果更佳；在連續(xù)腹腔注射CY的動物模型中，40 mg/(kg·d)和60 mg/(kg·d)的用量均可完成免疫抑制模型的成功造模[25]，但后者的效果優(yōu)于前者?？祷哿盏萚26]發(fā)現(xiàn)，高劑量CY通過抑制DNA的復(fù)制、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低免疫細(xì)胞功能，使機體處于免疫抑制狀態(tài)。免疫效應(yīng)分子SIgA由腸道黏膜固有層漿細(xì)胞分泌，是機體內(nèi)分泌量最大的免疫球蛋白，也是腸黏膜表面主要的免疫球蛋白，對消化道黏膜起著重要防御作用，當(dāng)CY免疫引起抑制時，可引起腸道粘膜SIgA水平下降[27]。本研究中，腸道粘膜SIgA的含量也出現(xiàn)了相同的變化趨勢，且以單次組更為明顯。

總之，單次大劑量和多次小劑量的CY均可建立免疫抑制動物模型，前者對體質(zhì)量影響更小、造模效果更佳。