葛玉雙，閆永斌，程起群

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所, 上海 200090； 2. 上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院, 上海 201306)

生物多樣性是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的飛速發(fā)展，生物多樣性遭遇了空前的危機(jī)和挑戰(zhàn)。以長(zhǎng)江為例，由于水利工程建設(shè)、環(huán)境污染、酷捕濫漁等因素的影響，長(zhǎng)江水生生物多樣性急劇衰退，青魚(Mylopharyngodonpiceus)、草魚(Ctenopharyngodonidella)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Hypophthalmichthysnobilis)四大家魚卵苗發(fā)生量由20世紀(jì)60年代的1 200×108粒(尾)下降到目前的不足10×108粒(尾)；鰣(Tenualosareevesii)、鯮(Luciobramamacrocephalus)難覓蹤跡；中華鱘(Acipensersinensis)連續(xù)數(shù)年監(jiān)測(cè)不到自然繁殖，白鰭豚(Lipotesvexillifer)則已功能性滅絕；而就在最近，處于長(zhǎng)江食物鏈頂端的、世界上最大的淡水魚之一的白鱘(Psephurusgladius)，已宣布滅絕[1]。

開(kāi)發(fā)快速、有效的生物多樣性監(jiān)測(cè)工具來(lái)監(jiān)測(cè)生物多樣性的波動(dòng)，是科學(xué)制定保護(hù)和管理策略的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)調(diào)查方式在監(jiān)測(cè)水生生物多樣性、制定管理和保護(hù)措施中發(fā)揮著重要的作用，但也存在諸多不足，如耗時(shí)長(zhǎng)、準(zhǔn)確度低、依賴專家經(jīng)驗(yàn)、對(duì)資源和環(huán)境不夠友好、稀有種調(diào)查難等。環(huán)境DNA(environmental DNA，eDNA)調(diào)查法是一種新型的水生生物多樣性檢測(cè)方法，克服了傳統(tǒng)調(diào)查法的弊端。近年來(lái)，該方法得到了較為廣泛的應(yīng)用。本文從環(huán)境DNA特性、檢測(cè)方法及其在水生生物多樣性中的應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步開(kāi)展環(huán)境DNA檢測(cè)提供有益的借鑒。

1 環(huán)境DNA的特性

eDNA是指生物釋放到水、空氣及土壤等環(huán)境中的短DNA片段。這些eDNA可能來(lái)源于生物體表皮細(xì)胞經(jīng)皮膚、尿液、糞便、粘液等釋放到環(huán)境中的胞內(nèi)DNA，或者是細(xì)胞死亡后裂解釋放到環(huán)境中的胞外DNA[2]。

1.1 環(huán)境DNA的大小

eDNA的直徑變化幅度較大，有大于180 μm的，也有小于0.2 μm的，但大多數(shù)小于0.2 μm[3]，其大小可能與生物種類不同有關(guān)。PAUL等[4]根據(jù)eDNA是否能夠通過(guò)0.2 μm孔徑的濾膜，把eDNA分成2類：微粒DNA(直徑大于0.2 μm)和溶解DNA(直徑小于0.2 μm)，其中直徑大于0.2 μm的微粒DNA大部分為浮游生物，小于0.2 μm的溶解DNA包含病毒。而TURNER等[3]的研究發(fā)現(xiàn)鯉(Cyprinuscarpio)的eDNA直徑多為1 μm～10 μm。

1.2 環(huán)境DNA的存在方式

eDNA的存在方式包括：微囊泡包裹的eDNA、結(jié)合其他物質(zhì)的eDNA和自由溶解分子的eDNA[5]。目前以自由溶解分子形式存在的eDNA，尚不清楚是否能夠抵御環(huán)境損傷，延緩eDNA降解，其他兩種方式均有其特有的延緩eDNA降解的結(jié)構(gòu)。水環(huán)境中存在一種類似包裹尿液和血清的微囊泡，該結(jié)構(gòu)可有效地減少胞外環(huán)境因子對(duì)eDNA的影響；eDNA也能夠結(jié)合環(huán)境中的物質(zhì)，例如，土壤能夠在一定程度上減緩eDNA的降解[6]。

1.3 環(huán)境DNA的持久性

除去其來(lái)源后，eDNA在環(huán)境中存在的時(shí)間稱為eDNA的持久性[7]。eDNA的持久性因環(huán)境而異，從幾小時(shí)到幾萬(wàn)年不等[8-11]。在水環(huán)境中，海水中的北美三刺魚(Gasterosteusaculeatusaculeatus)eDNA僅能存在21 h[8]，海水種類中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)以及淡水脊椎動(dòng)物的eDNA能存在1個(gè)月左右[9-10]；在土壤中，存在著40～50年前的植物eDNA[11]；在永久凍土中，發(fā)現(xiàn)了40 000年前物種的eDNA[12]。

影響eDNA持久性的因素可分為內(nèi)因和外因。其中，內(nèi)因包括eDNA片段的長(zhǎng)度、序列、構(gòu)象等。研究表明：短片段的eDNA比長(zhǎng)片段的eDNA更為穩(wěn)定[13]；線性的eDNA和螺旋化的eDNA的持久性不同，可能是核酸酶酶解二者的速率不同[14]。外因包含生物酶解、物理磨損、化學(xué)腐蝕等，例如，環(huán)境微生物DNA酶酶解eDNA[6]、高溫增加DNA分子變性的概率或加速酶解eDNA[13]、高鹽、缺氧影響eDNA構(gòu)象和穩(wěn)定性，同時(shí)也可能限制核酸外切酶的活性[8]。

2 環(huán)境DNA檢測(cè)的主要步驟

eDNA檢測(cè)要經(jīng)過(guò)樣品獲取、樣品處理、eDNA的提取、引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增以及測(cè)序等步驟，如圖1：

2.1 樣品獲取

在取樣規(guī)程中，樣本體積的大小視實(shí)際情況而定，通常物種密度越高，取樣體積越小。人工條件下一般養(yǎng)殖密度較高，則取樣的體積較小，15 mL最為常見(jiàn)；野外環(huán)境中一般物種密度較小，則取樣體積較大，1 L最為廣泛?？傮w而言，根據(jù)1987—2018年來(lái)關(guān)于水生生物eDNA研究的文獻(xiàn)(如圖2，文獻(xiàn)來(lái)源為在NCBI(National Center for Biotechnology Information Search database)上以(((environmental DNA) OR eDNA) AND water samples) NOT review為檢索詞獲得的相關(guān)文獻(xiàn))可知，水樣取樣體積大小廣泛，從10 mL到500 L不等，但大多數(shù)取樣體積為15 mL、250 mL、500 mL、1 L、2 L。

2.2 樣品處理

對(duì)于水樣的保存，一般選擇冷凍或化學(xué)保存。冷凍條件一般為-20℃以下；化學(xué)保存是利用化學(xué)物質(zhì)對(duì)水樣進(jìn)行保存，一般用3 mol·L-1的醋酸鈉和100%或95%的乙醇混合液混合水樣。

對(duì)于水樣的處理，主要有離心和過(guò)濾2種方法。離心是讓樣本中的eDNA沉降，從而濃縮eDNA[15]；過(guò)濾是將水樣中的eDNA截留在濾膜上，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本體積的濃縮[16]。目前應(yīng)用最多的方式為過(guò)濾。通常選用水系濾膜進(jìn)行eDNA過(guò)濾，濾膜的材質(zhì)多樣，如聚碳酸酯膜、玻璃纖維膜、硝酸纖維膜和尼龍膜等；濾膜的孔徑不一，例如，0.2 μm, 0.22 μm, 0.45 μm等，如圖3，數(shù)據(jù)來(lái)源來(lái)源同圖2。濾膜的材質(zhì)、孔徑會(huì)影響eDNA檢測(cè)的結(jié)果，需謹(jǐn)慎選用。例如，在研究中國(guó)對(duì)蝦(F.chinensis)時(shí)發(fā)現(xiàn)，直徑為0.45 μm，材質(zhì)為玻璃纖維膜的濾膜通透性最佳[16]。

2.3 eDNA提取

環(huán)境樣本中的eDNA含量少、成分復(fù)雜，eDNA的提取難度高于組織DNA的提取。當(dāng)前，eDNA的提取方法還沒(méi)有像組織DNA的提取方法那樣成熟，發(fā)展出多種提取方法。eDNA的提取方法總體上分為3類，即傳統(tǒng)提取法、DNA試劑盒提取法以及兩者結(jié)合的方法。目前用于eDNA提取的試劑盒有普通DNA提取試劑盒(如DNeasy血液和組織試劑盒)和專有eDNA提取試劑盒(例如，PowerWaterTMDNA提取試劑盒、PowerMaxTM土壤DNA提取試劑盒)。目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于普通DNA提取試劑盒和專有eDNA提取試劑盒比較的文獻(xiàn)，但專有eDNA提取試劑盒價(jià)格比普通試劑盒昂貴。這可能是因?yàn)闃悠分衑DNA含量少，且存在雜質(zhì)及污染物等，專有eDNA提取試劑盒可以排除雜質(zhì)及污染等干擾，得到質(zhì)量更好、產(chǎn)量更高的eDNA。eDNA提取完成后，一般放在放4℃或-20℃保存。

2.4 設(shè)計(jì)引物

擴(kuò)增遺傳標(biāo)記的引物可分為通用引物和特異性引物，引物設(shè)計(jì)的第1步是獲得目標(biāo)物種的線粒體DNA序列，可通過(guò)查找NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或測(cè)序目標(biāo)物種獲得DNA序列；第2步是根據(jù)調(diào)查目的和引物設(shè)計(jì)原則，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物。如果用于物種監(jiān)測(cè)，需要設(shè)計(jì)針對(duì)研究對(duì)象的特異性引物[17]；如果用于生物多樣性評(píng)估，則需要設(shè)計(jì)通用引物[18]。當(dāng)前設(shè)計(jì)引物的軟件有Primer Premier，Oligo7， Beacon Designer，在線的NCBI Primer-Blast，Primer3 Plus，Bath Primer 3.0，The PCR Suit，Primerbank和PrimerX等。

2.5 PCR擴(kuò)增

水樣本的擴(kuò)增方式有常規(guī)PCR擴(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)。常規(guī)PCR可利用通用引物擴(kuò)增多種生物的目的片段；qPCR可利用特異性引物定性擴(kuò)增特定物種的目的片段，同時(shí)能定量分析該目的片段的含量。

在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，PCR的循環(huán)數(shù)大多在30至55之間(如圖4，數(shù)據(jù)文獻(xiàn)來(lái)源同圖2)，和普通DNA擴(kuò)增循環(huán)數(shù)并無(wú)差異。為了提高高通量測(cè)序質(zhì)量，消除單次PCR帶來(lái)的誤差，常將每個(gè)樣品進(jìn)行多管重復(fù)PCR擴(kuò)增，重復(fù)次數(shù)從3個(gè)[19]到12個(gè)[20]不等。但近來(lái)有研究表明，單次PCR得到的Reads顯著高于3次PCR的混合[21]。

PCR擴(kuò)增的結(jié)果以陰性、陽(yáng)性記錄。陰性表明環(huán)境樣品中不存在目標(biāo)DNA，陽(yáng)性則表明環(huán)境樣品中存在目標(biāo)DNA。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中需要設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照，以此來(lái)排除假陽(yáng)性與假陰性結(jié)果。

2.6 測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

通用引物擴(kuò)增eDNA樣品得到生物的DNA序列，這些混合DNA經(jīng)測(cè)序、比對(duì)、篩選等最終確定生物種類。新一代測(cè)序儀平臺(tái)可對(duì)混合的擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序。較早開(kāi)始的測(cè)序平臺(tái)是焦磷酸測(cè)序[22]，隨著技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了測(cè)序能力更強(qiáng)，成本更低的新一代測(cè)序平臺(tái)，如Ion Torrent[23]和Illumina[24]平臺(tái)。測(cè)序完成以后，進(jìn)行原始序列處理、OTU分類和注釋及多樣性分析等，最終完成實(shí)驗(yàn)。

3 環(huán)境DNA檢測(cè)技術(shù)在水生生物多樣性調(diào)查中的應(yīng)用

不同于宏觀的傳統(tǒng)調(diào)查方式，從微觀的分子生物學(xué)視角出發(fā)，eDNA檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)為水生生物多樣性調(diào)查提供了一種嶄新的方法，應(yīng)用十分廣泛。當(dāng)前已應(yīng)用于古生物群落演替重現(xiàn)、物種監(jiān)測(cè)及預(yù)測(cè)、生物多樣性調(diào)查和種群動(dòng)態(tài)研究等方面。

3.1 古生物群落演替重現(xiàn)

溫度影響eDNA的持久性，冰凍條件可保存eDNA上萬(wàn)年，這一特點(diǎn)為重現(xiàn)古生物群落演替提供了條件。根據(jù)eDNA檢測(cè)，西伯利亞凍土中的真菌和植物多樣性在最后一次冰期前后發(fā)生了變化[25]。eDNA檢測(cè)表明更新世和全新世的過(guò)渡期大量植被發(fā)生了變化，且這些植被演替對(duì)巨型動(dòng)物的滅絕產(chǎn)生了影響[26]。

3.2 物種監(jiān)測(cè)及預(yù)測(cè)

eDNA檢測(cè)技術(shù)已應(yīng)用于入侵種、瀕危種、稀有種等諸多水生物種的檢測(cè)中。生物入侵會(huì)造成一系列危害，如造成生態(tài)系統(tǒng)功能損傷、生態(tài)系統(tǒng)退化、生物多樣性喪失等重大問(wèn)題，因此，需要及早發(fā)現(xiàn)并采取有效措施遏制。eDNA檢測(cè)可及時(shí)、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)出水生生態(tài)系統(tǒng)中的生物入侵種?，F(xiàn)已在諸多水生入侵種的監(jiān)測(cè)中得到成功應(yīng)用，例如美國(guó)牛蛙(Ranacatesbeiana)[19]、鯉(C.carpio)[27]、蝸牛(Potamopyrgusantipodarum)[28]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[29]等。

調(diào)查稀有、瀕危物種一直是生物調(diào)查的難點(diǎn)。傳統(tǒng)的調(diào)查方法精確度偏低、數(shù)據(jù)誤差偏高且對(duì)調(diào)查物種不友好，這些調(diào)查方式在某些調(diào)查中可能起不到物種調(diào)查的作用，甚至?xí)茐姆N群數(shù)量，加速物種衰退。被稱為非入侵式調(diào)查的eDNA檢測(cè)能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)調(diào)查方式的不足，且發(fā)現(xiàn)數(shù)量極少的物種，如eDNA檢測(cè)重新發(fā)現(xiàn)消失多年的巴勒斯坦油彩蛙(Latonianigriventer)，還發(fā)現(xiàn)了該物種的主要分布區(qū)域[30]。此外，eDNA檢測(cè)還成功預(yù)測(cè)美國(guó)大鯢(Cryptobranchusalleganiensis)[31]，大鳳頭蠑螈(Trituruscristatus)[32]等瀕危動(dòng)物。

3.3 生物多樣性調(diào)查

傳統(tǒng)的生物多樣性調(diào)查法耗時(shí)、費(fèi)力，且對(duì)環(huán)境有一定的破壞力及殺傷力，eDNA檢測(cè)法省時(shí)節(jié)力，且對(duì)環(huán)境友好。eDNA檢測(cè)生物多樣性已應(yīng)用于江河湖海的許多地方，其調(diào)查結(jié)果比傳統(tǒng)方式調(diào)查結(jié)果更為全面。在丹麥海洋魚類多樣性調(diào)查中，eDNA檢測(cè)調(diào)查到傳統(tǒng)調(diào)查方式?jīng)]有調(diào)查到的罕見(jiàn)魚類[8]；在美國(guó)上百個(gè)池塘、小溪、河流的生物多樣性調(diào)查中發(fā)現(xiàn)多種兩棲動(dòng)物、魚類、哺乳動(dòng)物、昆蟲和甲殼類動(dòng)物[33]；在英國(guó)湖泊魚類多樣性調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，eDNA檢測(cè)到了歷史記錄的大部分魚類，而傳統(tǒng)方式僅捕撈到4種[34]；在中國(guó)東黃海漁業(yè)資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了100多種魚類，比傳統(tǒng)捕撈方法獲得的種類多[35]。

3.4 種群動(dòng)態(tài)研究

eDNA檢測(cè)已在多種生物的多樣性調(diào)查中發(fā)揮作用，但在生物量估測(cè)上卻困難重重。雖然eDNA受到多種因素的影響，但早在多年前，TAKAHARA等[36]和EICHMILLER等[37]就發(fā)現(xiàn)鯉魚的生物量與eDNA的濃度呈正相關(guān)，并給出了相應(yīng)的模型，以期預(yù)測(cè)種群的分布與豐度。更多的物種生物量與eDNA濃度的關(guān)系也得到了研究，如貽貝[38]，但該方法尚未得到應(yīng)用。因此，利用eDNA檢測(cè)估測(cè)生物量，進(jìn)而檢測(cè)種群動(dòng)態(tài)這條道路還很曲折。

4 環(huán)境DNA檢測(cè)的不足與展望

從微生物、植物到動(dòng)物，eDNA檢測(cè)的對(duì)象不斷豐富；從檢測(cè)污染、保護(hù)生物多樣性到重建古生物生態(tài)系統(tǒng)，eDNA檢測(cè)的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。雖然eDNA檢測(cè)發(fā)展十分迅速，應(yīng)用也更加廣泛，但仍存在諸多不足：

(1)eDNA遺傳標(biāo)記的局限性。水生動(dòng)物eDNA檢測(cè)的遺傳標(biāo)記主要是線粒體DNA，雖然線粒體DNA具有拷貝數(shù)多，容易被檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但線粒體DNA是母系遺傳，作為分子標(biāo)記，僅能追蹤到特定種群中部分基因位點(diǎn)，無(wú)法區(qū)分雜種及其母本物種[39]。可將線粒體遺傳標(biāo)記和核遺傳標(biāo)記等結(jié)合使用；或者尋找新的遺傳標(biāo)記，克服母系遺傳的不足。

(2)eDNA檢測(cè)中通用引物的局限性。在生物多樣性調(diào)查及古生物群落重現(xiàn)時(shí)，掌握生物種類信息是完成調(diào)查任務(wù)的前提。eDNA檢測(cè)中，利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得物種種類信息，對(duì)通用引物的要求是擴(kuò)增物種種類全、分辨率高，但目前還沒(méi)有十分完美的通用引物。以魚類通用引物為例，雖然能夠擴(kuò)增出90%的魚類線粒體DNA12S序列，但其分辨率較低，種屬區(qū)分度有限[40]。此外，還會(huì)擴(kuò)增出非魚類物種，如鳥(niǎo)類，說(shuō)明該魚類通用引物的特異性不夠[8]，給數(shù)據(jù)的分析增加了難度。因此，需要開(kāi)發(fā)新的擴(kuò)增目標(biāo)生物種類齊全、分辨率滿足需要、特異性合適的新型引物。

(3)eDNA檢測(cè)易受到環(huán)境污染的影響。樣品本身可能含PCR抑制劑，如海水樣品中的高鹽[41]、淡水樣品中的腐殖酸[42]，這些PCR抑制劑可能造成假陰性結(jié)果。樣品從采集到運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室是一個(gè)路途遠(yuǎn)、耗時(shí)長(zhǎng)的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程大大增加了樣品的污染機(jī)率。此外，環(huán)境樣品在實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)過(guò)DNA的提取，PCR擴(kuò)增，高通量測(cè)序等一系列處理，整個(gè)過(guò)程的實(shí)驗(yàn)操作步驟繁瑣、使用試劑紛雜，增加了eDNA檢測(cè)無(wú)污染要求的難度。

(4)數(shù)據(jù)庫(kù)中生物信息學(xué)資料尚不完備。在中國(guó)東黃海魚類資源調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，eDNA檢測(cè)技術(shù)能夠檢測(cè)到大部分傳統(tǒng)方法捕撈的魚類，而像小帶魚(Eupleurogrammusmuticus)、細(xì)條天竺鯛(Apogonlineatus)、斑翅虎鲉(Minouspictus)等魚類則無(wú)法檢測(cè)到，其原因可能是數(shù)據(jù)庫(kù)不全，通過(guò)高通量測(cè)得的數(shù)據(jù)無(wú)法比對(duì)到這些物種[35]。完善數(shù)據(jù)庫(kù)信息，可提高eDNA檢出率。

eDNA檢測(cè)技術(shù)雖然在物種多樣性調(diào)查、稀有物種及瀕危物種保護(hù)等方面起到非常重要的作用，但還存在以上等諸多不足。傳統(tǒng)調(diào)查方式雖然沒(méi)有eDNA檢測(cè)方法高效，但也有其獨(dú)有的優(yōu)點(diǎn)，如獲得更多生物相關(guān)信息。在進(jìn)行某河段生物多樣性調(diào)查時(shí)，除了獲得生物多樣性的情況外，還能了解到物種性別、個(gè)體長(zhǎng)度、重量及健康狀況等。總的來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)調(diào)查方式和eDNA檢測(cè)技術(shù)這兩種調(diào)查方法各有所長(zhǎng)，在實(shí)際調(diào)查中，不能只依賴于其中一種，而是應(yīng)將傳統(tǒng)調(diào)查方式和eDNA檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，這樣才能更全面、更高效地監(jiān)測(cè)水生生物多樣性，在水生生態(tài)文明建設(shè)中發(fā)揮更積極的作用。