蘇婷婷，鄭晉，王碩，李永盛，邊睿，施偉斌

（上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院 普通外科，上海 200092）

膽囊癌（gallbladder carcinoma，GBC）是消化系統(tǒng)中發(fā)病率第6位，病死率較高的惡性腫瘤[1-3]。近年來我國膽囊癌發(fā)病率呈上升趨勢，每年新發(fā)病例數(shù)約5萬例[3]。臨床上對于膽囊癌的治療首選根治性手術切除，由于該病早期無特異臨床表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)較晚，發(fā)現(xiàn)時常伴局部及遠端轉(zhuǎn)移，隨后病情發(fā)展迅速，預后極差，因此針對膽囊癌的放、化療，分子靶向治療等綜合治療逐漸成為膽囊癌的主要治療手段[4]。隨著化療藥物在實體腫瘤中的廣泛應用，其在晚期膽囊癌治療中起了一定作用[5-7]。目前膽囊癌的化療方案以吉西他濱+鉑類聯(lián)合化療為主[8]，盡管化療可增加腫瘤的可切除性和生存率，然而中位生存期仍不足15個月[9]，因此，尋找新的治療手段對膽囊癌的防治有重要的臨床意義。

近年來，分子靶向治療利用特異性阻斷劑干擾腫瘤細胞表達的某種信號分子，抑制腫瘤生長和侵襲，從而達到腫瘤治療效果，如用于治療胃癌的阿帕替尼[10]、治療甲狀腺癌的侖伐替尼[11]在臨床實驗中都取得了很好的療效。目前已知與膽囊癌相關的靶點有血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和表皮生長因子受體（EGFR）家族等，針對這些靶點已有吉非替尼，厄洛替尼，貝伐珠單抗等靶向藥物進入臨床研究，但治療效果良莠不齊[4,12]。吡咯替尼（pyrotinib）是在我國新批準上市用于治療人表皮生長因子受體2（ErbB2，也稱HER-2）陽性乳腺癌的靶向化療藥物，該藥通過結合并抑制ErbB2的靶點，進一步引起下游信號通路的改變抑制腫瘤細胞生長[13-14]，但目前該藥物在膽囊癌中的應用國內(nèi)、外尚無研究報道。隨著二代基因測序技術發(fā)展，大量研究報道了膽囊癌組織存在ErbB2基因的異常表達，在此基礎上，有實驗研究對膽囊癌NOZ和SGC-996等細胞系進行該基因沉默表達，結果發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的生長受到抑制[12,15-17]，這些數(shù)據(jù)顯示了ErbB2的致癌潛力，在細胞實驗水平靶向減少該基因的表達，可初步抑制腫瘤細胞的生長，因此本研究探討吡咯替尼對膽囊癌細胞株的殺傷作用，并為進一步研究其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

吡咯替尼原藥由江蘇恒瑞股份有限公司提供。二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購于生工生物工程（上海）股份有限公司。為進行體外研究，先將吡咯替尼溶解在DMSO中，生成濃度為100 mmol/L的儲備液。對于工作液濃度，是將藥物儲備溶液用培養(yǎng)基進一步稀釋產(chǎn)生。對照組是用等體積的DMSO處理。最終處理組和對照組需保持細胞培養(yǎng)基中DMSO濃度在0.1%以下。磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、高糖型Dulbecco's modified eagle medium（DMEM）培養(yǎng)基購于Gbico公司，penicillin-streptomycin雙抗購于Hyclone公司，0.25%EDTA胰酶購于蘇州新賽美生物科技有限公司，Transwell小室含和不含基質(zhì)膠型均購于上海百賽生物技術公司，Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒）購于上海翊圣生物科技有限公司，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、SDS（sodium dodecyl sulfate）-page快速配膠盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購于上海碧云天生物技術公司。Bcl-2、Bax、cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3、cleaved-PARP和二抗（山羊抗兔）購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用于本研究的NOZ和SGC-996膽囊癌細胞株由上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院普外科實驗室保存，兩種細胞系均在DMEM高糖型培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中添加了10%的胎牛血清，100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素。所有細胞均在37 ℃，含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞活力和毒性實驗 對于細胞活力的測定，按照CCK-8試劑制造商的操作說明進檢測。取處于對數(shù)生長期的NOZ、SGC-996細胞，0.25% EDTA胰酶消化離心，重懸計數(shù)后，將細胞鋪于96孔板中，每孔細胞數(shù)2×103個。在96孔板中處理組共設6個組，工作液終濃度分別為0、1、2、4、6、8 μmol/L 的吡咯替尼處理 24、48、72 h，用含濃度為0.1%的DMSO溶媒作為對照組，每個分組設置3個副孔。處理相應時間后，將10 μL CCK-8試劑添加到每個孔中，并在37 ℃下避光進一步孵育4 h，隨后通過酶標儀（Bio-Tek，Winooski，VT，USA）測定在450 nm波長處吸光度值（OD），算得細胞存活率和25%（IC50）、50%（IC50）、75%（IC75）抑制濃度。細胞存活率=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）。

1.2.3 克隆形成實驗 根據(jù)CCK-8實驗測結果，選取最適時間下吡咯替尼對兩種細胞相應的IC50、IC50、IC75抑制濃度作為后續(xù)實驗的處理濃度。對于平板克隆實驗，將處于對數(shù)生長期的NOZ細胞和SGC-996細胞接種在6孔板中，每孔1×104個細胞，用上述濃度的吡咯替尼處理細胞，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h后，PBS洗滌2遍，胰酶消化離心，重懸計數(shù)，接種于新鮮培養(yǎng)基覆蓋的6孔板中，每孔接種500個細胞，連續(xù)培養(yǎng)14 d，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌后用4%多聚甲醛固定，隨后0.1%結晶紫染色，最后拍照計數(shù)，處理圖片數(shù)據(jù)。

1.2.4 遷移侵襲實驗 取對數(shù)期生長的NOZ和SGC-996細胞，胰酶消化離心，重懸計數(shù)后接種在6孔板中，待細胞長到融合度為70%左右時用前述濃度處理細胞12 h后，棄去培養(yǎng)基，胰酶消化離心，重懸計數(shù)細胞，將1×105個NOZ和SGC-996細胞接種在裝有200 μL的無血清培養(yǎng)基Transwell（8.0 μm孔徑）的上室（遷移實驗Transwell小室上室底不含基質(zhì)膠，侵襲實驗Transwell小室上室底含基質(zhì)膠）中培養(yǎng)。下室盛有300 μL含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h后，甲醇固定，并用結晶紫染色后在熒光顯微鏡下觀察拍照，每組小室隨機選擇3個區(qū)域進行拍照定量分析。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 用吡咯替尼處理NOZ、SGC-996細胞（處理濃度如前所述）48 h以評估細胞凋亡率，孵育結束后，培養(yǎng)基連同PBS洗滌1次后的液體一并與胰酶消化后細胞收集起來1 000r/min離心5 min，再用PBS洗滌一遍離心后棄上清，隨后加入195 μL Annexin V結合液，5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶混勻，室溫下避光孵育20 min，上機檢測。

1.2.6 Western blot分析 NOZ和SGC-996細胞用吡咯替尼按前述濃度處理48 h后，用預混蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，超聲10 s，4 ℃，14 000r/min 離心10 min，用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度。每組40 μg蛋白樣品加入上樣孔，在SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白，隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h。隨后將膜與Bax、Bcl-2、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9、cleaved-PARP、及內(nèi)參抗體tubulin（1:2 000）4 ℃孵育過夜。后將膜與相應二抗在室溫下孵育1 h，洗膜后進行化學發(fā)光顯像分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

每個實驗均重復3次，統(tǒng)計資料結果均以平均值±標準差表示。t檢驗用于比較處理組和對照組之間的差異，單因素方差分析用于多組間比較，P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。使用 SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，利用Graphpad軟件及Image J軟件進行圖片處理。

2 結 果

2.1 吡咯替尼抑制膽囊癌細胞增殖

用CCK-8實驗檢測吡咯替尼對NOZ、SGC-996細胞活力的影響。結果顯示。用吡咯替尼處理24、48、72 h后的NOZ、SGC-996細胞的活力隨處理濃度增加，細胞活力逐漸下降，同時隨著吡咯替尼作用時間延長，細胞活力呈明顯下降趨勢（圖1）。在加藥后48 h，細胞抑制率隨加藥濃度升高從20%升高到70%；對于NOZ和SGC-996細胞在24、48、72 h的IC50分別為11.5、3.6、1.4 μmol/L和5.5、5.2、2.4 μmol/L。按既定方案，后續(xù)實驗處理NOZ細胞的藥物濃度為1、3.5、12 μmol/L；處理SGC-996細胞的藥物濃度為2.5、5、10 μmol/L。

圖1 吡咯替尼對膽囊癌NOZ、SGC-996細胞的抑制的時間、濃度效應Figure 1 The time and concentration inhibitory effect of pyrotinib on gallbladder cancer cells

2.2 吡咯替尼對膽囊癌細胞克隆形成能力的影響

進行克隆形成實驗以測定單細胞增殖能力。結果顯示，吡咯替尼處理48 h更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14 d后引起膽囊癌細胞集落形成能力呈現(xiàn)濃度依賴性降低，此外，各濃度吡咯替尼處理處理組中形成的集落數(shù)量和大小均明顯小于對照組（均P＜0.05）（圖2）。

圖2 吡咯替尼對膽囊癌NOZ、SGC-996細胞克隆形成的抑制作用Figure 2 Inhibitory effects of pyrotinib on clone formation abilities of gallbladder cancer NOZ and SGC-996 cells

2.3 吡咯替尼對膽囊癌細胞侵襲和遷移能力的抑制作用

Transwell小室實驗分析結果顯示，與對照組相比，用吡咯替尼處理12 h后，穿過帶基質(zhì)膠和不帶基質(zhì)膠的Transwell小室膜的細胞數(shù)隨處理濃度增加而減少（均P＜0.05）（圖3）。

2.4 吡咯替尼誘導膽囊癌細胞發(fā)生凋亡

為探討吡咯替尼對膽囊癌細胞凋亡的影響，用前述濃度處理膽囊癌細胞NOZ、SGC-996 48 h后，使用流式細胞儀分析了細胞凋亡率。結果顯示，在雙參數(shù)散點圖中，LL象限代表活細胞，LR和UR象限分別代表早期凋亡和晚期凋亡細胞。隨著吡咯替尼處理濃度的增加，存活的細胞百分比減少，而早期凋亡和晚期凋亡的細胞數(shù)均增加（均P＜0.05）（圖4）。

為了進一步研究吡咯替尼誘導細胞凋亡的機制，通過Western blot檢測了caspase家族，Bcl-2家族和其他在凋亡過程中期起關鍵作用的重要蛋白表達，結果表明，吡咯替尼增加了cleavedcaspase 3、cleaved-caspase 9、cleaved-PARP和Bax的表達，同時降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。此外，Bcl-2與Bax的比例呈濃度依賴性降低趨勢（均P＜0.05）（圖5）

圖3 吡咯替尼對膽囊癌NOZ、SGC-996細胞侵襲和遷移影響Figure 3 Effects of pyrotinib on invasion and migration of gallbladder cancer NOZ and SGC-996 cells

圖4 流式分析吡咯替尼對膽囊癌NOZ、SGC-996細胞凋亡的影響Figure 4 Flow cytometric analyzing the effects of pyrotinib on the apoptosis of gallbladder cancer NOZ and SGC-996 cells

圖5 Western blo檢測吡咯替尼對膽囊癌NOZ、SGC-996細胞凋亡相關蛋白表達的影響Figure 5 Western blot analyzing the effects of pyrotinib on the expressions of the apoptosis-related proteins in gallbladder cancer NOZ and SGC-996 cells

3 討 論

迄今為止發(fā)現(xiàn)的與膽囊惡性腫瘤相關的癌基因有KRAS、TP53、Myc、ErbB2等[15-16,18]，相關的信號通路有ErbB、angiogenesis、Hedgehog、PI3K/Akt/mTOR、MAPK/ERK[12,19-21]等，這些癌基因和相關信號通路及關鍵分子的異常表達和調(diào)控紊亂，參與了膽囊癌的發(fā)生與發(fā)展。其中又以ErbB家族及其信號通路的研究報道較多。ErbB家族一共包含了EGFR、ErbB2、HER-3及HER-4該4個酪氨酸激酶受體，這些受體與相應配體結合后，引起下游基因突變或擴增，調(diào)控細胞增殖、遷移、凋亡等[12,22]?，F(xiàn)有報道稱20%的非小細胞肺癌存在EGFR突變，大約有20%的乳腺癌患者存在ErbB2基因的擴增[22]，而針對膽囊癌進行的基因檢測及全外顯子測序[12,15-17,23-24]結果顯示ErbB2基因有擴增突變，引起ErbB信號通路改變，促進腫瘤的發(fā)生[16]，這些異常的基因改變使之成為疾病不良預后的關鍵分子和治療靶點。

因此，隨著分子靶向治療策略的提出，靶向治療藥物被大量開發(fā)，廣泛應用于多種實體瘤中的治療。如針對于腫瘤血管生成和細胞增殖的多靶點酪氨酸激酶受體抑制劑侖伐替尼在原發(fā)性肝癌和甲狀腺癌中的應用，高選擇性VEGFR-2激酶抑制劑阿帕替尼在胃癌中的應用，靶向小分子蛋白激酶抑制劑奧斯替尼用于轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌一線治療，以及ErbB2抑制劑拉帕替尼在乳腺癌中的應用都取得了良好的臨床效果[10,11,22,25-27]。小分子酪氨酸激酶抑制劑吡咯替尼，是我國新批準的用于治療ErbB2陽性乳腺癌的靶向化療藥物，在目前的臨床研究結果中，吡咯替尼表現(xiàn)出良好的耐受性、安全性[28]，甚至有報道稱臨床療效超過了拉帕替尼[29]，為吡咯替尼在膽囊癌的應用提供了可能性。

在本研究中，用吡咯替尼處理膽囊癌細胞NOZ和SGC-996，隨后CCK-8實驗檢測細胞活力和細胞增殖情況，結果說明吡咯替尼能夠明顯抑制膽囊癌細胞的活力，抑制效果因不同細胞系而有差異，如吡咯替尼抑制NOZ細胞系的效果隨時間延長呈現(xiàn)平緩均勻的速度；對于SGC-996細胞系，用吡咯替尼處理前24、48 h的抑制效果變化不大，而到72 h抑制效果突然增加。接著進行的克隆形成實驗進一步說明了吡咯替尼有抑制膽囊癌細胞增殖的作用，并且對NOZ細胞系的效果明顯。出現(xiàn)以上結果可能原因是ErbB2的在該兩種細胞中表達量不同。Transwell實驗表明了吡咯替尼對膽囊癌細胞遷移和侵襲的抑制作用。

拉帕替尼在治療ErbB2/HER-2陽性乳腺腫瘤時可誘導增強體外細胞凋亡[28]。細胞凋亡是由一些列基因的激活、表達和調(diào)控等作用引起細胞的程序性的死亡，該過程可維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，在調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展中起了非常重要的作用[30-32]。為此，我們用吡咯替尼處理膽囊癌細胞后進行流式分析，通過檢測早期和晚期凋亡細胞率發(fā)現(xiàn)吡咯替尼可誘導膽囊癌細胞凋亡，并呈濃度依賴方式。凋亡的發(fā)生由多種通路途徑控制，最常見凋亡通路核心分子家族成員是Bcl-2家族和caspase家族[33]，細胞在發(fā)生凋亡時，Bax、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9、cleaved-PARP表達增加，對細胞凋亡起到促進作用，而另一方面，抗凋亡蛋白Bcl-2表達會降低[34-35]，事實也是如此，本研究通過Western blot分析最后得到的蛋白條帶變化與既往研究一致，即隨著吡咯替尼處理膽囊癌NOZ、SGC-996細胞系濃度增加，Bcl-2蛋白表達量降低，Bax蛋白表達量上調(diào)，Bcl-2/Bax比值明顯減小，相對的，cleaved-caspase 3、cleavedcaspase 9、cleaved-PARP蛋白表達量顯著增加。以上研究結果顯示，吡咯替尼可以促進膽囊癌細胞發(fā)生凋亡，其機制與誘導凋亡途徑相關蛋白表達和抑制抗凋亡蛋白表達有關。

綜上，吡咯替尼能夠通過增加凋亡蛋白表達，抑制抗凋亡蛋白表達促進細胞凋亡來發(fā)揮對膽囊癌細胞株NOZ、SGC-996的殺傷作用，為膽囊癌的治療提供了新的選擇及一定的實驗基礎。但該藥對臨床膽囊癌患者療效及安全性尚待進一步的研究，隨著后期體內(nèi)及臨床試驗的開展，可進一步評估該藥物對膽囊癌患者的靶向治療作用，并可能最終改善膽囊癌患者預后。