柏楊，劉洪，方征，李福利，朱振成，羅昆侖

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇四醫(yī)院 肝膽外科，江蘇 無錫214044）

肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)源于左右肝管匯合部以上的膽管上皮細(xì)胞，約占原發(fā)性肝惡性腫瘤的10%～15%左右，且呈逐年增高的趨勢[1-2]。因侵襲性強和預(yù)后差成為臨床醫(yī)師難以處理的一大棘手難題，目前尚無有效的預(yù)防方案和治療策略[3]。國內(nèi)外對ICC發(fā)生發(fā)展機制的研究從未停止。

高遷移率族蛋白1（high mobility group protein box 1，HMGB 1）作為晚期炎癥介質(zhì)，在不同組織細(xì)胞中均具有不同程度的表達(dá)，且在不同炎癥疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要的作用，如膿毒癥、關(guān)節(jié)炎、感染性休克、自身免疫性疾病等[4-5]。近年來研究[6]發(fā)現(xiàn)HMGB1通過不同炎癥通路參與腫瘤發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移過程。HMGB1參與DNA復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄過程[7]，且細(xì)胞外的HMGB1能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附性質(zhì)，參與細(xì)胞自噬過程，最終致使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤微血管生成[8]。雖然具體機制仍在研究中，HMGB1已經(jīng)證實與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，如：食管癌[9]、胰腺癌[10]、肝癌[11]、 胃 癌[12]等。

腫瘤是一種典型的血管依賴型病變，微血管生成是指在已有的血管床上，以芽生方式發(fā)出以毛細(xì)血管為主的新生血管形成過程，是腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中最重要的環(huán)節(jié)[13-14]。當(dāng)腫瘤大小超過1 mm時，其生長則需要新生血管的生成，亦是其擴(kuò)大與轉(zhuǎn)移的重要途徑[15]。目前腫瘤微血管密度（microvessel density，MVD）的檢測是判斷腫瘤微血管形成的金標(biāo)準(zhǔn)[16]。通過計算腫瘤組織中單位面積內(nèi)的微血管生成數(shù)來評估腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲能力，判斷預(yù)后。

闡明ICC發(fā)病的分子機制，有助于定位早期診斷的分子生物標(biāo)記物以及尋求藥物干預(yù)的靶點，從而提高該病的生存率。本研究通過檢測ICC組織HMGB1的表達(dá)與MVD計數(shù)，來探討ICC中HMGB1和腫瘤微血管生成在ICC中的相關(guān)性與臨床意義。

1 資料與方法

1.1 資料來源

收集解放軍第九〇四醫(yī)院2008年1月—2018年12月手術(shù)治療的ICC患者組織蠟塊標(biāo)本65例，包括癌組織與癌旁組織（距離腫瘤邊緣至少3 cm）。另收集正常肝內(nèi)膽管組織標(biāo)本30例（外傷后行肝部分切除術(shù)）。ICC患者中，男32例，女33例；高分化17例，中分化31例，低分化17例，直徑＜5 cm 22例，直徑≥5 cm 43例，所有組織標(biāo)本病理類型均經(jīng)病理證實。排除術(shù)前經(jīng)放化療、生物治療及中醫(yī)藥治療的病例。剔除失訪病例。所有病例資料收集均經(jīng)家屬及我院倫理協(xié)會同意。

1.2 免疫組化檢測各項目的表達(dá)

1.2.1 主要試劑 兔抗HMGB1單克隆抗體、兔抗CD31單克隆抗體（CD31為常用的微血管標(biāo)記物）均購自美國Abcam公司。

1.2.2 實驗方法 連續(xù)切取標(biāo)本蠟塊，厚度控制于5 μm，按SP法實驗，檢測HMGB1（一抗工作濃度為1:400），CD31（一抗工作濃度為1:100）的表達(dá)。以PBS代替一抗作為陰性對照，試劑公司提供的陽性著色圖片為陽性對照。

1.3 結(jié)果判定

HMGB1的陽性評定標(biāo)準(zhǔn)采用半定量法，參考Simons等[17]標(biāo)準(zhǔn)：光學(xué)顯微鏡下，半定量法評分。⑴ a：1分淺黃色、2分棕黃色、3分棕褐色；⑵ b：鏡下陽性細(xì)胞數(shù)占百分比，1分≤10%，2分11%～50%，3分51%～75%，4分75%以上。等級劃分標(biāo)準(zhǔn)：染色積分a×b，0～2分為（-），≥3分即為（+），其中3～5分為（+），5～8分為（++），9～12分則為（+++）。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[18]報道的方法統(tǒng)計MVD計數(shù)：低倍鏡下（×100）觀察染色后切片，選取視野中脈管數(shù)最豐富的區(qū)域（hot spot），再切換至高倍鏡下（×200）觀察3～5個視野，計數(shù)視野中的脈管數(shù)，取其平均值作為該病例組織標(biāo)本的MVD計數(shù)（脈管腔大于8個紅細(xì)胞數(shù)以及管腔壁存在平滑肌者忽略不計）。取所有標(biāo)本脈管數(shù)的平均值作為評定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)標(biāo)本脈管數(shù)小于等于平均值時，記作陰性，當(dāng)大于平均值時記作陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析軟件用SPSS 17.0，不同的組別之間差異運用χ2檢驗和P值分析，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析，Kaplan-Meier法檢測累積生存率，生存率差異比較采用 Log-rank檢驗。檢驗標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 HMGB1與MVD免疫組化結(jié)果

HMGB1陽性染色呈棕色或褐色，主要定位于細(xì)胞核，并向細(xì)胞質(zhì)及胞外具有穿透表達(dá)趨勢，以癌巢內(nèi)尤甚；CD31標(biāo)記的MVD主要定位在微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中，染色呈棕黃色或棕褐色；在腫瘤邊緣間質(zhì)中高表達(dá)，管腔擴(kuò)張，內(nèi)見癌細(xì)胞；在癌巢內(nèi)表達(dá)較少，管腔閉鎖呈條索狀，散在分布（圖1）。

HMGB1陽性表達(dá)率在ICC組織、癌旁組織、正常膽管組織中分別為58.5%（38/65）、33.8%（22/65）、13.3%（4/30）；兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ICC組織vs.癌旁組織：χ2=7.924，P＜0.05；ICC組織vs.正常膽管組織：χ2=16.948，P＜0.05；癌旁組織vs.正常膽管組織：χ2=4.345，P＜0.05）。MVD（CD31）的平均計數(shù)為12.66±5.8，≤12.66為低MVD計數(shù)，＞12.66為高M(jìn)VD計數(shù)。高M(jìn)VD計數(shù)率在ICC組織、癌旁組織、正常膽管組織中分別為49.2%（32/65）、24.6%（16/65）、6.7%（2/30）；兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ICC組織vs.癌旁組織：χ2=8.455，P＜0.05；ICC組織vs.正常膽管組織：χ2=16.182，P＜0.05；癌旁組織vs.正常膽管組織：χ2=4.306，P＜0.05）（表1）。

2.2 HMGB1與MVD計數(shù)與ICC患者臨床病理特征的聯(lián)系

HMGB1在ICC組織中的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的分化程度、血管侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移明顯有關(guān)（均P＜0.05）；HMGB1在ICC組織中的表達(dá)與患者的年齡、性別、及腫瘤的大小均無明顯關(guān)系（均P＞0.05）。MVD計數(shù)與ICC患者血管侵襲明顯有關(guān)（P=0.013），在65例病理組織中有血管侵襲的患者達(dá)到41例（63.1%）；MVD計數(shù)與患者年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、腫瘤的大小均無明顯關(guān)系（均P＞0.05）（表2）。

圖1 免疫組化檢測結(jié)果（×200）Figure 1 Results of immunohistochemical staining (×200)

表1 各標(biāo)本組織中HMGB1表達(dá)與MVD計數(shù)比較[n（%）]Table 1 Comparison of the HMGB1 expressions and MVD counts among groups [n (%)]

表2 HMGB1表達(dá)及MVD計數(shù)與ICC患者臨床病理因素的關(guān)系[n（%）]Table 2 Relations of HMGB1 expression and MVD count with the clinicopathologic factors of ICC patients [n (%)]

2.3 ICC組織中HMGB1表達(dá)與MVD計數(shù)相關(guān)性分析

利用χ2檢驗和Spearmen相關(guān)系數(shù)分析法對表中數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示，在65例ICC標(biāo)本組織中HMGB1的表達(dá)與MVD計數(shù)呈明顯正相關(guān)（r=0.330，P=0.008）（表3）。

表3 ICC組織中HMGB1表達(dá)與MVD計數(shù)的相關(guān)性Table 3 Correlation analysis between HMGB1 and MVD expressions in tumor tissue

2.4 ICC患者的生存分析

所有患者的生存信息收集均采用電話、信件方式隨訪。腫瘤組患者的平均生存時間為25個月，中位生存時間為17個月。ICC患者術(shù)后的1、3、5年生存率分別為55.4%、36.9%、7.7%。

ICC患者中，HMGB1陽性患者生存率明顯低于HMGB1陰性者（χ2=6.278，P=0.012）；高M(jìn)VD計數(shù)患者生存率明顯低于低MVD計數(shù)患者（χ2=5.101，P=0.024）；進(jìn)一步分析顯示，HMGB1陽性+高M(jìn)VD計數(shù)患者生存率最低，分別低于HMGB1陰性+低MVD計數(shù)患者（χ2=5.979，P=0.014）、HMGB1陽性+低MVD計數(shù)患者（χ2=4.305，P=0.038）、HMGB1陰性+高M(jìn)VD計數(shù)患者（χ2=4.344，P=0.037）（圖2）。

圖2 不同HMGB1與MVD狀態(tài)ICC患者生存曲線 A：HMGB1陽性患者與HMGB1陰性患者比較；B：高M(jìn)VD計數(shù)患者與低MVD計數(shù)患者比較；C：HMGB1陽性+高M(jìn)VD計數(shù)患者與HMGB1陰性+低MVD計數(shù)患者比較；D：HMGB1陽性+高M(jìn)VD計數(shù)患者與HMGB1陽性+低MVD計數(shù)患者比較；E：HMGB1陽性+高M(jìn)VD計數(shù)患者與HMGB1陰性+高M(jìn)VD計數(shù)患者比較Figure 2 Survival curves of ICC patients with different HMGB1 and MVD statuses A: Comparison between patients with positive and negative HMGB1 expression; B: Comparison between patients with high and low MVD count; C: Comparison between patients with positive HMGB1 plus high MVD count and patients with negative HMGB1 plus low MVD count; D: Comparison between patients with positive HMGB1 plus high MVD count and patients with positive HMGB1 plus low MVD count; E: Comparison between patients with positive HMGB1 plus high MVD count and patients with negative HMGB1 plus low MVD count

3 討 論

雖然ICC的發(fā)病機制尚不清楚，但目前已經(jīng)達(dá)成共識的危險因素包括原發(fā)性硬化性膽管炎、肝吸蟲病、膽結(jié)石和慢性丙型肝炎病毒感染[19]。這些危險因素所誘發(fā)的慢性炎癥與肝內(nèi)膽道梗阻形成了復(fù)雜的促腫瘤生成微環(huán)境[20]。在腫瘤微環(huán)境中，細(xì)胞因子、趨化因子和活性氧誘導(dǎo)炎癥介導(dǎo)的免疫細(xì)胞募集，導(dǎo)致膽道上皮細(xì)胞壞死，引起HMGB1向細(xì)胞外環(huán)境主動分泌和被動釋放[21]。而HMGB1的釋放又進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，使得ICC的腫瘤微環(huán)境中存在炎癥與的癌變的惡性循環(huán)。

腫瘤的微血管生成為腫瘤的發(fā)展提供血液和營養(yǎng)物質(zhì)，與惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系[22]，且微血管計數(shù)MVD越多，腫瘤細(xì)胞生長越旺盛，惡性程度越高，病患預(yù)后越差[23]。國外學(xué)者Shpitz等[24]通過對178例結(jié)腸癌患者的標(biāo)本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)癌旁病灶內(nèi)細(xì)胞在異型增生的過程中，組織內(nèi)的MVD計數(shù)也在不斷攀升，在腫瘤細(xì)胞開始起源時其新生血管就已經(jīng)開始活躍，MVD可作為重要判定預(yù)后的指標(biāo)。MVD水平的升高，增強了腫瘤的侵襲能力，導(dǎo)致患者生存期越短，該理論在膽囊癌[25]、胃間質(zhì)瘤[26]和胰腺癌[27]中也得到了證實。

HMGB1作為細(xì)胞核內(nèi)非組蛋白，與HMGB2、HMGB3共同組成HMGB家族，早期被認(rèn)為是染色質(zhì)的組成部分，參與DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，暴露轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點[28]。至1999年Wang等[29]提出，其作為炎癥因子具有促細(xì)胞增殖分化、促炎癥發(fā)展的作用。近年來對HMGB1研究的深入，已明確微環(huán)境內(nèi)高表達(dá)的HMGB1通過啟動激活炎癥通路，促使細(xì)胞凋亡逃逸和永恒增殖，進(jìn)而促進(jìn)了癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移[30]。HMGB1可能通過以下方式促進(jìn)腫瘤微血管的生成：⑴ HMBG1/RAGE/NF-κB信號軸的激活[31]，機體受到炎癥刺激時，細(xì)胞外HMGB1通過與相應(yīng)靶細(xì)胞表面抗體結(jié)合，啟動信號通路，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB水平上調(diào)，其調(diào)控的促血管生成因子水平上升，推動微血管生成；⑵ HMGB1與RAGE受體結(jié)合后可以激活細(xì)胞內(nèi)MAPK信號通路[32]，最終導(dǎo)致細(xì)胞外信號調(diào)解激酶（EPK）1/2的活化，使組織微環(huán)境內(nèi)修復(fù)能力增強，內(nèi)皮細(xì)胞增殖活躍，促進(jìn)了微血管生成[33]；⑶ JAK/STAT信號通路[34]：STAT在正常組織中很少甚至沒有活化，HMGB1通過該通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，使STAT水平上調(diào)，特別是STAT3的過度活化，可直接致使腫瘤細(xì)胞逃逸凋亡，加速腫瘤微環(huán)境中微血管生成[35]；此外，HMGB1在炎癥反應(yīng)中可以直接致使內(nèi)皮祖細(xì)胞及造血干細(xì)胞的激活，加速炎癥損傷局部微環(huán)境中微血管的生成；HMGB1與肝臟脂肪代謝產(chǎn)物肝磷脂結(jié)合，可以促進(jìn)促血管生成因子上調(diào)[36]。

本研究通過免疫組化方法檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤組織、癌旁組織、正常組織中HMGB1以及MVD計數(shù)的變化是呈逐漸減弱趨勢的，差異均具有統(tǒng)計意義；而且相關(guān)性分析也證實HMGB1的表達(dá)與MVD計數(shù)呈正相關(guān)（r=0.330，P=0.008）。由此可見，HMGB1在癌組織中表達(dá)最為活躍，其在腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展過程中起重要的推進(jìn)作用，微血管密度的表達(dá)情況亦與HMGB1呈現(xiàn)同步性，可見HMGB1可以促進(jìn)腫瘤微血管的形成，加強腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。而具體的機制也有待我們完善更深層次探究。

臨床病理因素聯(lián)系的分析結(jié)果與筆者以往所做研究結(jié)果相符[37]，HMGB1的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的分化程度、血管侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），與患者的年齡、性別、腫瘤的大小無關(guān)（P＞0.05）；MVD檢測結(jié)果提示MVD計數(shù)與腫瘤血管侵襲亦存在密切聯(lián)系（P＜0.05），而與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤的分化程度均無關(guān)（P＞0.05）。因此得出，HMGB1與MVD與ICC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，過表達(dá)的HMGB1通過各種信號通路系統(tǒng)誘導(dǎo)癌旁組織微血管生成活躍，直接使進(jìn)腫瘤的生長發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移；而MVD計數(shù)的增加更是預(yù)示腫瘤侵襲能力的增強，為腫瘤的轉(zhuǎn)移和生長都提供了重要的途徑。

通過對65例ICC患者生存率分析可知，HMGB1表達(dá)與MVD計數(shù)對患者的預(yù)后具有重要的影響，HMGB1陽性比HMGB1陰性表達(dá)著生存率明顯降低，MVD亦是如此，且當(dāng)HMGB1與MVD的表達(dá)同時陽性時，患者生存率最低。惡性腫瘤最重要的特征就是轉(zhuǎn)移，在此過程中癌細(xì)胞從原發(fā)部位向毗鄰組織或遠(yuǎn)處進(jìn)展。腫瘤微血管生成是重要環(huán)節(jié)，本研究的數(shù)據(jù)表明HMGB1過表達(dá)通過促進(jìn)微血管生成誘導(dǎo)并賦予ICC細(xì)胞更強有力的轉(zhuǎn)移能力，ICC患者HMGB1表達(dá)水平與腫瘤微血管生成影響患者的最終生存時間，對其預(yù)后有重要的預(yù)測作用，HMGB1與MVD的預(yù)警意義值得更深入的研究。

綜上所述，HMGB1與腫瘤微血管生成對于ICC患者的預(yù)后具有重要的警示意義，其是否可應(yīng)用于臨床上作為ICC患者的預(yù)測指標(biāo)，還需要更深入研究。目前國內(nèi)外相關(guān)的報道是極少的，若能抑制ICC中HMGB1的高表達(dá)，達(dá)到阻斷腫瘤微血管生成的效果，有望延緩腫瘤的發(fā)生發(fā)展。該研究也為攻克ICC這一難題提供了新的思路。