陶 軍，蘭秀錦

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，成都 611130；2.綿陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川綿陽(yáng) 621023）

對(duì)于小麥這種自花授粉作物，獲得雄性不育是雜種優(yōu)勢(shì)利用的基礎(chǔ)，而可遺傳的雄性不育又最為經(jīng)濟(jì)有效。最早于1951 年就報(bào)道用核替換的方法得到了不同種的核質(zhì)互作形成的小麥不育系[1]，這也成為后來創(chuàng)造不育的一種方法，這種不育系具有異源細(xì)胞質(zhì)。在沒有異源細(xì)胞質(zhì)存在的情況下，1959年就已經(jīng)在小麥種間雜交后代中發(fā)現(xiàn)了不育材料[2]。至今人們已經(jīng)在小麥中發(fā)現(xiàn)了很多種不育。眾所周知，在遠(yuǎn)緣雜交中F1常表現(xiàn)為不育，不育的原因是F1的兩個(gè)親本之間的親緣關(guān)系太遠(yuǎn)，來自兩個(gè)親本的兩套染色體不能夠很好地配對(duì)，減數(shù)分裂時(shí)同源染色體不能正常地配對(duì)并分離到兩個(gè)子細(xì)胞中去，只能隨機(jī)地分離，因此理論上很難有包含正常染色體數(shù)目的配子，這些不具有完整染色體的配子通常不能形成有功能的花粉粒?，F(xiàn)在在常規(guī)育種中發(fā)現(xiàn)了一種F1不育現(xiàn)象，首先是育成了一個(gè)帶有一對(duì)中間偃麥草外源染色體的小麥材料（2n=42，后定名為014-459），2006 年用 014-459 與另一普通小麥雜交，2007 年種植成的F1在開花期表現(xiàn)為不育，套袋結(jié)實(shí)率為0。連續(xù)幾年重新配制這一組合及其反交組合，種植成的正反交組合F1套袋結(jié)實(shí)率均為0，用親本回交得到的F1群體出現(xiàn)育性分離。用014-459與參加四川省區(qū)域試驗(yàn)的材料進(jìn)行雜交測(cè)配，發(fā)現(xiàn)014-459 與川麥 55 正反交 F1均為不育，014-459 與綿08-9 正反交F1均為可育。用014-459 與不同親本雜交，得到的F1育性出現(xiàn)根本性的差異，說明這種不育現(xiàn)象與遠(yuǎn)緣雜交F1不育不同。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

自育高代材料014-459，四川省審定品種川麥55，區(qū)域試驗(yàn)參試品系綿08-9，審定品種川麥107。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 F1育性分析

用014-459 分別與川麥55 和品系綿08-9 配制F1。不同年份分別種植014-459 和F1，抽穗后開花前對(duì)主穗套袋，灌漿后成熟收獲前調(diào)查結(jié)實(shí)率，用套袋結(jié)實(shí)率代表育性。套袋結(jié)實(shí)率分為國(guó)內(nèi)法和國(guó)際法兩種，以國(guó)內(nèi)法統(tǒng)計(jì)的結(jié)實(shí)率為主，只是在進(jìn)行群體分群時(shí)以國(guó)內(nèi)法結(jié)果結(jié)合國(guó)際法結(jié)果作為依據(jù)，兩者均為零的才作為不育。結(jié)實(shí)率國(guó)內(nèi)法=[（每小穗基部?jī)尚』ńY(jié)實(shí)粒數(shù)/（每穗小穗數(shù)×2）]×100%，結(jié)實(shí)率國(guó)際法=[（每穗基部小花結(jié)實(shí)粒數(shù)+每穗中部小花結(jié)實(shí)粒數(shù)）/(每穗小穗數(shù)×2)]×100%[3]。

1.2.2 F1染色體配對(duì)情況分析

在小麥孕穗期分別取不育F1和可育F1的幼穗，立即放入固定液Ⅱ溶液中，處理24 小時(shí)后，將其移入75%乙醇液中，置于4 ℃冰箱長(zhǎng)期保存。觀察染色體配對(duì)情況時(shí)將保存在75%乙醇液中的幼穗取出，用水沖洗，取小穗基部小花花藥，滴加一滴改良苯酚品紅，將花藥壓碎，顯微鏡下檢查，尋找合適的花藥，如果處于減數(shù)分裂中期，則壓片，用Olympus BX-51 配備的SenSys Olympus DP70 CCD SenSys Olympus DP70 CCD 成像系統(tǒng)照相，保存文件。固定液Ⅱ配方：無水乙醇∶氯仿∶冰醋酸=6∶3∶1。

1.2.3 育性關(guān)聯(lián)分析方法

2015 年配制雜交組合川麥 55×綿 08-9，2016年種植組合（川麥55×綿08-9）F1，并配制復(fù)合雜交014-459×（川麥 55×綿 08-9）F1，2016 年秋種植復(fù)合雜交F1，2017 年抽穗期至開花前于田間對(duì)復(fù)合雜交F1群體每一單株主穗進(jìn)行套袋，灌漿后成熟前調(diào)查結(jié)實(shí)率。苗期取復(fù)合雜交F1群體每一單株幼嫩葉片，-20 ℃冰箱保存，待調(diào)查結(jié)實(shí)率后根據(jù)結(jié)實(shí)率數(shù)據(jù)選取極端表型的單株，將復(fù)合雜交F1群體分群，取結(jié)實(shí)率高和完全不育的單株（套袋結(jié)實(shí)率國(guó)內(nèi)法及國(guó)際法均為0）各20 株分別組成可育群和不育群，加上親本 014-459 及（川麥 55×綿 08-9）F1，由北京百邁克公司進(jìn)行SLAF 分析。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組分析方法

于小麥抽穗后開花前分別取3 種材料014-459、川麥55 以及014-459 與川麥55 配制的F1的花藥，未設(shè)重復(fù)，對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，RNA 提取及分析由北京百邁克公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 F1染色體配對(duì)結(jié)果

不育F1（014-459/川麥55）與可育F1（014-459/綿08-9）減數(shù)分裂中期同源染色體配對(duì)情況比較相似，沒有明顯的差異，在減數(shù)分裂中期Ⅰ，大多數(shù)細(xì)胞的42 條染色體配對(duì)形成20 個(gè)二價(jià)體和2 個(gè)單價(jià)體，不育F1和可育F1在減數(shù)分裂末期少量細(xì)胞出現(xiàn)微核，但比例小，絕大多數(shù)細(xì)胞不出現(xiàn)微核。不育F1及可育F1減數(shù)分裂中期同源染色體配對(duì)觀察結(jié)果分別如圖1 和圖2。

圖1 不育F1 的減數(shù)分裂圖Figure 1 Meiosis map of male sterility F1

圖2 可育F1 減數(shù)分裂圖Figure 2 Meiosis of male fertility F1

2.2 試驗(yàn)材料及F1代育性結(jié)果

對(duì)親本014-459 及其F1不同年份的育性作了觀察，2014 年田間調(diào)查正反交不育F1，因所有調(diào)查穗都未結(jié)實(shí)，故未調(diào)查每穗小穗數(shù)，這不影響計(jì)算結(jié)實(shí)率，其結(jié)實(shí)率均為0，014-459 及可育F1套袋結(jié)有部分種子。2017 年調(diào)查014-459、F1及對(duì)照川麥104 自交結(jié)實(shí)率，結(jié)果如下表1。

不育F1正反交在幾個(gè)播種時(shí)期播種，均較穩(wěn)定地表現(xiàn)為不育，有個(gè)別播種期在個(gè)別植株上偶爾結(jié)有幾粒種子，平均算下來就是某一播期的結(jié)實(shí)率不到0.5%（國(guó)內(nèi)法）。對(duì)照栽培種川麥107 從早播到晚播結(jié)實(shí)率都比較高，也較穩(wěn)定，而親本014-459自交結(jié)實(shí)率在不同年份間變化范圍為42.74%～58.70%，其套袋自交結(jié)實(shí)率不高，原因有待研究。不育F1與可育F1染色體配對(duì)情況相似，但不育F1套袋自交結(jié)實(shí)率為0，雖然可育F1結(jié)實(shí)率也不高，但兩者明顯不同，從染色體配對(duì)情況來考慮，不能找到育性差異的原因。不育組合F1之反交組合仍為不育，說明了這種F1不育不是由于細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)引起的。對(duì)照品種在不同播種期的結(jié)實(shí)率有一些變動(dòng)，但總體還是較穩(wěn)定的，也說明作為育性指標(biāo)的結(jié)實(shí)率易受到各種因素的影響，即使材料本身正?？捎?，也可能因?yàn)殚_花時(shí)的偶然因素如當(dāng)時(shí)的溫度、濕度、風(fēng)，或植株受到病蟲等的影響而不能達(dá)到100%。

表1 不同時(shí)期結(jié)實(shí)率Table 1 Selfing seed rate in different sowing time

2.3 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

對(duì)歐式距離（euclidean distance，ED）算法和SNP-index 方法這兩種關(guān)聯(lián)分析方法得到的結(jié)果取交集，得到與目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的區(qū)域在染色體上的位置，共3 個(gè)區(qū)段。歐氏距離是利用測(cè)序數(shù)據(jù)尋找混池間存在的顯著差異標(biāo)記，并以此評(píng)估與性狀關(guān)聯(lián)區(qū)域的方法?；斐亻g除了目標(biāo)性狀相關(guān)位點(diǎn)存在差異，其他位點(diǎn)均趨向于一致。歐氏距離取所有位點(diǎn)擬合值的平均+3SD 作為分析的關(guān)聯(lián)閾值，計(jì)算得其值為0.41，根據(jù)關(guān)聯(lián)閾值判定，得到關(guān)聯(lián)區(qū)域。SNP-index 尋找混池之間基因型頻率的顯著差異進(jìn)行標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析，用ΔSNP-index 統(tǒng)計(jì)。3 個(gè)關(guān)聯(lián)區(qū)段的位置，大小和其上的基因數(shù)列于下表2。

表2 關(guān)聯(lián)區(qū)域信息統(tǒng)計(jì)表Table 2 Information of associated region

2.4 差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)

差異表達(dá)基因集基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)如下表3。

將材料兩兩間差異基因繪成維恩圖（圖3），以方便了解材料間差異情況。

2.5 對(duì)候選基因的分析

目標(biāo)基因在014-459 或川麥55 中存在，或者是不同的基因分別存在二者中，都使親本表現(xiàn)為可育性狀，然而在014-459 與川麥55 配制的正反交F1中，目標(biāo)基因仍然存在，但卻使F1表現(xiàn)為不育，因此最大的可能不是目標(biāo)基因的有無而是目標(biāo)基因的表達(dá)或者是兩個(gè)不同基因相互作用使基因表達(dá)發(fā)生變化而使育性發(fā)生了變化，否則目標(biāo)基因從材料014-459 到F1時(shí)不會(huì)變?yōu)椴挥Ｒ虼四繕?biāo)基因應(yīng)該存在于不育F1中，不論是來自014-459 還是川麥55，或是分別存在二者中，而014-459 和川麥55 均為可育，因此可能是目標(biāo)基因的表達(dá)發(fā)生了變化；同樣，從川麥55 到不育F1也應(yīng)是同樣的目標(biāo)基因表達(dá)發(fā)生了差異，才可能使可育發(fā)生變化，成為不育，也就是說目標(biāo)基因應(yīng)該是在兩個(gè)過程中都發(fā)生了相同的表達(dá)差異的變化，而且應(yīng)該是差異表達(dá)作用方向一致，才能使親本從可育轉(zhuǎn)變?yōu)镕1不育。為此，為了縮小尋找范圍，將差異表達(dá)的基因限定到014-459與F1不育之間的差異中和川麥55 與F1不育之間的差異中的共同部分，就是圖3 中差異基因數(shù)目為1 369 和1 234 的兩部分，對(duì)這兩部分組成的合并部分的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。為進(jìn)一步縮小范圍，結(jié)合SLAF 結(jié)果，選取差異表達(dá)的基因位置落在SLAF 分析所得到的3 個(gè)區(qū)段上的基因，共9 個(gè)，列于下表，對(duì)這些基因進(jìn)行分析結(jié)果如表4。

基因9 從014-459 到不育F1時(shí)其表達(dá)量是下降的，但在從川麥55 到不育F1時(shí)其表達(dá)量是上升的，即它表達(dá)量上升或下降都能形成不育，因此基因9 與F1出現(xiàn)不育無關(guān)，它不是造成不育的原因，不是目標(biāo)基因的候選者。對(duì)這些候選基因的注釋進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)一些基因在可育親本與不育F1中雖然表達(dá)差異大，但在有些數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有注釋。為了便于稱呼與區(qū)分，將這選出的9 個(gè)表達(dá)有差異的基因稱為候選基因。

在對(duì)候選基因進(jìn)行的注釋中發(fā)現(xiàn)編號(hào)為8 的基因名為 2D01G027900，GO 注釋號(hào)是 0009753，功能是對(duì)茉莉酸起響應(yīng)，而茉莉酸在調(diào)控花藥開裂方面有作用，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了很多不育與茉莉酸代謝有關(guān)，因此基因2D01G027900 很有可能就是與F1不育有關(guān)的基因。

表3 差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)表Table 3 Number of differential expression genes

圖3 差異表達(dá)基因維恩圖Figure 3 Venn diagram of differential expression genes

表4 候選差異基因的表達(dá)Table 4 Differential expression of candidated genes

3 討論與結(jié)論

014-459 與川麥55 及綿08-9 分別配制雜交組合，外源染色體均難與普通小麥染色體配對(duì)，在F1中42 條染色體中的大多數(shù)能形成二價(jià)體，不育F1與可育F1相比較，染色體配對(duì)情況沒有太大差異，而育性卻出現(xiàn)了顯著差異，配對(duì)行為不是育性表現(xiàn)出差異的原因。因此由014-459 得到的F1不育性應(yīng)該與遠(yuǎn)緣雜交F1不育有所不同。小麥的不育類型大致分為3 類：核基因不育、細(xì)胞質(zhì)不育和環(huán)境條件影響的不育。核基因不育包括隱性核基因不育和顯性核基因不育，ms1 的幾個(gè)等位基因[2，4-8]、濰型不育、普通小麥的一對(duì)染色體被長(zhǎng)穗偃麥草染色體代換造成的不育（VE 型不育）[9-10]和 DSV 型不育[11]均屬于隱性核基因不育；太谷核不育 ms2[12-14]、ms3[15]和 ms4[16]，M1376[17]屬于顯性核基因不育。細(xì)胞質(zhì)不育包括異源細(xì)胞質(zhì)不育，如T[18]、K 和V[19]型細(xì)胞質(zhì)不育、通北野燕麥細(xì)胞質(zhì)（黔型）不育[20]、智利野生大麥細(xì)胞質(zhì)不育[21]，以及普通小麥細(xì)胞質(zhì)不育或由普通小麥細(xì)胞質(zhì)經(jīng)過變異得到的不育，如AL 型[22]、92-18A[23]不育、F 型不育[24-25]、Primepi 細(xì)胞質(zhì)不育[26]、85EA[27-28]、89AR[27]不育等。環(huán)境條件影響的不育主要是溫光敏或光溫敏型不育。包括由細(xì)胞質(zhì)作用導(dǎo)致的溫或光敏型不育以及非細(xì)胞質(zhì)作用的溫或光敏型不育。細(xì)胞質(zhì)作用導(dǎo)致的溫或光敏型不育包括D2類細(xì)胞質(zhì)[29]、KM 型兩系雜交小麥[30]、YM[31]、YS[31]型不育和四川南充T 型細(xì)胞質(zhì)兩用系[32]不育等；非細(xì)胞質(zhì)作用導(dǎo)致的溫或光敏型不育，包括重慶溫光型不育C49S 類[33]、河南BNS[34]以及兩極不育類94-337s[35]（極端早播與極端晚播時(shí)不育，正常播種期播種表現(xiàn)為可育）、湖南 ES 類[36]、北京市農(nóng)科院的 BS20[37]和 BS366[38]等。014-459 有一對(duì)來自中間偃麥草的外源染色體，是小麥一對(duì)染色體被一對(duì)中間偃麥草染色體代換，其本身可育，014-459 分別與川麥55 及綿08-9 配制的雜交組合F1育性出現(xiàn)顯著差異，與普通小麥的一對(duì)染色體被一對(duì)長(zhǎng)穗偃麥草染色體代換得到的代換系VE 型不育不同。由014-459 得到的這種不育現(xiàn)象與細(xì)胞質(zhì)不育及已知的顯性或隱性核不育不同，也不同于環(huán)境條件影響形成的不育。通過研究不育基因在染色體上的位置，發(fā)現(xiàn)不育基因存在于多條染色體上，如4BS[6-8，39，40]（主要是ms1 的幾個(gè)等位 基 因）、4DS（ms2[14，41]，ms4[16]）、5AS（ms3）[42]、3AL（ms5[7]）、7B（VE 型不育）[10]、1BS[19，31]、3A（農(nóng)大3338）[43]、2B[44-46]、5B[44]和 7DS[46]。根據(jù) SLAF 分析得知 014-459導(dǎo)致的不育的育性關(guān)聯(lián)區(qū)域在2D 染色體上，與以往發(fā)現(xiàn)的不育基因位置不同；另外014-459 F1不育是在一條中間偃麥草染色體存在的情況下表現(xiàn)不育，因此2D 染色體上與育性有關(guān)系的基因可能不是單獨(dú)起作用，而是與中間偃麥草染色體共同起作用才產(chǎn)生不育。茉莉酸（Jasmonates，JA）是植物應(yīng)答刺激以及調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育過程的一種植物激素，能誘導(dǎo)開花習(xí)性，使穎花開放，在調(diào)控花藥開裂方面起重要作用，很多擬南芥不育與茉莉酸代謝途徑有很大關(guān)系。一般認(rèn)為亞麻酸是JA 合成的基礎(chǔ)，JA 生物合成的主要通路[47]：膜脂-亞麻酸-13HPOT-OPDA-JA，其中膜脂經(jīng)磷脂酶作用釋放亞麻酸，亞麻酸被LOX酶氧化為 13HPOT，13HPOT 由 AOS 和 AOC 酶轉(zhuǎn)化成OPDA，OPDA 被酶OPR 經(jīng)一步還原反應(yīng)和3 步β 氧化成為JA。各步所需的酶為磷脂酶PLA，脂加氧酶LOX，丙二烯氧化物合成酶AOS，丙二烯氧化物環(huán)化酶AOC，12-氧代-植物二烯酸鹽還原酶OPR，每一個(gè)酶都對(duì)JA 的合成起調(diào)控作用，進(jìn)而影響花藥開裂。由小麥材料014-459 導(dǎo)致的F1不育，田間表現(xiàn)為穎殼張開，花絲會(huì)伸長(zhǎng)，花藥露出穎殼，花藥顏色也會(huì)變黃，但是不開裂，幾天后花藥干枯萎蔫。結(jié)合F1不育的田間表現(xiàn)與基因注釋，認(rèn)為GO注釋號(hào)是0009753，功能為對(duì)茉莉酸起響應(yīng)的基因2D01G027900 是F1表現(xiàn)出不育的關(guān)聯(lián)基因。