律 玲,陰繼凱,張 章,董 瑞,魯建國,王 棟*

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院預(yù)防保健科,西安 710038;2空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院普通外科;*通訊作者,E-mail:wdyt021@126.com)

肝硬化引起的入肝血流機(jī)械性阻力增加是肝內(nèi)型門靜脈高壓癥的最初和根本原因之一。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)是肝纖維化細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的主要合成細(xì)胞,其活化與增殖是肝纖維化過程發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[1,2],因此有效抑制HSC活化增殖是治療肝纖維化的重要靶點(diǎn)之一。JAK/STAT通路是一條多種細(xì)胞因子共用的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,在JAK的4個(gè)亞型和STAT 7種亞型中JAK2/STAT3通路是最重要的通路之一,其廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等生理過程[3]。多種研究表明通過抑制JAK/STAT通路可以明顯抑制HSC活化過程,但尚無臨床應(yīng)用的藥物出現(xiàn)。蘆可替尼(ruxolitinib)是一種新型JAK1和JAK2選擇性抑制口服靶向藥物,目前臨床主要應(yīng)用于骨髓纖維化治療的靶向治療[4],相關(guān)研究也多集中在骨髓纖維化等血液系統(tǒng)疾病,但是在肝臟相關(guān)疾病研究極少,因此本研究嘗試探討蘆可替尼對(duì)HSC活化增殖過程等細(xì)胞行為的影響,以期為肝硬化門靜脈高壓癥的治療探索新的可能的治療途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

原代大鼠HSC購于Sciencell公司;p-JAK2抗體、JAK2抗體、p-JAK1抗體、JAK1抗體、p-STAT3抗體、STAT3抗體、cyclin D1抗體、cleaved caspase-3抗體購于Abcam公司;α-SMA抗體購于Santa Cruz公司;CCK8檢測(cè)試劑盒購于日本同仁公司;胎牛血清購于Gibco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1.2.1 HSC的培養(yǎng) 大鼠原代HSC接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,在37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng),當(dāng)原代培養(yǎng)的HSC鋪滿培養(yǎng)瓶底面積的80%左右時(shí)開始傳代。調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/ml,每孔加入2 ml,加入6孔板中,放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至單層細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及確定最佳藥物干預(yù)條件 以p-JAK2/JAK2蛋白表達(dá)評(píng)價(jià)JAK2通路激活程度,以α-SMA蛋白表達(dá)評(píng)價(jià)HSC活化程度。將HSC分為空白對(duì)照組(NC)、IL-6實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和IL-6+ruxolitinib實(shí)驗(yàn)組。分別加入IL-6(20 ng/ml)和IL-6(20 ng/ml)+ruxolitinib(25,50,75 μmol/L),檢測(cè)ruxolitinib不同濃度及時(shí)間下對(duì)JAK2通路及HSC活化程度的影響。IL-6組于IL-6作用后24 h進(jìn)行處理細(xì)胞,提取蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)p-JAK2/JAK2及α-SMA表達(dá)。IL-6+ruxolitinib(25,50,75 μmol/L)組分別在干預(yù)12,24,48 h后處理HSC并提取蛋白后行Western blot檢測(cè)HSC中p-JAK2蛋白、JAK2蛋白及α-SMA蛋白表達(dá)量。

1.2.3 免疫熒光染色 常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞,用4%多聚甲醛固定;PBS漂洗3次,加入封閉液室溫封閉30 min后PBS清洗后加入用PBS-TX(含0.4% Triton X-100的PBS溶液)稀釋的α-SMA單克隆抗體一抗稀釋液(稀釋比例1 ∶200),4 ℃過夜;PBS-TX洗3次,加入二抗稀釋液,室溫避光孵育1 h;加入用PBS-TX稀釋的DAPI室溫染色3 min;棄去DAPI,PBS-TX漂洗后在載玻片上加上抗淬滅劑,在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 常規(guī)方法提取細(xì)胞蛋白并將濃度調(diào)整一致,JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、α-SMA、COL1A1、cyclin D1、cleaved caspase-3抗體的工作濃度分別為1 ∶200、1 ∶200、1 ∶100、1 ∶200、1 ∶100、1 ∶200、1 ∶1 000、1 ∶500、1 ∶200、1 ∶400。蛋白條帶掃描后計(jì)算目標(biāo)蛋白與相應(yīng)內(nèi)參比值。

1.2.5 CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè) 按日本同仁公司(DOJINDO CO.,Ltd,JAPAN)CCK8檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 取出Transwell小室放置在24孔培養(yǎng)板里,Transwell小室內(nèi)外加入少許無血清培養(yǎng)基,潤化10 min左右。用BD的基質(zhì)膠1 ∶40稀釋(無血清培養(yǎng)基),然后在每個(gè)小室中加入100 μl,在37 ℃條件下放置1 h。常規(guī)消化HSC細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)基稀釋至1×105個(gè)/ml,取200 μl的HSC細(xì)胞懸液加入Transwell小室(小室孔徑8 μm),24孔下室中加入500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基,避免氣泡產(chǎn)生。24 h后取出Transwell小室,PBS沖洗3次,清除微孔膜內(nèi)層細(xì)胞后用70%酒精固定5 min,PBS沖洗2次,0.1%結(jié)晶紫染色30 min,去離子水中洗3遍,取10個(gè)視野觀察并求平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 確定蘆可替尼最佳干預(yù)條件及分組

通過不同條件下處理HSC細(xì)胞后用Western blot檢測(cè)HSC中p-JAK2/JAK2及α-SMA的表達(dá)情況,結(jié)果見圖1。蘆可替尼(75 μmol/L)干預(yù)24 h后p-JAK2/JAK2及α-SMA表達(dá)顯著下降,最終確定IL-6活化的HSC用蘆可替尼75 μmol/L作用24 h即可達(dá)到顯著抑制JAK2通路及降低HSC活化程度的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹Ｒ虼舜_定實(shí)驗(yàn)分組為空白對(duì)照(NC)組、IL-6(20 ng/ml)組和IL-6(20 ng/ml)+ruxolitinib(75 μmol/L)組,干預(yù)時(shí)間24 h。

1.control組;2.IL-6組;3-5.分別為IL-6+25,50,75 μmol/L Ruxo組作用12 h;6-8.分別為IL-6+25,50,75 μmol/L Ruxo組作用24 h;9-11.分別為IL-6+25,50,75 μmol/L Ruxo組作用48 h圖1 Western blot檢測(cè)蘆可替尼干預(yù)后肝星狀細(xì)胞胞內(nèi)蛋白表達(dá)Figure 1 Western blot analyses of protein expression in HSC after ruxolitinib treatment

2.2 Western blot檢測(cè)HSC中各蛋白的表達(dá)程度

Western blot檢測(cè)IL-6(20 ng/ml)組、IL-6+ruxolitinib(75 μmol/L)組及對(duì)照組(NC)細(xì)胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3、COL1A1、cyclin D1、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)情況,結(jié)果見圖2。IL-6組中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3、COL1A1、cyclin D1的蛋白表達(dá)均明顯高于NC組(P<0.05);IL-6+ruxolitinib組中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3、COL1A1、cyclin D1的蛋白表達(dá)較IL-6組明顯降低(P<0.05),而cleaved caspase-3的表達(dá)明顯增高(P<0.05);NC組與IL-6組中cleaved caspase-3蛋白表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。

圖2 蘆可替尼(75 μmol/L)干預(yù)24 h肝星狀細(xì)胞中各種蛋白表達(dá)情況Figure 2 Western blot analysis of protein expression in HSC after ruxolitinib(75 μmol/L) treatment for 24 h

2.3 免疫熒光染色檢測(cè)HSC中α-SMA蛋白表達(dá)

免疫熒光染色檢測(cè)HSC中α-SMA蛋白表達(dá),以各組平均積分光密度(IOD)作為結(jié)果進(jìn)行分析,結(jié)果顯示IL-6組中α-SMA表達(dá)較NC組明顯升高(142.6±19.5vs86.1±9.3,P<0.05);IL-6+ruxolitinib(75 μmol/L)組中α-SMA表達(dá)較IL-6組顯著降低(34.1±31.0vs142.6±19.5,P<0.05,見圖3)。

圖3 免疫熒光染色檢測(cè)HSC中α-SMA蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of α-SMA protein in HSC by immunofluorescence

2.4 蘆可替尼對(duì)HSC細(xì)胞增殖的影響

用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性,結(jié)果顯示,IL-6組的細(xì)胞存活率顯著高于IL-6+ruxolitinib組,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,見圖4)。ruxolitinib對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生了明顯的抑制作用。

與IL-6組比較,*P<0.05圖4 CCK-8檢測(cè)蘆可替尼對(duì)HSC細(xì)胞增殖的影響Figure 4 Effect of ruxolitinib on the proliferation of HSC by CCK-8

2.5 蘆可替尼對(duì)HSC細(xì)胞侵襲性的影響

Transwell趨化性顯微照相顯示:IL-6組透膜的細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組明顯增多(438.1±93.7vs295.2±76.1,P<0.05),而IL-6+ruxolitinib組透膜的細(xì)胞數(shù)目與IL-6組相比較顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(167.6±41.8vs438.1±93.7,P<0.05,見圖5)。

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蘆可替尼對(duì)HSC細(xì)胞侵襲性的影響Figure 5 Effect of ruxolitinib on the invasiveness of HSC by Transwell analysis

3 討論

肝臟纖維化是在肝臟受到損傷刺激后的一種自我修復(fù)的代償性反應(yīng)過程,HSC被認(rèn)為是參與肝纖維化過程的關(guān)鍵細(xì)胞。有研究表明抑制HSC活化及增殖并促進(jìn)HSC的凋亡可以有效緩解肝纖維化進(jìn)程,因此是治療肝纖維化可能的有效靶點(diǎn)之一[5]。JAK2/STAT3通路被認(rèn)為是HSC活化的重要細(xì)胞通路之一[6,7],有效抑制該通路可明顯抑制HSC活化,我們先前的研究也證實(shí)這一點(diǎn),但目前臨床無針對(duì)抑制肝纖維過程的靶向藥物。蘆可替尼是新型選擇性抑制JAK1和JAK2口服藥物,是目前唯一獲批用于骨髓纖維化治療的靶向藥物,也在我國臨床應(yīng)用[4]。蘆可替尼針對(duì)JAK1和JAK2具有高度的選擇性抑制作用,同時(shí)對(duì)tyrosine kinase 2(TYK2)也具有溫和的抑制作用,但在肝臟相關(guān)疾病中研究甚少。Shaker等[8]和Hazem等[9]報(bào)道蘆可替尼預(yù)處理可明顯降低硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝臟毒性作用,其主要機(jī)制是抑制肝臟JAK/STAT通路緩解肝細(xì)胞死亡,降低肝臟氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。另外,蘆可替尼可通過抑制JAK1-STAT3通路抑制肝細(xì)胞內(nèi)急性時(shí)相蛋白(hepatic acute phase proteins,APP)表達(dá)降低肝細(xì)胞炎性反應(yīng)[10],因此蘆可替尼對(duì)HSC活化過程的抑制作用存在理論上的可能。

HSC在活化過程中發(fā)生表型改變,其早期即在組織炎癥壞死區(qū)域向肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast,MFB)轉(zhuǎn)型并持續(xù)激活,并成為肝臟ECM的主要來源細(xì)胞,α-SMA蛋白表達(dá)可作為HSC活化的重要標(biāo)志[11]。IL-6通過激活JAK2/STAT3通路活化HSC是經(jīng)典的HSC激活通路[12,13],IL-6活化HSC后加入蘆可替尼可明顯降低HSC中p-JAK1/2、p-STAT3蛋白表達(dá),表明蘆可替尼對(duì)HSC中JAK1/2-STAT3通路具有明顯抑制作用,免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明蘆可替尼明顯降低α-SMA蛋白陽性的HSC數(shù)量,提示蘆可替尼可以通過對(duì)JAK1/2-STAT3通路的抑制作用降低HSC活化進(jìn)程。Ⅰ型膠原蛋白(collagen type Ⅰ,COL1A1)是肝纖維化細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分,活化后的HSC成為Ⅰ型膠原蛋白的主要合成細(xì)胞,Western blot實(shí)驗(yàn)顯示蘆可替尼干預(yù)后HSC中COL1A1表達(dá)明顯下降,提示蘆可替尼干預(yù)后HSC合成細(xì)胞外基質(zhì)的合成能力下降,從而降低肝纖維化過程。

減少HSC侵襲性增加HSC凋亡程度同樣是抑制肝纖維化的重要環(huán)節(jié)[14],激活的JAK2/STAT3通路可通過調(diào)節(jié)下游靶基因具有抗細(xì)胞凋亡[15]和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用[16]。cyclin D1是重要的細(xì)胞周期活性蛋白,其可調(diào)控細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變[17]。caspase-3蛋白在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用,細(xì)胞發(fā)生凋亡后caspase-3蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)閏leaved caspase-3蛋白進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)變[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蘆可替尼干預(yù)后HSC中cyclin D1蛋白表達(dá)下降、cleaved caspase-3蛋白上調(diào)表明蘆可替尼抑制了HSC增殖能力并促進(jìn)HSC凋亡。CCK-8實(shí)驗(yàn)和Transwell趨化性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了蘆可替尼通過抑制JAK1/2-STAT3通路抑制HSC增殖和侵襲能力。

綜上所述,本研究證實(shí)蘆可替尼對(duì)HSC中JAK1/2-STAT3通路的活化具有強(qiáng)烈的抑制作用,并進(jìn)一步降低HSC活化、增殖及侵襲細(xì)胞生物行為,減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成,抑制肝臟纖維化過程。因此明確蘆可替尼對(duì)HSC具有靶向抑制作用,并可能成為臨床治療肝纖維化的有效靶向藥物。