姚 越,湯玉銳,張 沖,韓 兵,熊言駿,汪 盛

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科,蚌埠 233000;*通訊作者,E-mail:bydoctorw@163.com)

睪丸癌(testicular cancer)多發(fā)于18-39歲之間的青少年和年輕人,5年相對生存率為95%[1]。目前,腫瘤轉移是導致癌癥患者死亡的主要因素[2],占睪丸癌患者的90%以上[3],同時非轉移性癌癥患者應采用相同的化學療法治療轉移性腫瘤[4]。腫瘤侵襲和遷移的危害包括死亡,耐藥性[5,6]和術后復發(fā)。因此,尋找可以抑制腫瘤侵襲和遷移的藥物至關重要。

紫草素是一種活性蒽醌衍生物,得自紫草紫蘇根。臨床和藥理特性研究已證實,紫草素在多種炎性和傳染病中具有抗發(fā)炎、抗氧化、抗血栓形成和降血糖作用[7,8]。近來,紫草素作為抗腫瘤劑的研究引起了人們的注意,目前紫草素已用于治療各種癌癥,包括肺癌[9]、胰腺癌[10]和子宮內膜癌[11]。最近,一些文獻表明,紫草素可以抑制癌細胞的侵襲和轉移[12],基質金屬蛋白酶家族(MMPs)是細胞外基質降解必需的鋅離子依賴性的內源性蛋白酶,可以特異性降解基底膜成分[13]。MMPs中的明膠酶是唯一能夠降解基底膜和細胞外基質中的Ⅵ型膠原成分的酶,其中的MMP-2和MMP-9發(fā)揮著重要的作用,與腫瘤內血管生成、侵襲及轉移相關[14]。上皮型鈣黏附蛋白(E-cadherin)是重要的上皮細胞黏附分子,E-cadherin黏附功能的喪失與腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展、侵襲過程密切相關[15],目前尚未有紫草素對睪丸癌細胞I-10、TCAM-2的作用研究,本實驗主要探討紫草素對睪丸癌細胞I-10、TCAM-2侵襲和遷移的影響,同時探討其可能的作用機制,為臨床治療下睪丸癌提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人睪丸癌I-10、TCAM-2細胞購自上海細胞庫,DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自公司美國Hyclone公司,胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司,紫草素粉末(HPLC≥98%,Lot#:C10245876)購自上海麥克林生化科技有限公司,MTT試劑、Transwell小室及BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云天公司,MMP-2、MMP-2、E-cadherin、β-actin蛋白抗體購自美國CST公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人睪丸癌細胞I-10、TCAM-2培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)。

1.3 MTT測定細胞增殖

將I-10、TCAM-2細胞懸液(1×104/ml)分別接種到96孔板,調整每孔培養(yǎng)液為100 μl,培養(yǎng)24 h,I-10細胞中加入濃度分別為0,1.2,1.4,1.6 μmol/L的紫草素,TCAM-2細胞中加入紫草素濃度分別為0,0.5,1.0,1.5 μmol/L,分別于培養(yǎng)24,48,72 h時每孔加入15 μl MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,小心吸去培養(yǎng)液,每孔加入150 μl DMSO,繼續(xù)培養(yǎng)30 min待甲臜完全溶解,用酶聯(lián)免疫檢測儀測吸光度值(OD490nm)。計算細胞存活率:細胞存活率(%)=實驗組OD490nm/對照組OD490nm×100%。取平均值繪制藥物劑量效應曲線,計算藥物的半數抑制濃度(IC50)。

1.4 Transwell檢測細胞侵襲能力

將Materigel膠與預冷的無血清DMEM培養(yǎng)基按1 ∶8的比例稀釋,每孔加入60 μl Materigel膠均勻覆蓋Transwell小室底部,培養(yǎng)60 min使之呈半凝固態(tài)。分別取對數生長期的I-10、TCAM-2細胞,消化離心后,用無血清培養(yǎng)基重懸計數,I-10細胞組每個內室內加入100 μl紫草素藥物濃度分別為0,1.2,1.4,1.6 μmol/L的細胞懸液,TCAM-2細胞組每個內室內加入100 μl紫草素藥物濃度分別為0,0.5,1.0,1.5 μmol/L的細胞懸液,每孔均含1×105個細胞。于24孔板即外室中加入600 μl含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,每組均設3個復孔。于37 ℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)48 h;取出小室,PBS清洗2次,4%多聚甲醛固定15 min,用1%結晶紫染液室溫下染色10 min;PBS漂去多余染料,光鏡下每孔隨機取5個視野拍照,計數并求平均值,侵襲抑制率(%)=(1-實驗組細胞侵襲個數/空白對照組細胞侵襲個數)×100%。

1.5 Transwell遷移實驗

除無需鋪基質膠外,其余處理步驟同1.4中所述,所有實驗重復3次,遷移抑制率(%)=(1-實驗組細胞遷移個數/空白對照組細胞遷移個數)×100%。

1.6 Western blot法檢測蛋白表達水平

分別將對數期生長狀態(tài)良好的I-10、TCAM-2細胞以不同濃度(1.2,1.4,1.6 μmol/L)的紫草素處理48 h,收集細胞,冰上裂解30 min,12 000 r/min離心30 min,取上清液;每組取60 μg蛋白進行SDS-PAGE分離,轉至聚偏氟乙烯膜;快速封閉液封閉15 min,PBST溶液洗膜3次,5 min/次;4 ℃一抗過夜,TPBS溶液洗膜3次,兔抗(使用TPBS 1 ∶5 000稀釋)室溫下孵育2 h,TPBS溶液洗膜3次,5 min/次,ECL試劑盒暗室發(fā)光顯影,凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.7 統(tǒng)計學分析

實驗數據采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,實驗數據均以均數±標準差表示,多組比較采用單因素方差分析及兩因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紫草素對I-10、TCAM-2細胞的增殖抑制作用

MTT結果顯示,當紫草素濃度逐漸增加時,I-10和TCAM-2細胞的存活率逐漸降低(見圖1);且隨時間(24,48,72 h)的變化,I-10、TCAM-2細胞存活率也逐漸降低(P<0.05)。I-10細胞24,48,72 h的IC50分別為1.939,1.379,0.824 μmol/L,TCAM-2細胞24,48,72 h的IC50分別為1.874,1.031,0.724 μmol/L,表明紫草素對I-10、TCAM-2細胞的作用具有濃度依賴性和時間依賴性,與對照組比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖1)。

與0 μmol/L比較,*P<0.05圖1 不同濃度紫草素對I-10、TCAM-2細胞增殖的抑制作用Figure 1 Inhibition effect of shikonin on proliferation of I-10 and TCAM-2 cells

2.2 紫草素對I-10、TCAM-2細胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell侵襲和遷移實驗結果顯示,與對照組相比,1.2,1.4,1.6 μmol/L紫草素作用于I-10細胞侵襲抑制率分別為(26.2±2.2)%,(50.1±4.0)%和(74.2±2.6)%,遷移抑制率分別為(60.3±3.4)%,(82.3±2.3)%和(89.8±3.4)%(見圖2)。0.5,1.0,1.5 μmol/L紫草素作用于TCAM-2細胞侵襲抑制率分別為(17.3±2.1)%,(48.1±2.9)%和(69.2±3.3)%,遷移抑制率分別為(67.6±3.3)%,(83.3±2.7)%和(92.8±1.2)%,與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖2)。表明紫草素可以抑制I-10、TCAM-2細胞侵襲和遷移活性。

與0 μmol/L比較,*P<0.05圖2 紫草素對I-10、TCAM-2細胞遷移和侵襲能力的影響Figure 2 Effect of shikonin on migration and invasion of I-10 and TCAM-2 cells

2.3 紫草素對I-10、TCAM-2細胞MMP-2、MMP-9及E-cadherin表達影響

檢測結果表明,紫草素可隨劑量依賴性的同時下調I-10、TCAM-2細胞中與侵襲遷移相關的MMP-2、MMP-9及E-cadherin蛋白的表達(P<0.05,見圖3)。

與0 μmol/L比較,*P<0.05圖3 紫草素對I-10、TCAM-2細胞MMP-2、MMP-9及E-cadherin表達的影響Figure 3 Effect of shikonin on the expression of MMP-2, MMP-9 and E-cadherin in I-10 and TCAM-2 cells

3 討論

腫瘤細胞的黏附、遷移、侵襲能力是在腫瘤細胞的轉移中起重要作用的3個關鍵因素。越來越多的證據表明,細胞侵襲對癌癥的進展至關重要,涉及腫瘤細胞向鄰近組織的遷移和侵襲以及細胞外基質蛋白的溶解[16]。

紫草素主要通過抑制細胞增殖發(fā)揮抗腫瘤活性用于治療各種癌癥,同時紫草素對TPC-1細胞系的甲狀腺乳頭狀癌細胞(PTC)和胃癌(GC)細胞遷移水平有影響,且沒有明顯的肝毒性[17]。本實驗結果表明,紫草素可抑制睪丸癌細胞I-10、TCAM-2的增殖及侵襲遷移。為了探究紫草素抑制I-10、TCAM-2細胞侵襲遷移的機制,本研究使用Western blot法檢測紫草素作用I-10、TCAM-2細胞后檢測與腫瘤侵襲遷移相關蛋白如MMP-2、MMP-9、E-cadherin的相對表達水平,基質金屬蛋白酶家族(MMPs)已被用作體內流體轉移的診斷標志物,MMP-2和MMP-9被認為是兩個重要的促成因素,與腫瘤的生長和腫瘤的轉移有關,在臨床和動物實驗觀察到腫瘤細胞MMP-2和MMP-9的高表達水平[18,19]。E-cadherin蛋白是評估腫瘤細胞遷移能力的重要分子標志物,是轉移抑制分子,其水平增高將降低癌細胞的遷移能力[20],結果表明紫草素能夠同時下調I-10和TCAM-2細胞MMP-2、MMP-9和上調E-cadherin的表達抑制其侵襲遷移。

綜上所述,本研究證明了紫草素能夠抑制睪丸癌細胞I-10、TCAM-2增殖和侵襲遷移,抑制侵襲遷移的機制可能為下調侵襲遷移相關蛋白MMP-2、MMP-9和上調E-cadherin的表達,有望成為治療睪丸癌的有效策略。