魏 星,冀 靜,趙永林

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710004;2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科;3西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科;*通訊作者,E-mail:zhaoyonglinlin@163.com)

宮頸癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率均居女性腫瘤第二位,嚴(yán)重危害著女性的健康[1]。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是多因素綜合作用的結(jié)果,盡管目前宮頸癌的預(yù)防和治療取得了很大進(jìn)展,例如HPV疫苗、新的宮頸癌篩查技術(shù)等可預(yù)防并早期篩查出宮頸癌,但是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。

前期研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織內(nèi)高表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ,且其可能與宮頸癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程有關(guān)[2]。進(jìn)一步蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)TIPE3即TNFAIP8L3(tumor necrosis factor α-induced protein 8 like 3)是神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ的下游分子。TIPE3是新近研究發(fā)現(xiàn)的促腫瘤分子,可通過捕獲磷脂酰肌醇4,5-二磷酸和磷酸肌醇3,4,5-三磷酸使磷脂酰肌醇3-激酶/AKT通路激活,影響腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。TIPE3在乳腺癌、肝細(xì)胞肝癌、食管癌和非小細(xì)胞肺癌等腫瘤組織中的表達(dá)高于癌旁組織[4-6],但目前尚未見到TIPE3在宮頸癌中表達(dá)情況的報道,僅有研究發(fā)現(xiàn)TIPE3在HeLa細(xì)胞系中的表達(dá)量相對較低[7],探索TIPE3在宮頸癌中的表達(dá)及其意義有助于揭示宮頸癌發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制。

宮頸癌侵襲、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因,EMT使宮頸癌細(xì)胞獲得較高的遷移、侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力,是宮頸癌獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程[8]。本研究擬探討宮頸癌組織中TIPE3的表達(dá),并探討其與EMT關(guān)鍵蛋白的相關(guān)性,為揭示宮頸癌的病理生理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

本研究所用宮頸癌組織標(biāo)本均來自2012-01～2013-06西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科初診宮頸鱗癌的患者,共30例,臨床分期Ⅰ-Ⅱ期,術(shù)前經(jīng)活檢確診,均未接受放化療。對照組為同時期30例因子宮良性病變行全子宮切除術(shù)患者的正常宮頸,術(shù)后病理均證實(shí)無宮頸病變[2]。

1.2 主要試劑

TIPE3抗體購自美國Abcam公司,E-cadherin及Vimentin單克隆抗體均購自美國proteintech公司,SP檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測TIPE3、E-cadherin、Vimentin的表達(dá)

所有標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定后常規(guī)包埋、切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化,高壓法抗原修復(fù),37 ℃山羊血清封閉,TIPE3抗體(1 ∶100)、E-cadherin抗體(1 ∶100),Vimentin抗體(1 ∶200)4 ℃孵育過夜;PBS洗脫一抗,二抗37 ℃孵育1 h,辣根過氧化物酶孵育30 min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

每張切片隨機(jī)選取3個有代表性的高倍視野,免疫組化評分采用染色強(qiáng)度評分、陽性細(xì)胞數(shù)百分比評分綜合評價,二者評分乘積為最終結(jié)果。①染色強(qiáng)度評分:無染色0分,輕度黃染1分,中度黃染2分,重度黃染3分;②陽性細(xì)胞數(shù)百分比=(陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞數(shù)/所有腫瘤細(xì)胞數(shù))×100%;評分:<10%為0分,10%-24%為1分,25%-49%為2分,50%-74%為3分,75%-100%為4分。評分0-4分為低表達(dá),6-12分為高表達(dá),高表達(dá)判定為表達(dá)陽性,低表達(dá)判定為表達(dá)陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有資料均由SPSS18.0軟件分析處理,計(jì)數(shù)資料采用Pearson卡方檢驗(yàn),計(jì)量資料采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Spearman列聯(lián)系數(shù)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TIPE3、E-cadherin及Vimentin在宮頸鱗癌及正常宮頸組織中的表達(dá)

宮頸鱗癌中的TIPE3蛋白主要表達(dá)在癌細(xì)胞的細(xì)胞漿,正常宮頸組織中TIPE3蛋白僅分布于基底膜細(xì)胞的細(xì)胞漿(見圖1)。TIPE3在宮頸鱗癌組織中的陽性表達(dá)率(70.0%,21/30)顯著高于正常宮頸組織(16.7%,5/30),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001,見表1)。

E-cadherin在宮頸癌組織中主要分布于部分癌細(xì)胞,而在正常宮頸組織中主要分布在基底膜細(xì)胞的細(xì)胞膜(見圖1)。宮頸鱗癌組織中E-cadherin的陽性表達(dá)率(30.0%,9/30)顯著低于正常宮頸組織(66.7%,20/30),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004,見表1)。Vimentin蛋白主要分布在宮頸癌及正常宮頸組織的間質(zhì)組織(見圖1),其在宮頸鱗癌組織中的陽性表達(dá)率(70.0%,21/30)顯著高于正常宮頸組織(40.0%,12/30),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.020,見表1),結(jié)果提示宮頸癌中存在EMT過程。

圖1 宮頸鱗癌及正常宮頸組織中TIPE3、E-cadherin及Vimentin的表達(dá)Figure 1 Expression of TIPE3, E-cadherin and Vimentin in cervical squamous carcinoma tissue and normal cervical tissue

表1 TIPE3、E-cadherin及Vimentin在宮頸鱗癌及正常宮頸組織中的表達(dá)(例)

Table 1 Expression of TIPE3, E-cadherin and Vimentin in cervical squamous carcinoma tissue and normal cervical tissue(cases)

組別nTIPE3E-cadherinVimentin低表達(dá)高表達(dá)P低表達(dá)高表達(dá)P低表達(dá)高表達(dá)P宮頸鱗癌309210.0012190.0049210.020正常宮頸3025510201812

2.2 宮頸組織中TIPE3與EMT表達(dá)的相關(guān)性分析

宮頸組織中,TIPE3和E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),Spearman列聯(lián)系數(shù)為-0.265(P=0.023);TIPE3和Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān),Spearman列聯(lián)系數(shù)為0.354(P=0.003);而E-cadherin和Vimentin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),Spearman列聯(lián)系數(shù)為-0.457(P=0.000,見表2)。結(jié)果提示,宮頸癌組織中異常高表達(dá)的TIPE3可能參與了腫瘤的EMT過程。

表2 TIPE3與E-cadherin、Vimentin表達(dá)的相關(guān)性分析

Table2 Correlation analysis between E-cadherin, Vimentin and TIPE3

組別TIPE3E-cadherinVimentinrPrPrPTIPE3---0.2650.0230.3540.003E-cadherin-0.2650.023---0.4570.000Vimentin0.3540.003-0.4570.000--

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤,具體發(fā)病機(jī)制仍不明確,既往研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌的不良預(yù)后與癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。EMT與宮頸癌的關(guān)系是近年研究的熱點(diǎn),對EMT進(jìn)行干擾或阻斷,成為抗腫瘤治療新的有效靶點(diǎn),能極大改善宮頸癌患者預(yù)后、延長患者生存期,但目前其機(jī)制尚未確切。

TIPE3是磷脂酰肌醇第二信使的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[9]。本研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中,TIPE3主要表達(dá)在宮頸鱗癌的細(xì)胞漿內(nèi),且TIPE3在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)顯著高于正常宮頸組織,提示TIPE3在宮頸癌中表達(dá)上調(diào),其可能參與了宮頸癌的發(fā)生和進(jìn)展。與本研究結(jié)果相似,既往研究也發(fā)現(xiàn)TIPE3在乳腺癌、肝細(xì)胞肝癌、食管癌和非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤組織中的表達(dá)高于癌旁組織,并且在人NCI-H727肺癌細(xì)胞、T24膀胱癌細(xì)胞以及HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)也升高,而下調(diào)TIPE3的表達(dá),能減少腫瘤細(xì)胞數(shù)量;提示TIPE3在體外能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[10]。既往研究發(fā)現(xiàn)TIPE3在HeLa細(xì)胞系中表達(dá)量相對較低[7],與既往研究結(jié)果不同,本研究發(fā)現(xiàn)TIPE3在宮頸癌中表達(dá)較高,其原因可能在于宮頸癌病理類型常見的有鱗癌、腺癌和腺鱗癌三種類型,本研究的宮頸癌標(biāo)本為鱗癌,而HeLa細(xì)胞系被證實(shí)來源于腺癌,故表達(dá)有差異,且關(guān)于TIPE3在宮頸癌中表達(dá)的研究較少,其表達(dá)情況仍需進(jìn)一步研究。

E-cadherin是構(gòu)成上皮細(xì)胞間黏附的重要成分,可使癌細(xì)胞從原發(fā)病灶中脫離,向周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或侵入血管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Vimentin是一種中間絲蛋白,主要表達(dá)于正?；蚰[瘤性間葉組織細(xì)胞中。Vimentin異常表達(dá)增多使細(xì)胞骨架蛋白構(gòu)成改變,易于遷移游動。E-cadherin表達(dá)的降低、Vimentin表達(dá)的異常升高被認(rèn)為是EMT程序啟動的主要分子標(biāo)識。本研究發(fā)現(xiàn),宮頸癌中上皮黏附蛋白標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)下降,而間質(zhì)標(biāo)記物分子Vimentin表達(dá)上調(diào),提示宮頸癌中存在EMT,與既往結(jié)果一致。進(jìn)一步結(jié)果表明:E-cadherin與Vimentin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān);TIPE3與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),與Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān),提示在宮頸癌中,高水平的TIPE3與宮頸癌細(xì)胞的EMT相關(guān),其可能通過EMT降低細(xì)胞的黏附作用,促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。TIPE3可使磷脂酰肌醇3-激酶/AKT通路激活,進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)肺癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞以及結(jié)腸癌細(xì)胞中TIPE3的表達(dá),可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少;但過表達(dá)TIPE3可加快細(xì)胞周期,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。TIPE3缺失能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,其表達(dá)量在高侵襲性乳腺癌細(xì)胞系中更高。此外,TIPE3可調(diào)節(jié)AKT和NF-κB通路,并能提高M(jìn)MP-2和u PA的表達(dá)水平,進(jìn)而激活A(yù)KT和NF-κB通路,而AKT和NF-κB通路的激活可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞EMT的發(fā)生[11,12]。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)TIPE3在宮頸癌中的表達(dá)上調(diào),且與EMT相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),與Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān),提示宮頸癌中異常高表達(dá)的TIPE3可能參與了宮頸癌細(xì)胞的EMT,促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。