李 淵,高曉霞,王 慧,王 鵬,賈金萍,秦雪梅*

(1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006;2山西大學(xué)大型儀器中心;*通訊作者,E-mail:qinxm@sxu.edu.cn)

抑郁癥(depression)[1-3]是以顯著且持久的情緒低落為主要臨床特征,呈無趣、無欲、無助、無望、無快感的狀態(tài),嚴(yán)重者甚至自殺,是目前最常見的精神障礙之一,也是致殘的主要原因之一,嚴(yán)重影響患者的生活、工作和學(xué)習(xí)。

前期本課題組經(jīng)過對逍遙散的最佳抗抑郁組分的藥效學(xué)篩選和抗抑郁物質(zhì)基礎(chǔ)的研究后,在“逍遙散”組方的基礎(chǔ)上裁去生姜和茯苓而得到復(fù)方柴歸方,并對其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化[4-8]。復(fù)方柴歸方主要針對抑郁癥患者而研發(fā),由柴胡、當(dāng)歸、甘草、白術(shù)、白芍、薄荷6味藥組成。目前已獲得國家藥品監(jiān)督管理局(SFDA)頒發(fā)的臨床試驗(yàn)批件。

Wilsonth等[9]在1954年建立了外翻腸囊法。最初用于研究葡萄糖和氨基酸在腸道中的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)。它是體外最常用的腸道吸收生物學(xué)模型,具有操作簡單、膠囊內(nèi)液體少、藥物積累快、藥物用量少的特點(diǎn)[10]。所以選擇了外翻腸囊法考察復(fù)方柴歸方提取物在大鼠空腸和回腸的吸收特點(diǎn)。

本文在前期對柴歸方化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上[8],對柴歸方的在體腸吸收進(jìn)行研究,并比較其在正常大鼠與抑郁癥大鼠(CUMS)體內(nèi)腸吸收成分種類與吸收程度的差異,篩選具有顯著吸收差異的化學(xué)成分,試圖闡明柴歸顆粒的吸收特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高速冷凍離心機(jī),Thermo fisher U3000超高效液相色譜儀,Thermo Scientific Q Extractive質(zhì)譜儀(Thermo Scientific,Germany); Neofuge 13R高速冷凍離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司);甲酸、乙腈購買于賽默飛世爾科技(中國)有限公司;其余試劑均為分析純;復(fù)方柴歸顆粒(為本實(shí)驗(yàn)室用乙醇提取合并藥渣水提醇沉部分制備)。

1.2 檢測條件

色譜條件:色譜柱為Waters HSS C18柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);檢測波長254 nm;進(jìn)樣量2 μl;流動相:A為0.1%甲酸-水,B為乙腈流速0.3 ml/min,柱溫40 ℃,梯度洗脫:0-5 min,5%-10% B;5-12 min,10%-10% B;12-16 min,10%-20%B;16-25 min,20%-35% B;25-30 min,35%-40%B:30-40 min,40%-50% B;40-48 min,50%-85%B;48-50 min,85%-100%B[8]。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(EIS),掃描方式:ESI(+),ESI(-)以及全掃描模式;噴霧電壓正極:3.5 kV,負(fù)極:3.0 kV;毛細(xì)管溫度320 ℃;加熱器溫度300 ℃;鞘氣流速:35 arb,輔助氣流10 arb;掃描模式為Full Scan/dd-MS2,采集范圍為m/z100-1 500,正負(fù)離子切換采集模式。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性SD大鼠,SPF級,體質(zhì)量為(400±50)g,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司,動物許可證號SCXK(京)2014-0001,動物置于自然節(jié)律光照環(huán)境下,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,室溫22-24 ℃,相對濕度35%-55%。

1.4 柴歸顆粒腸內(nèi)溶液樣品的制備

1.4.1 Tyrode緩沖液的配置 精密稱取NaCl 8.0 g,KCl 0.28 g,MgCl20.1 g,NaHCO31.0 g,NaH2PO40.05 g溶于500 ml蒸餾水中,密閉冷藏;另稱取0.2 g CaCl2溶于500 ml蒸餾水中密閉冷藏;使用前將2種溶液混合后加入無水葡萄糖1.0 g,并用玻璃棒攪拌均勻,即得Tyrode緩沖液。

1.4.2 復(fù)方柴歸方藥液的制備 準(zhǔn)確稱取復(fù)方柴歸方123.5 g,加500 ml Tyrode緩沖液超聲完全溶解,制成濃度為0.247 g/ml的含藥Tyrode試液。

1.4.3 復(fù)方柴歸方腸吸收液的制備 正常大鼠和CUMs模型大鼠,每組3只,自由飲水,實(shí)驗(yàn)前禁食12 h,用10%的水合氯醛酸腹腔注射麻醉,其劑量為0.3 ml/100 g,待大鼠麻醉后固定,沿大鼠的腹中線和腹白線剪開肌肉,打開腹腔,迅速取出小腸,從幽門胃下面25 cm開始向下量取10 cm為空腸段;從回盲瓣以上5 cm開始向上取10 cm為回腸段。取出空腸與回腸段的腸管放入0 ℃臺式液中沖洗干凈,小心剝離腸管表面的腸系膜。將腸管一端套牢在自制的塑料套管上,并用細(xì)線扎牢固,小心將腸管翻轉(zhuǎn)。用0 ℃臺式液將內(nèi)表面沖洗干凈。把腸段的一端用絲線結(jié)扎,注入2 ml空白臺式液后結(jié)扎另一端。將其置于恒溫37 ℃并已供氣(95% O2+5% CO2)的浴管中。平衡5 min后將Tyrode替換為適量的柴歸顆粒供試藥液。120 min后取樣,保存于-80 ℃,待用。

1.4.4 腸內(nèi)溶液分析樣品的制備 取1 ml樣品用氮?dú)獯蹈?向其中加入500 μl的色譜甲醇,混勻溶解。13 000 r/min離心5 min,取上清液,進(jìn)樣分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析和畫圖采用Xcalibur3.2,SPSS v16.0,GraphPad Prism8,SIMCA13.0,和Compound Discover軟件。

2 結(jié)果

2.1 柴歸顆粒中有機(jī)酸類和皂苷類的吸收特征

經(jīng)過Xcalibur軟件對腸灌流液的色譜圖進(jìn)行分析,圖1是柴歸顆粒腸內(nèi)溶液在正負(fù)離子模式下的總離子提取離子流圖(TICs)。前期對柴歸顆粒的化學(xué)成分研究,共鑒定出95個化合物,包括皂苷類,萜類,黃酮類,內(nèi)酯類,苯肽類和酚酸類等。在腸內(nèi)溶液中共指認(rèn)出70個共同的腸吸收化合物(見表1),25個未檢測到。說明柴歸顆粒中小分子化學(xué)成分多數(shù)能夠經(jīng)腸道被吸收。

2.2 柴歸顆粒在正常組和CUMs模型組大鼠腸段中的吸收情況

根據(jù)前期對柴歸顆粒中化合物指認(rèn)結(jié)果,分析發(fā)現(xiàn)柴歸顆粒在空腸和回腸、CUMs模型組與正常組中對化學(xué)成分的吸收種類相似。比較其在正常組和模型組中吸收程度,結(jié)果見表2。

經(jīng)比較吸收成分在正常組與CUMs模型組大鼠的吸收峰面積,結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種機(jī)體狀態(tài)下不同腸道吸收程度基本一致。但在空腸中,CUMs模型組較正常組E-丁烯基苯酞、洋川穹內(nèi)酯H、芒柄花苷、阿魏酸、對羥基苯甲酸、5-羥甲基糠醛、Z-丁烯基苯酞和丁烯基苯酞吸收顯著減少。而在回腸段,CUMs模型組與正常組的差異成分種類增多,差異倍數(shù)增加。芒柄花苷、檸檬酸、甘草查爾酮B、甘草皂苷G2、Macedonoside E、甘草皂苷A3、甘草皂苷E2、22-羥基甘草酸、22-β-乙?；?甘草素、香葉木苷、橙皮苷、苯甲酰芍藥苷、百里香新、蒙花苷、異甘草甘、正丁基苯酞、呋喃倍半萜類、甘草酸、沒食子?；炙庈?、柴胡皂苷c、E-藁本內(nèi)酯、烏拉爾甘草皂苷B、甘草皂苷B2、綠原酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Teradecylcitric acid、綠原酸同分異構(gòu)體、異甘草素、倍半萜類和芍藥新苷吸收CUMs模型組較正常組顯著增加，芹糖甘草苷顯著減少。

圖1 柴歸顆粒腸內(nèi)溶液典型的色譜圖(TICs)Figure 1 Typical chromatograms of Chaigui granules enteric solution

表1 柴歸顆粒在回腸和空腸中的化學(xué)成分吸收

Table 1 Absorption of Chaigui granules in ileum and jejunum

No.保留時(shí)間(min)Mr化合物 來源 No.保留時(shí)間(min)Mr化合物 來源 11.30192.0264檸檬酸有機(jī)酸類2721.52418.1258異甘草甘黃酮類22.00170.0209沒食子酸鞣質(zhì)類2822.28286.0835甘草查爾酮B黃酮類33.47168.0417香草酸同分異構(gòu)體有機(jī)酸類2923.12592.1786蒙花苷黃酮類44.11126.03115-羥甲基糠醛萜類3024.42188.0831E-丁烯基苯酞苯酞類55.49138.0311原兒茶醛有機(jī)酸類3125.06388.2455十四烷基檸檬酸有機(jī)酸類66.00544.1245芍藥苷亞硫酸酯萜類3225.42584.1888苯甲酰芍藥苷萜類77.10354.0945綠原酸有機(jī)酸類3325.49330.0734百里香新黃酮類87.20496.1575氧化芍藥苷萜類3426.24984.4564甘草皂苷A3皂苷類97.33168.0417香草酸有機(jī)酸類3526.36300.0628香葉木素黃酮類107.73354.0945綠原酸同分異構(gòu)體有機(jī)酸類3626.96880.408722-β-乙酰基-甘草素黃酮類1111.47480.1626白芍苷萜類3727.26838.3981甘草皂苷G2皂苷類1211.50480.1626芍藥內(nèi)酯苷萜類3827.44188.0831Z-丁烯基苯酞苯酞類1312.32164.0467反式桂皮酸有機(jī)酸類3927.82256.0730異甘草素黃酮類1413.84480.1626芍藥苷萜類4028.50926.5233柴胡皂苷c皂苷類1516.02194.0573阿魏酸有機(jī)酸類4128.74820.3875甘草皂苷E2皂苷類1616.71138.0311對羥基苯甲酸酚酸類4229.25838.3981MacedonosideE皂苷類1717.66418.1258甘草甘黃酮類4330.55838.398122-羥基甘草酸皂苷類1817.67256.0730甘草素黃酮類4430.85822.4032甘草酸皂苷類1917.89550.1680芹糖甘草苷黃酮類4532.41808.4239甘草皂苷B2皂苷類2018.50632.1735沒食子?；炙庈蛰祁?632.71780.4654柴胡皂苷a皂苷類2120.11610.1892橙皮苷黃酮類4732.74822.4032烏拉爾甘草皂苷B皂苷類2220.15608.1735香葉木苷黃酮類4832.98354.1461甘草苯并呋喃黃酮類2320.18224.1043洋川穹內(nèi)酯H內(nèi)酯類4933.12780.4654柴胡皂苷g皂苷類2420.87462.1520芍藥新苷萜類5033.23192.1144洋川穹內(nèi)酯A內(nèi)酯類2521.14550.1680芹糖甘草苷或異構(gòu)體黃酮類5133.67248.1406白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ內(nèi)酯類2621.49430.1258芒柄花苷黃酮類5234.33822.47602″-O-乙?；窈碥誥皂苷類

續(xù)表1 柴歸顆粒在回腸和空腸中的化學(xué)成分吸收

Table 1 Absorption of Chaigui granules in ileum and jejunum

No.保留時(shí)間(min)Mr化合物 來源 No.保留時(shí)間(min)Mr化合物 來源5334.43368.1254甘草香豆素香豆素類6237.67822.47603″-O-乙?；窈碥誨皂苷類5434.50822.47603″-O-乙酰化柴胡皂苷a皂苷類6337.78190.0988正丁基苯酞苯酞類5534.74822.47604″-O-乙?；窈碥誥皂苷類6437.97338.1512甘草查爾酮A黃酮類5634.84780.4654柴胡皂苷b1皂苷類6538.57780.4654柴胡皂苷d皂苷類5734.97822.47606″-O-乙酰化柴胡皂苷a皂苷類6640.15232.1457白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ內(nèi)酯類5836.07190.0988E-藁本內(nèi)酯內(nèi)酯類6740.62230.1301呋喃倍半萜類萜類5936.99354.1079異黃酮甘草醇黃酮類6844.37230.1301白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ內(nèi)酯類6037.21218.1665倍半萜類萜類6944.82188.0831丁烯基苯酞苯酞類6137.23822.47602″-O-乙?；窈碥誨皂苷類7046.71190.0988Z-藁本內(nèi)酯內(nèi)酯類

No.化合物 空腸(×106)正常組CUMs模型組回腸(×106)正常組CUMs模型組1檸檬酸 3730.000±298.600 4160.000±473.000 3620.000±577.300 6040.000±267.400???2沒食子酸 6740.000±346.300 6020.000±550.000 6540.000±862.800 7590.000±439.6003香草酸同分異構(gòu)體 550.000±2.768 535.000±75.600 482.000±63.630 574.000±59.50045-羥甲基糠醛 7420.000±80.620 6500.000±312.900? 6600.000±70.760 6970.000±610.5005原兒茶醛 977.000±105.400 882.000±79.300 922.000±65.100 928.000±26.8306芍藥苷亞硫酸酯 17.579±0.810 15.981±1.382 13.814±1.781 15.637±1.6937綠原酸 881.000±14.440 866.000±129.300 757.000±93.720 990.000±109.200?8氧化芍藥苷 286.000±4.221 299.000±50.760 246.000±29.640 308.000±34.2709香草酸 1820.000±67.780 1810.000±327.400 1630.000±209.00 2030.000±379.50010綠原酸同分異構(gòu)體 390.000±6.972 392.000±65.530 335.000±43.960 446.000±59.220?11白芍苷 115.000±2.020 121.000±19.890 98.595±6.328 117.000±13.02012芍藥內(nèi)酯苷 8710.000±56.150 8600.000±1112.000 7700.000±629.200 8950.000±864.60013反式桂皮酸 166.000±17.660 165.000±25.760 167.000±12.680 180.000±30.59014芍藥苷28600.000±1306.00026300.000±3901.00024200.000±725.60028700.000±3971.00015阿魏酸 495.000±45.770 391.000±0.866?? 232.000±22.410 286.000±42.57016對羥基苯甲酸 2350.000±29.140 2060.000±102.100?? 2190.000±68.580 2150.000±160.90017甘草甘 3560.000±20.510 3210.000±388.600 3000.000±248.300 3790.000±221.700??18甘草素 67.966±0.978 64.888±9.629 59.037±1.309 67.013±5.60719芹糖甘草苷或異構(gòu)體 93.589±2.061 95.028±27.090 138.000±29.160 134.000±22.400?20沒食子?；炙庈?1500.000±28.690 1600.000±320.800 1310.000±203.400 1880.000±235.100?21橙皮苷 45.859±0.528 42.224±7.423 36.078±3.526 50.091±4.684??22香葉木苷 226.000±8.768 233.000±48.580 162.000±25.580 274.000±49.710??23洋川穹內(nèi)酯H 242.000±17.010 195.000±10.580?? 232.000±6.797 224.000±3.91324芍藥新苷 2490.000±122.100 2430.000±336.400 2170.000±197.300 2590.000±174.000?25芹糖甘草苷或異構(gòu)體 2720.000±26.620 2650.000±433.200 2310.000±278.300 2950.000±267.200

No.化合物 空腸(×106)正常組CUMs模型組回腸(×106)正常組CUMs模型組26芒柄花苷 254.000±1.693 208.000±15.670?? 189.000±17.480 293.000±13.580???27異甘草甘 167.000±13.460 159.000±42.650 145.000±34.940 245.000±36.990??28甘草查爾酮B 250.000±35.130 286.000±85.470 10.395±3.131 452.000±140.200???29蒙花苷1340.000±89.2501400.000±308.001030.000±164.8001650.000±223.800??30E-丁烯基苯酞1050.000±16.320 892.000±1.054??? 949.000±6.749 989.000±54.99031Teradecylcitricacid 148.000±4.060 156.000±45.290 122.000±15.920 196.000±40.090?32苯甲酰芍藥苷 936.000±56.540 889.000±143.700 795.000±53.9701060.000±85.120??33百里香新 12.510±0.607 13.803±3.290 11.783±1.365 20.877±5.039??34甘草皂苷A3 148.000±7.260 165.000±37.120 111.000±20.150 238.000±45.970??35香葉木素 2.959±0.047 5.159±2.920 3.386±0.812 6.780±2.9943622-β-乙?；?甘草素 70.647±0.640 79.091±20.300 52.237±7.793 114.000±25.150??37甘草皂苷G2 342.000±2.030 329.000±41.210 266.000±31.010 554.000±104.800???38Z-丁烯基苯酞1470.000±201.6001150.000±22.370?1400.000±202.91210.000±92.47039異甘草素 53.657±3.697 178.000±40.400 8.729±7.158 187.000±159.400?40柴胡皂苷c 55.387±2.210 67.973±20.870 42.313±5.720 74.098±13.270?41甘草皂苷E2 35.708±0.437 40.111±10.240 24.782±6.558 60.000±12.170??42MacedonosideE 242.000±4.255 286.000±66.210 182.000±19.630 398.000±78.990??4322-羥基甘草酸 83.763±3.094 103.000±24.880 70.889±11.600 153.000±34.010??44甘草酸1060.000±41.1601500.000±476.800 904.000±58.9001980.000±689.400?45甘草皂苷B2 17.000±1.030 26.206±10.310 14.205±1.567 33.441±11.570?46柴胡皂苷a 69.338±9.114 109.000±57.790 49.617±0.004 90.800±23.57047烏拉爾甘草皂苷B 191.000±12.580 305.000±113.700 158.000±14.400 371.000±130.200?48甘草苯并呋喃 2.697±0.543 11.555±10.790 1.718±0.925 5.706±3.93849柴胡皂苷g 47.394±10.850 97.505±64.320 35.030±0.201 84.623±32.29050洋川穹內(nèi)酯A 727.000±6.389 709.000±7.576 732.000±90.370 717.000±14.83051白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 434.000±9.676 402.000±44.820 455.000±0.300 528.000±86.910522″-O-乙?；窈碥誥 9.556±0.803 14.774±8.089 6.650±0.592 14.143±4.91453甘草香豆素 3.505±1.340 18.509±17.820 1.637±0.312 7.992±4.405543″-O-乙?；窈碥誥 6.653±0.091 12.394±8.034 4.815±0.044 9.637±3.582554″-O-乙?；窈碥誥 14.448±3.979 30.050±18.210 11.442±0.822 26.935±7.72256柴胡皂苷b1 7.464±2.755 23.181±20.050 4.245±1.291 12.335±6.410576″-O-乙酰化柴胡皂苷a 17.383±5.331 40.614±28.890 12.319±0.149 28.816±12.59058E-藁本內(nèi)酯 635.000±14.920 723.000±58.520 622.000±152.7001080.000±332.900?59異黃酮甘草醇 7.371±3.133 44.760±43.040 5.093±1.645 16.326±9.82260倍半萜類 303.000±20.890 367.000±56.900 285.000±29.080 711.000±413.000?612″-O-乙?；窈碥誨 11.936±2.047 26.037±17.560 8.522±0.109 19.760±6.845623″-O-乙?；窈碥誨 14.832±5.851 44.661±37.450 8.606±0.856 23.985±11.59063正丁基苯酞3180.000±30.9004820.000±1114.003360.000±919.3006860.000±2250.000?64甘草查爾酮A 6.911±2.290 38.072±37.070 3.270±1.296 12.100±7.02665柴胡皂苷d 2.970±0.592 7.633±6.938 1.460±0.685 2.668±1.44266白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ 410.000±4.046 537.000±160.800 431.000±17.450 726.000±189.400?67呋喃倍半萜類 390.000±3.585 821.000±358.400 450.000±95.4501070.000±310.700?68白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ 71.876±3.002 162.000±96.390 89.289±4.423 176.000±55.03069丁烯基苯酞 6.982±0.448 20.927±13.210? 9.518±0.452 19.203±4.53870Z-藁本內(nèi)酯 31.793±8.282 137.000±113.300 33.423±3.926 62.886±34.240

與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3 討論

柴歸顆粒中小分子化學(xué)成分多數(shù)能夠經(jīng)腸道被吸收。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)與空白組相比,在空腸中來源于當(dāng)歸,甘草和白術(shù)的8個化合物在空腸中吸收顯著減少。在回腸中,模型組與對照組的差異成分種類增多,差異倍數(shù)增加,來源于甘草的15個,當(dāng)歸薄荷和白術(shù)的4個,白芍的3個和柴胡的1個化合物吸收顯著增加。其中甘草查而酮B增加近21倍,異甘草素增加近43倍。

據(jù)報(bào)道甘草查而酮B和異甘草素是有效的抗抑郁活性物質(zhì)。甘草查而酮B和異甘草素屬于甘草黃酮類,甘草黃酮通過抗脂質(zhì)過氧化作用,減少丙二醛生成起到抗抑郁作用[11],其含量的增加也可能與抗抑郁有關(guān)。

腸上皮細(xì)胞膜上分布著許多的轉(zhuǎn)運(yùn)體,造成正常組與模型組吸收差異的原因可能是上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)生變化,下一步將在細(xì)胞層面驗(yàn)證它們與外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相互作用關(guān)系。