劉偉華,尹春燕,常 明

(1西安市第一醫(yī)院兒科,西安 710004;2西安交通大學第二附屬醫(yī)院兒科;3安康市人民醫(yī)院兒科;*通訊作者,E-mail:286896173@qq.com)

肥胖是一種由多種因素引起的慢性代謝紊亂性疾病,體脂占體重的百分比異常增高,沉積脂肪過多所致。白色脂肪組織占正常成人體重約20%,其在肥胖人群中所占比例顯著升高[1]。白色脂肪組織過度蓄積是引起肥胖及一系列代謝紊亂的根源。脂肪生成是指前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞的過程[2],白色脂肪前體細胞向成熟細胞的分化過程受到CCAAT-增強結(jié)合蛋白β/α(C/EBP-β/α)-過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)信號通路調(diào)控[3,4]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)通過對鄰近或遠端基因的調(diào)控影響而發(fā)揮信號通路的調(diào)節(jié)作用,并參與多種疾病,如癌癥、心血管疾病和代謝紊亂等的發(fā)生及進展[5],然而lncRNA在脂肪生成中的調(diào)控作用仍不十分清楚。本研究旨在分析脂肪生成過程中l(wèi)ncRNA表達譜,并初步探討lncRNA Gm15290在脂肪生成中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡雄性野生型(WT)C57BL/6J小鼠4只和4周齡ob/ob小鼠4只,購自于西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心。頸脫位處死小鼠,采集腹股溝白色脂肪組織(IWAT)和附睪白色脂肪組織(EAT),清洗后立即冷凍于液氮中備用。

1.2 主要試劑

Trizol試劑購自美國Invitrogen公司;RNeasy Mini Kit購自德國Qiagen公司;lncRNA芯片購自美國Arraystar公司;DMEM-F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;油紅O購自美國Sigma公司;脂質(zhì)體3000購自上海吉瑪公司;PPARγ抗體、aP2抗體、抗C/EBPα抗體購自英國Abcam公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴增試劑盒購自中國的寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 lncRNA芯片分析

用研缽研磨冷凍脂肪組織并用Trizol試劑消化,按照RNeasy Mini Kit說明方法提取總RNA。測定RNA樣品的濃度和純度后,將白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織的RNA以相等量混合加入小鼠lncRNA芯片進行檢測。在標準化前提取原始數(shù)據(jù)。使用GeneSpring GX軟件處理數(shù)據(jù)。當表達差異超過2倍時,說明WT小鼠和ob/ob小鼠lncRNA之間存在差異。通過Gene Ontology和DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO生物功能和基于KEGG的pathway富集分析,以P<0.05表示具有統(tǒng)計學意義的信號通路。

1.4 前脂肪細胞的原代培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

處死4周齡的WT小鼠,取小鼠腹股溝白色脂肪組織,去除任何可見的血塊和結(jié)締組織,用PBS沖洗,切割成5 mm3小塊。用1 mg/ml膠原酶在37 ℃水浴中消化脂肪組織45 min左右。消化好的組織液通過400目篩網(wǎng)過濾,懸浮液以1 000 r/min離心5 min,細胞用無血清培養(yǎng)基洗滌,再離心,懸浮于DMEM-F12培養(yǎng)基中,之后將細胞接種到35 mm培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)18 h后,去除非貼壁細胞,更換培養(yǎng)基。第3代細胞用于細胞轉(zhuǎn)染和脂肪分化實驗。

將1×106個/孔的原代細胞接種于6孔板。當細胞匯合達70%時,按照說明書用脂質(zhì)體3 000轉(zhuǎn)染試劑將pAd-Gm15290或Gm 15290 siRNA轉(zhuǎn)染進細胞,分別在第0,2,4,6,8天,用Western blot檢測成脂基因的蛋白水平。具體分組如下:①空白對照組、空載體組(vector組)、pAd-Gm15290(0.1,0.5,1.0 μg/ml);②空白對照組、正常對照組(scramble組)、Gm 15290 siRNA(20,40,80 nmol/L)。

1.5 雞尾酒法誘導(dǎo)分化脂肪細胞

以8×104/孔將原代前脂肪細胞鋪于6孔板,當細胞匯合度達100%后繼續(xù)培養(yǎng)3 d。加入誘導(dǎo)A液(10%FBS、DMEM、IBMX、DEX、Insulin)誘導(dǎo)48 h,再加入誘導(dǎo)B液(10%FBS、DMEM、Insulin)誘導(dǎo)48 h,需要2 d換1次液,共刺激12 d。

1.6 油紅O染色

為了觀察脂肪細胞是否誘導(dǎo)成功,在脂肪細胞誘導(dǎo)分化第8天,用PBS洗滌兩次,用4%的多聚甲醛溶液固定40 min,加入改良的油紅O染色液,染色8 min,用純凈水沖洗2次,光學顯微鏡觀察細胞質(zhì)中脂滴的聚集情況。

1.7 Western blot檢測PPARγ、aP2及C/EBPα蛋白表達

脂肪細胞用1%PMSF的RIPA緩沖液溶解。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)裂解液,將樣品轉(zhuǎn)移到PDVF膜上,用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h。用PPARγ抗體(1 ∶200)、aP2抗體(1 ∶300)、抗C/EBPα抗體(1 ∶500)在4 ℃過夜,用合適的辣根過氧化物酶結(jié)合IgG(1 ∶2 000,ABCAM)在室溫下孵育1 h。用增強化學發(fā)光試劑盒顯影,并用Quantity One軟件進行分析。

1.8 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測lncRNA Gm 15290的表達

采用Trizol試劑提取脂肪組織中的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA第一鏈合成,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用25 μl反應(yīng)體系進行PCR擴增,擴增條件為:95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 25 s,共35個循環(huán),72 ℃ 10 min。擴增結(jié)束后采用iCycler iQTMOptical System進行數(shù)據(jù)分析。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 lncRNA Gm 15290在ob/ob小鼠的白色脂肪組織中顯著上調(diào)

采用小鼠lncRNA芯片檢測WT小鼠和ob/ob小鼠白色脂肪組織的lncRNA的差異表達譜,結(jié)果表明在WT小鼠和ob/ob小鼠之間有2 246個lncRNAs存在差異表達。利用生物信息學分析差異表達的lncRNA的分類、長度分布和染色體分布等一些特征,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這2 246個差異表達lncRNA中,53.6%(1 204個)為外顯子lncRNA,19.4%(436個)為內(nèi)含子lncRNA,27.0%(606個)為反義lncRNA(見圖1A)。差異表達的lncRNA長度分布比較均勻,長度<1 000 nt的lncRNA為337,長度為1 000-2 000 nt的lncRNA為411,長度>20 000 nt的lncRNA為437個(見圖1B)。差異表達的lncRNA分布主要集中在1號染色體上,其余的lncRNA相對均勻地分布在其他染色體上(見圖1C)。采用GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn),在這些差異顯著表達的lncRNA中,lncRNA Gm 15290與代謝和細胞生物合成過程有關(guān),可能參與脂肪合成。qPCR分析結(jié)果表明,ob/ob小鼠白色脂肪組織的lncRNA Gm 15290水平約為WT小鼠的兩倍(見圖1D)。這表明lncRNA Gm 15290可能在肥胖脂肪組織生成中具有一定作用。

圖1 lncRNA在WT小鼠和ob/ob小鼠白色脂肪組織中差異表達Figure 1 Differential expression of lncRNA in white adipose tissue of WT mice and ob/ob mice

2.2 lncRNA Gm 15290可以促進小鼠原代脂肪細胞脂肪生成

pAd-Gm15290過表達與Gm15290 siRNA敲除效率見圖2,采用0.5 μg/ml pAd-Gm15290和40 nmol/L lncRNA Gm 15290 siRNA進行后續(xù)研究。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA Gm15290過表達可以顯著促進脂肪細胞分化,而Gm15290基因敲除明顯抑制脂肪細胞分化。lncRNAGm15290主要通過促進包括PPARγ、早期成脂C/EBPα和晚期脂肪分子aP2的表達促進脂肪生成(見圖3)。油紅O染色顯示,pAd-Gm15290轉(zhuǎn)染第8天脂肪細胞內(nèi)可見大量脂滴蓄積,而Gm15290 siRNA轉(zhuǎn)染后脂肪細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積較少(見圖4)。這些體外實驗表明,lncRNA Gm15290在小鼠脂肪細胞成脂中發(fā)揮正調(diào)節(jié)作用。

與control比較,*P<0.05;與0.1 μg/ml or 20 nmol/L比較,#P<0.05圖2 pAd-Gm15290過表達與Gm15290 siRNA敲除效率 (n=8)Figure 2 Overexpression of pAd-Gm15290 and knockout efficiency of Gm15290 siRNA (n=8)

圖3 pAd-Gm15290及Gm15290 siRNA對脂肪細胞PPARγ、C/EBPα和aP2表達的影響Figure 3 Effects of pAd-Gm15290 and Gm15290 siRNA on the expression of PPARγ, C/EBPα and aP2 in adipocytes

圖4 第8天脂肪細胞脂質(zhì)堆積的油紅O染色分析Figure 4 Oil red O staining analysis for the lipid accumulation in the adipocytes at day 8

3 討論

越來越多的研究表明,lncRNA具有種屬特異性及廣泛的生物學功能,然而目前對lncRNA在人類脂肪組合成中的調(diào)節(jié)功能及其在其他代謝性疾病中的作用仍然不是很清楚[6]。本研究采用lncRNA芯片技術(shù)成功地分析了lncRNA在WT小鼠和ob/ob小鼠白色脂肪組織中的差異表達譜。根據(jù)基因芯片數(shù)據(jù),結(jié)果提示共有2 246個lncRNA存在差異表達,說明有許多l(xiāng)ncRNAs可能參與了肥胖的發(fā)生及脂代謝。為了進一步明確這些lncRNA的生物學功能,本研究采用GO分析和KEGG分析對其功能進行研究。GO分析結(jié)果提示涉及差異表達的lncRNA的主要生物學過程包括“炎癥反應(yīng)”“細胞因子產(chǎn)生”“脂質(zhì)代謝過程”“葡萄糖代謝過程”和“有機酸代謝過程”。KEGG分析顯示,與lncRNA相關(guān)的基因主要涉及“破骨細胞分化”“糖尿病”“脂肪酸代謝”“丙酮酸代謝”和“不飽和脂肪酸的生物合成”。此外,本研究結(jié)果還提示一些富集的代謝通路,比如碳代謝和瘧疾,這些通路在肥胖發(fā)展中的作用至今還沒有被研究過,需要進一步研究。lncRNA通過多種機制發(fā)揮生物學功能,包括與非編碼RNAs或基因的結(jié)合、染色質(zhì)修飾、剪接和翻譯[7,8]。此外,越來越多的證據(jù)表明lncRNA可能通過相互作用的網(wǎng)絡(luò)在脂肪組織中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

lncRNA Gm 15290最早是在2014年通過對遺傳性癲癇小鼠腦內(nèi)差異基因表達的高通量測序發(fā)現(xiàn)的[9]。在此之后,對小鼠轉(zhuǎn)錄因子和非編碼RNA的綜合分析發(fā)現(xiàn)lncRNA Gm 15290在閉塞性毛細支氣管炎中顯著上調(diào)[10]。最近一項關(guān)于非小細胞肺癌的研究,也是目前唯一關(guān)于lncRNA Gm 15290的生物學功能研究,實驗表明lncRNA Gm 15290通過海綿樣吸附腫瘤抑制因子miR-615-5p發(fā)揮促進腫瘤生成的作用[11]。然而,目前l(fā)ncRNA Gm 15290在肥胖及代謝疾病中的作用仍然不清楚。在本研究的芯片分析中,結(jié)果提示lncRNA Gm 15290是ob/ob小鼠白色脂肪組織上調(diào)最顯著的lncRNAs之一。通過對小鼠原代脂肪細胞過表達和沉默處理,結(jié)果提示lncRNA Gm 15290在體外對脂肪生成和體內(nèi)脂肪沉積均有正調(diào)控作用。此外研究結(jié)果提示lncRNA Gm 15290可以促進PPARγ、C/EBPα和aP2的表達促進脂肪生成。核激素受體核PPARγ家族有3個成員:α、γ和δ,其中,PPARγ是唯一在脂肪組織中高度表達的基因,并已被證明在促進脂肪程序性生成過程中發(fā)揮著核心作用。PPARγ在前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化過程的早期表達中異位表達PPARγ和激活配體可以促進非脂肪成纖維細胞轉(zhuǎn)化為脂肪間充質(zhì)細胞并誘導(dǎo)完整的成脂基因的性程序表達,研究結(jié)果提示lncRNA Gm 15290可以促進PPARγ的表達。C/EBPα在脂肪細胞分化過程中表達相對較晚,它的表達在PPARγ之后,但是在脂肪細胞分化完成時許多特異性酶和蛋白質(zhì)合成之前。C/EBPα在成纖維細胞中的高表達同樣可以促使其轉(zhuǎn)化為脂肪細胞[12]。aP2(AFBP4)最早是在白色脂肪組織及成熟脂肪細胞中檢測出的。FABP4在脂肪細胞中高度表達,約占脂肪組織中所有可溶性蛋白的1%。FABP4主要在脂肪細胞分化晚期表達,主要與脂滴合成有關(guān),并受到PPARγ激動劑、胰島素、地塞米松和過氧化物酶體激活受體(PPAR)的調(diào)控[12]。而lncRNA Gm 15290均可促進上述脂肪細胞分化相關(guān)基因的表達,說明lncRNA Gm 15290在整個脂肪細胞分化過程中均發(fā)揮正向調(diào)控作用。

綜上所述,本研究結(jié)果提示多種lncRNAs在WT小鼠和ob/ob小鼠白色脂肪組織中的差異表達,lncRNA Gm 15290在ob/ob小鼠白色脂肪組織明顯上調(diào),進一步研究結(jié)果提示lncRNA Gm 15290可以促進PPARγ、C/EBPα和aP2的表達進而促進脂肪生成。但本研究僅是體外細胞研究,為了明確lncRNA Gm 15290的具體作用機制,需要進一步進行體內(nèi)實驗研究。