林海華,韓 平,余玉紅,張紹敏,呂佳敏,張淵智#

(1深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科,深圳 518000;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:haihua19860913@163.com;#共同通訊作者,E-mail:29268395@qq.com)

原發(fā)性肝癌是一種常見的惡性腫瘤,目前全世界每年新增肝癌患者約70萬,其中我國新增肝癌患者約占一半。肝癌早期易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移,是肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)、療效差的主要原因[1]。

正常的肝臟上皮細(xì)胞的存活,需要黏附于細(xì)胞外基質(zhì)。如果肝細(xì)胞失去了與多種細(xì)胞基質(zhì)的接觸以及整合素蛋白傳導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào),就會(huì)導(dǎo)致其黏附性降低,最終出現(xiàn)細(xì)胞凋亡,這種由于細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)和其他細(xì)胞失去接觸而誘導(dǎo)的死亡形式被稱為失巢凋亡(anoikis)[2]。失巢凋亡作為一種不同于普通凋亡的特殊的程序化細(xì)胞死亡方式,在機(jī)體發(fā)育、維持組織平衡、疾病的發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用。腫瘤細(xì)胞抗失巢凋亡的能力越強(qiáng),其侵襲轉(zhuǎn)移的能力就越高。因此從增加腫瘤細(xì)胞失巢凋亡這方面來干預(yù)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移,已受到越來越多的重視。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族的一種糖蛋白,早期研究發(fā)現(xiàn)其與神經(jīng)細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、修復(fù)、再生有關(guān)。最近有研究表明其與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)[3,4]。前期研究表明,NGF在肝癌組織相對(duì)于癌旁組織表達(dá)明顯增高,且可能在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用[5]。本文利用低轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞HepG2研究NGF對(duì)抗失巢凋亡能力的影響,并探討其受體TrkA和p75NTR在這個(gè)過程中發(fā)揮的作用,為肝癌的治療提供新干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721由深圳市肝病研究所提供;PolyHEMA試劑、低熔點(diǎn)瓊脂糖、CEP-701(TrkA受體抑制劑)等購自美國SIGMA公司;NGF質(zhì)粒由加拿大McGill大學(xué)Barker教授惠贈(zèng);兔抗NGF多克隆抗體購自于美國Santa Cruz公司;轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000購自于Introvigen公司,Annexin-Ⅴ/FITC流式細(xì)胞檢測(cè)試劑盒購自凱基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合度接近90%時(shí)棄去培養(yǎng)基,以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后加入1 ml 0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化細(xì)胞按1-4傳代。

1.2.2 Western blot檢測(cè)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中NGF的表達(dá)情況 采用RIPA裂解細(xì)胞,低溫離心機(jī)以15 000 r/min離心10 min后立即收集上清液,二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白含量。配制12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠,取50 μg總蛋白進(jìn)行電泳,電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(NC膜)上,用含5%牛血清白蛋白的TBST室溫封閉1 h,加入兔抗NGF多克隆抗體(以1 ∶2 000稀釋)后4 ℃孵育過夜,TBST洗3×10 min后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫孵育1 h,然后TBST洗5×10 min,再采用電化學(xué)法顯影發(fā)光,X膠片曝光保存。按上述方法分別檢測(cè)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中NGF的表達(dá)情況,以β-actin為內(nèi)參照。

1.2.3 HepG2-pcDNA3-NGF穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞,胰酶消化后將細(xì)胞均勻鋪于六孔板,待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。取250 μl無血清培養(yǎng)基與4.0 μg NGF質(zhì)粒(pcDNA3-NGF)混勻,另取250 μl無血清培養(yǎng)基與10 μl的lipofectamine2000混勻,室溫孵育5 min;將上述兩種混合物混勻,室溫放置20 min,形成DNA-lipofectamine2000復(fù)合物。用無血清培養(yǎng)基洗HepG2細(xì)胞兩次,之后每孔內(nèi)加入2 ml新的無血清培養(yǎng)基,再將上述混合物平均加入到每孔中,混合均勻。6 h后更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,48 h后換用含G418的常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。以后間隔2-4 d換液一次,持續(xù)28 d,獲得細(xì)胞抗性克隆HepG2-pcDNA3-NGF(HepG2-NGF細(xì)胞)。待細(xì)胞高度融合后,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中用含G418的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。以同樣的方法轉(zhuǎn)染不含NGF的pcDNA3質(zhì)粒至HepG2細(xì)胞(HepG2-control),作為陰性對(duì)照組。之后應(yīng)用Western blot檢測(cè)HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染NGF質(zhì)粒后其NGF表達(dá)的變化。

1.2.4 軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn) 將1.2%的瓊脂糖與2×DMEM培養(yǎng)基(20%胎牛血清)等體積混合,制成0.6%的底層瓊脂凝膠,在24孔板每孔內(nèi)加入800 μl,置于室溫使瓊脂膠凝固后備用。將0.6%的瓊脂糖與2×DMEM培養(yǎng)基等體積混合,制成0.3%的上層瓊脂凝膠。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,0.25%胰酶消化后計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為104個(gè)/ml。每孔加入100 μl的單細(xì)胞懸液(約1 000個(gè)細(xì)胞/孔),將其混勻,待凝固后將培養(yǎng)板置于37 ℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2周,結(jié)晶紫染色后拍照。

1.2.5 失巢凋亡培養(yǎng)模型的建立 參照文獻(xiàn)構(gòu)建細(xì)胞失巢凋亡培養(yǎng)的模型[6]。陰離子聚合物聚甲基丙烯酸羥乙基酯(polyHEMA)鋪于平皿底部,細(xì)胞無法貼壁生長(zhǎng),借此模擬細(xì)胞失巢樣生長(zhǎng)狀態(tài)。取10 g/L的polyHEMA無水乙醇溶液2 ml,鋪于60 mm的培養(yǎng)皿中,紫外燈照射消毒,室溫干燥直至無水乙醇全部揮發(fā)形成一層膜后,再次重復(fù)上述步驟。將1×106細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中,在37 ℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用于實(shí)驗(yàn)觀察。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集下列狀態(tài)下的細(xì)胞:①貼壁生長(zhǎng)24 h的HepG2細(xì)胞;②懸浮生長(zhǎng)24 h的HepG2細(xì)胞;③懸浮生長(zhǎng)24 h的HepG2-control細(xì)胞;④懸浮生長(zhǎng)24 h的HepG2-NGF細(xì)胞;⑤懸浮生長(zhǎng)24 h的HepG2-NGF細(xì)胞+CEP-701(濃度10 mg/L);⑥懸浮生長(zhǎng)24 h的HepG2-NGF細(xì)胞+p75NTR蛋白(濃度500 ng/ml)。調(diào)整約105個(gè)細(xì)胞/EP管,離心2 000 r/min×5 min,棄上清,加入200 μl PBS重懸細(xì)胞,重復(fù)上述的步驟兩次,然后每管加入200 μl結(jié)合緩沖液,再加入FITC 5 μl/管,混勻后避光反應(yīng)10 min,再加入PI(propidium,碘化吡啶)5 μl/管混勻,室溫反應(yīng)10 min,1 h內(nèi)用流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用SPSS16.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較應(yīng)用one way ANOVA檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HepG2、SMMC-7721細(xì)胞中NGF的表達(dá)情況

Western blot檢測(cè)NGF在具低轉(zhuǎn)移潛能的HepG2細(xì)胞和具高轉(zhuǎn)移潛能的SMMC-7721細(xì)胞中的表達(dá)。NGF在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于在SMMC-7721細(xì)胞中的表達(dá)(見圖1),因此我們選擇HepG2細(xì)胞為載體研究NGF的作用。pcDNA3-NGF質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞后,NGF蛋白表達(dá)水平明顯增高,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3-NGF后HepG2細(xì)胞中NGF蛋白表達(dá)量大約是對(duì)照組細(xì)胞的5倍(見圖1)。

圖1 NGF在肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721中的表達(dá)及NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞前后的表達(dá)變化Figure 1 The expression of NGF in HepG2 cells and SMMC-7721cells and its change in HepG2 cells after transfection

2.2 NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞集落形成的影響

HepG2、HepG2-control、HepG2-NGF細(xì)胞在軟瓊脂中生長(zhǎng)7 d均可逐漸形成集落,觀察各組細(xì)胞在14 d后每平方厘米形成的直徑大于75 μm的集落數(shù)量,HepG2、HepG2-control生長(zhǎng)14 d后每平方厘米的細(xì)胞集落數(shù)分別為(26±4)個(gè)和(29±5)個(gè),兩組之間沒有明顯差異(t-test,P>0.05);穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NGF的HepG2細(xì)胞(HepG2-NGF)和具有高轉(zhuǎn)移潛能、高表達(dá)NGF的SMMC-7721細(xì)胞在生長(zhǎng)14 d后可形成集落數(shù)分別為(78±7)個(gè)/cm2和(63±6)個(gè)/cm2(每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,每次實(shí)驗(yàn)測(cè)量10個(gè)單位面積的集落數(shù)),明顯多于HepG2細(xì)胞和HepG2-control細(xì)胞生長(zhǎng)14 d細(xì)胞集落數(shù)(見圖2),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(one way ANOVA,P<0.05)。證明NGF能增加HepG2細(xì)胞集落形成的能力。

2.3 NGF對(duì)HepG2細(xì)胞在失巢培養(yǎng)模型中生長(zhǎng)的影響

觀察不同細(xì)胞在貼壁狀態(tài)和失巢的懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)形態(tài)的變化。未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NGF的HepG2-NGF細(xì)胞均可在貼壁狀態(tài)下正常生長(zhǎng)(見圖3A,B)。在失巢培養(yǎng)模型的懸浮狀態(tài)下,HepG2細(xì)胞可以聚集成團(tuán)生長(zhǎng),并有部分散在的細(xì)胞(見圖3C),說明該細(xì)胞具有一定的抗失巢凋亡能力。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NGF的HepG2-NGF細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下大部分能聚集成直徑更大的團(tuán),且僅有少許散在的細(xì)胞(見圖3D),說明NGF能增加HepG2細(xì)胞的抗失巢凋亡能力。

與HepG2、HepG2-control細(xì)胞相比較，*P<0.05圖2 各類細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)14 d后集落數(shù)的對(duì)比Figure 2 The quantity of cell colony in different cells at 14 d in suspension culture models

圖3 HepG2、HepG2-NGF細(xì)胞在貼壁、懸浮狀態(tài)下的生長(zhǎng)情況Figure 3 The growth situation of HepG2 and HepG2-NGF cells in attached and suspension culture models

2.4 NGF對(duì)HepG2細(xì)胞失巢凋亡的影響

利用流式細(xì)胞儀、Annexin-Ⅴ/FITC試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況,每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。HepG2細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后的早期細(xì)胞凋亡比例為3.78%±0.33%,HepG2細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)24 h后的早期凋亡比例為4.63%±0.38%,稍微高于HepG2細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的早期凋亡比例,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖4),說明HepG2細(xì)胞本身具有一定的抗失巢凋亡能力。當(dāng)HepG2細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NGF質(zhì)粒后,HepG2-NGF細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)24 h的早期凋亡比例為1.43%±0.18%,明顯低于HepG2細(xì)胞和只轉(zhuǎn)染pcDNA3的對(duì)照細(xì)胞HepG2-control(凋亡比例5.42%±0.47%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4),說明NGF能增加HepG2細(xì)胞的抗失巢凋亡能力。

2.5 NGF增加HepG2細(xì)胞抗失巢凋亡能力與其受體的關(guān)系

為研究TrkA受體及p75NTR受體在NGF增強(qiáng)HepG2細(xì)胞抗失巢凋亡能力中的作用,我們選用TrkA受體拮抗劑CEP-701及p75NTR蛋白研究他們對(duì)HepG2細(xì)胞失巢凋亡的影響。在懸浮生長(zhǎng)的HepG2-NGF細(xì)胞中加入10 mg/L的CEP-701或500 ng/ml的p75NTR蛋白,24 h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡比例,每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。結(jié)果發(fā)現(xiàn),加入CEP-701或p75NTR蛋白后,HepG2-NGF細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)24 h的早期凋亡比例分別為12.37%±1.74%和15.48%±2.36%,明顯高于不加CEP-701或p75NTR蛋白的HepG2-NGF細(xì)胞凋亡比例,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。這說明CEP-701或p75NTR蛋白可以降低NGF的抗肝癌細(xì)胞失巢凋亡的能力,提示NGF可能通過與TrkA受體結(jié)合發(fā)揮其抗肝癌細(xì)胞失巢凋亡作用,而與p75NTR受體的結(jié)合可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。

與HepG2、HepG2-control細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)24 h比較，*P<0.05；與HepG2-NGF細(xì)胞相比，#P<0.05圖4 各種細(xì)胞的早期凋亡比例比較Figure 4 The proportion of early apoptosis in different cells

3 討論

目前,手術(shù)切除仍是原發(fā)性肝癌的主要治療手段,但術(shù)后腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,是造成肝癌患者預(yù)后差的主要原因[7]。具有抗失巢凋亡能力的腫瘤細(xì)胞能在游離狀態(tài)下長(zhǎng)期存活,導(dǎo)致肝癌患者在切除原發(fā)病灶后仍易發(fā)生肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族中的一種與神經(jīng)細(xì)胞分化生長(zhǎng)有關(guān)的細(xì)胞因子,有研究顯示其與多種腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。NGF的受體有兩種:一種為TrkA,為高親和性受體,它是由原癌基因trk編碼的一種酪氨酸激酶受體,能特異性地與NGF結(jié)合,激活酪氨酸激酶信號(hào)傳遞系統(tǒng),從而啟動(dòng)細(xì)胞活性,產(chǎn)生生物效應(yīng),該途徑可能與調(diào)節(jié)基因表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞分化有關(guān)。另一種為糖蛋白受體,簡(jiǎn)稱p75NTR,為低親和力受體,除了與NGF結(jié)合外,還可與其他神經(jīng)營養(yǎng)蛋白結(jié)合,是最先克隆鑒定的神經(jīng)營養(yǎng)素的受體。NGF通過其受體p75NTR在腫瘤細(xì)胞凋亡和侵襲等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[3,9]。

以前的研究表明,肝癌組織中NGF表達(dá)明顯高于癌旁組織,NGF可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[5];本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了高轉(zhuǎn)移潛能的SMMC-7721細(xì)胞中NGF的表達(dá)明顯高于低轉(zhuǎn)移潛能的HepG2細(xì)胞(見圖1)。癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移潛能與其抗失巢凋亡能力呈正相關(guān),因此推測(cè)NGF高表達(dá)能增加肝癌細(xì)胞的抗失巢凋亡能力。本實(shí)驗(yàn)選用低NGF表達(dá)、低轉(zhuǎn)移潛能的HepG2細(xì)胞為載體研究NGF的作用,研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染NGF質(zhì)粒的HepG2-NGF細(xì)胞在軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)中形成的集落數(shù)量明顯多于HepG2細(xì)胞(見圖2),在懸浮培養(yǎng)模型中細(xì)胞早期凋亡率降低(見圖4),證明NGF的表達(dá)越高,其抗失巢凋亡的能力越強(qiáng),這種能力可能使NGF在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。

Kishibi等[10]和Yoshihiko等[11]研究發(fā)現(xiàn)與肝硬化,肝炎組織相比,肝癌組織中除了NGF的表達(dá)明顯增多外,TrKA受體表達(dá)明顯高于癌旁組織;TrKA受體拮抗劑能對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[12],而無論是在肝細(xì)胞中,還是在肝癌細(xì)胞中都不能檢測(cè)到p75NTR受體的表達(dá)[11]。因此本研究推測(cè),增加NGF的p75NTR受體或抑制TrKA受體均可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡,對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。向HepG2-NGF細(xì)胞中加入p75NTR蛋白或TrKA受體抑制劑后均發(fā)現(xiàn)它在懸浮培養(yǎng)模型中的失巢凋亡率明顯增加,甚至高于未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞,說明NGF可能通過與TrkA受體結(jié)合發(fā)揮其抗肝癌細(xì)胞失巢凋亡作用,而其受體p75NTR可能在這個(gè)過程中發(fā)揮相反的作用,NGF與p75NTR受體的結(jié)合可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。

惡性腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移到異位的起始階段,都具備明顯的抗失巢凋亡能力。肝癌細(xì)胞從腫瘤部位脫落后不發(fā)生凋亡,而是在起始階段就發(fā)生了抗失巢凋亡,繼續(xù)在循環(huán)系統(tǒng)中生存,遷移到周圍組織繼續(xù)生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)NGF在這個(gè)過程中可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的抗失巢凋亡的能力,為進(jìn)一步探討肝癌細(xì)胞的抗失巢凋亡的機(jī)制奠定了基礎(chǔ),而且有望為肝癌的治療開辟NGF這個(gè)新的干預(yù)靶點(diǎn)。