徐 倩杜 超嚴 鵬肖艷紅王麗娜蘇花衛(wèi)周曉慧?

（1.承德醫(yī)學院，河北 承德067000； 2.承德石油高等?？茖W校，河北 承德067000）

近年來，由動脈粥樣硬化（artherosclerosis，AS）所導致的心腦血管疾病已成為威脅人們健康的頭號殺手。AS 的發(fā)病機制十分復雜，沒有一個統(tǒng)一的學說，但目前一致認為血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能的改變是AS 的始動環(huán)節(jié)，高脂血癥是AS 的一個獨立危險因素［1］。

芹菜素是一種黃酮類化合物，主要存在于溫熱帶的蔬菜、水果中。研究表明芹菜素具有抗腫瘤、抗氧化、降壓、抗動脈粥樣硬化等藥理作用［2-3］，但芹菜素抗AS 的分子病理機制尚不清楚。推斷芹菜素可阻斷LDL 氧化成氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）的過程，進而阻斷凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1（lectinlike oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1）介導的一系列反應。

本研究以SD 大鼠為研究對象，構(gòu)建動脈粥樣硬化大鼠模型，觀察芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠主動脈LOX-1 mRNA、NF-κB 蛋白表達的影響。

1 材料

1.1 藥物和試劑 芹菜素購自于陜西慧科植物開發(fā)有限公司（純度為98%，批號20161209）；維生素D3 注射液（批號130142）購于上海通用藥業(yè)股份有限公司；辛伐他汀片（規(guī)格25 mg／片，批號31604015）購于江蘇平光制藥（焦作）有限公司。NF-κB p65 一抗（批號297412-1）購自英國Abcam 公司；β-actin 一抗（批號AA1217B8088ZJ2）、二抗（批號140740）均購自美國Santa cruz 公司。低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測試盒（批號20170509）、總膽固醇（LDL-C））測試盒（批號20170508）、甘油三酯測試盒（批號20170511）、高密度脂蛋白總膽固醇測試盒（批號20170509）購自南京建成生物工程研究所，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 7020 型全自動生化分析儀（日本日立公司）；Excelsior ES 全自動組織脫水機（芬蘭Thermo 公司）；RM2235 切片機（德國Leica 公司），BH-2 型顯微鏡（日本OLYMPUS 公司），CC6 離心機（北京鼎昊源科技有限公司）。

1.3 動物 健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量140～160 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物使用許可證號SCXK（京）2016-0006。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 參照李前寬［4］論文中采用的制備動脈粥樣硬化模型的方法，給予大鼠高脂飼料（3% 膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2% 丙基硫氧嘧啶、5% 白糖、10% 豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料）并腹腔注射維生素D3。60 只SD 大鼠隨機分為正常組，模型組，芹菜素低、中、高劑量組，辛伐他汀陽性對照組，每組10 只。進行1 周預飼養(yǎng)，飼養(yǎng)于光照為12 h 的環(huán)境下，給予充足的食物和水。1 周后，除正常組給予普通飼料外，其余各組給予高脂飼料；此外，除正常組外，其余各組腹腔注射維生素D3注射液，劑量為2.33 mL／kg，共注射3 次，1 次／月。在造模過程中，由于動物房暖氣故障，某幾日溫度驟降，一部分大鼠死亡，每組大鼠數(shù)量減少為6 只。喂養(yǎng)高脂飼料24 周后，分別給予不同劑量的芹菜素進行干預，其中芹菜素低劑量組灌胃給予芹菜素20 mg／kg、芹菜素中劑量組灌胃給予芹菜素40 mg／kg、芹菜素高劑量組灌胃給予芹菜素80 mg／kg，陽性對照組灌胃給予辛伐他汀14 mg／kg。各組大鼠灌胃1 次／d，連續(xù)給藥8 周，其中正常組，模型組每日給予植物油灌胃。

2.2 HE 染色 大鼠灌胃8 周后，禁食24 h，10%水合氯醛麻醉，剪開大鼠胸腹部皮膚，分離大鼠腹主動脈并取材，4%多聚甲醛固定，切成若干小塊，制作蠟塊，待蠟塊完全干燥后，調(diào)節(jié)切片機的切片厚度為5 μm，切片，拷片，37 ℃過夜后，進行HE 常規(guī)染色，光鏡觀察大鼠主動脈組織病理學改變。

2.3 生化分析儀檢測 大鼠灌胃8 周后，禁食24 h，10%水合氯醛麻醉，剪開大鼠胸腹部皮膚，用血樣采集針抽取大鼠動脈血，3 000 r／min 離心20 min，取上清。于全生化分析儀檢測各組血脂水平（TC、TG、LDC-C、HDL-C）。

2.4 qRT-PCR 檢測 大鼠灌胃8 周后，禁食24 h，10%水合氯醛麻醉，剪開大鼠胸腹部皮膚，分離大鼠腹主動脈并取材，用組織RNA 提取試劑盒提取RNA，然后測量RNA的純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。lox-1 引物序列，正向5′-GAGACATTGGCAGCTTTGTGTGTGTAA-3′，反向 5′-TGCTCATCATCTTGGCTGTGG-3′，片段長度為107 bp。β-actin引物序列，正向5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′，反向5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′，片段長度為165 bp。

2.5 Western blot 檢測 稱取各組大鼠腹主動脈組織約100 mg，加入RIPA 裂解液200 mL，蛋白酶抑制劑PMSF 6 μL。充分勻漿后，3 000 r／min 離心20 min，吸取上清，即得蛋白質(zhì)。每個樣品取30 μg 總蛋白上樣，經(jīng)12% SDSPAGE 電泳，電轉(zhuǎn)膜70 min（電壓為110 V），5%脫脂奶粉封閉3 h，一抗孵育過夜（NF-κB p65 為1∶1 000，β-actin為1∶1 000），TBST 洗膜3 次后，相對應羊抗兔二抗孵育1 h，ECL 法顯影。采用Quantity One 軟件對蛋白條帶進行結(jié)果分析，NF-κB 蛋白相對表達量＝NF-κB p65 蛋白的灰度值／內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

2.6 統(tǒng)計學分析 采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0 進行分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠主動脈組織病理改變 在光鏡下觀察，正常組的腹主動脈內(nèi)皮光滑，無增生；模型組內(nèi)膜增厚并且有突起，可見針型膽固醇結(jié)晶，這說明我們制備的模型是成功的。芹菜素低、中、高劑量組和陽性對照組主動脈病變程度減輕，并且芹菜素劑量越高，主動脈病變程度越輕，說明芹菜素對防治動脈粥樣硬化有一定的作用。見圖1。

圖1 各組大鼠主動脈組織病理學觀察

3.2 大鼠血脂（TC、TG、LDC-C、HDL-C）水平 與正常組比較，模型組TC、TG、LDC-C 水平升高（P＜0.01），HDL-C 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，芹菜素低、中、高劑量組和陽性對照組TC、TG、LDC-C 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），HDL-C 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠血脂水平的影響（， n＝6）

表1 芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠血脂水平的影響（， n＝6）

注：與正常組比較，△P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.3 大鼠腹主動脈組織LOX-1 mRNA 的表達 與正常組比較，模型組LOX-1 mRNA 的表達增強（P＜0.01），與模型組相比，芹菜素低、中、高劑量組和陽性對照組LOX-1 mRNA 的表達降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

3.4 大鼠腹主動脈組織NF-κB p65 蛋白的表達 與正常組比較，模型組NF-κB p65 蛋白表達增強（P＜0.05）；與模型組比較，芹菜素低、中、高劑量組和陽性對照組NF-κB p65 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、表3。

表2 芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠LOX-1 mRNA 表達的影響（， n＝6）

表2 芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠LOX-1 mRNA 表達的影響（， n＝6）

注：與正常組比較，△P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

圖2 Western blot 蛋白條帶

表3 芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠NF-κB p65 蛋白表達的影響（， n＝6）

表3 芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠NF-κB p65 蛋白表達的影響（， n＝6）

注：與正常組比較，△P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

4 討論

由AS 導致的心腦血管疾病是發(fā)病率和死亡率最高的疾病。AS 是指在動脈、動脈壁內(nèi)膜及內(nèi)膜下有脂質(zhì)沉著，同時伴有中層平滑肌細胞移行至內(nèi)膜下增生，使內(nèi)膜增厚，形成黃色或灰黃色狀如粥樣物質(zhì)的斑塊［5］。

為了降低AS 的發(fā)病率和死亡率，提高治愈率，需進一步闡明AS 的發(fā)生發(fā)展機制。近百年來，國內(nèi)外眾多學者進行了大量探索，付出了巨大的努力，已達成一些共識。AS 是多因素共同作用的結(jié)果，是一系列極其復雜的慢性炎癥反應的過程，內(nèi)皮損傷被認定為導致AS 的始動因素之一。大量基礎(chǔ)研究［6］表明，高脂血癥是致AS 的一個獨立的危險因素。流行病學資料［7］提示，血清膽固醇水平的升高與AS 的發(fā)生呈正相關(guān)，發(fā)生高脂血癥時，LDL 水平升高。LDL 經(jīng)過復雜的氧化修飾，轉(zhuǎn)變?yōu)閛x-LDL。ox-LDL 在內(nèi)皮細胞上的主要受體是LOX-1。

LOX-1 是氧化型低密度脂蛋白的主要受體，LOX-1 隸屬于C 型凝集素樣家族，它是II 型單鏈跨膜蛋白，具有功能特異性，能結(jié)合、吞噬或降解低密度脂蛋白。研究顯示LOX-1 主要在內(nèi)皮細胞上表達，參與識別和內(nèi)化氧化型低密度脂蛋白，可被多種AS 相關(guān)危險因素誘導表達，在氧化型低密度脂蛋白介導的AS 病理改變中有重要作用［8］。LOX-1 可引起內(nèi)皮功能障礙，與AS 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9-11］。LOX-1 可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 介導內(nèi)皮細胞損傷，從而促進AS 的發(fā)生發(fā)展。眾所周知，炎性因子NF-κB 被激活后，能介導一系列的炎性反應，如促進ICAM-1，E-selectin 的表達，從而加速AS 的進程。

芹菜素又稱洋芹素或芹黃素，是一種黃酮類化合物，在蔬菜和水果廣泛存在。眾所周知，旱芹中芹菜素含有量高，在一些藥用植物如車前子、絡石藤等中也有很高的含有量，植物源性飲料如茶、酒以及一些調(diào)味品中也有分布［12］。芹菜素化學結(jié)構(gòu)為4，5，7-三羥基黃酮，分子式為C15H10O6，相對分子質(zhì)量為270［13］。研究表明芹菜素具有抗腫瘤、抗氧化、降壓、抗動脈粥樣硬化等藥理作用［14-17］。雖然有關(guān)芹菜素的研究眾多，但是芹菜素抗AS的分子病理機制尚不清楚。因此，本研究構(gòu)建大鼠動脈粥樣硬化的模型，并加入不同濃度的芹菜素進行干預，觀察芹菜素對大鼠的干預作用，并探討其抗動脈粥樣硬化的可能的分子機制。

實驗結(jié)果顯示，模型組血管內(nèi)膜增生，還具有動脈粥樣硬化顯著標志膽固醇結(jié)晶，而加入不同劑量的芹菜素后，動脈粥樣硬化的病變有一定程度的減輕；與正常組比較，模型組LOX-1 mRNA、NF-κB 蛋白表達明顯增強，與模型組比較，芹菜素低、中、高劑量組和陽性對照組LOX-1 mRNA、NF-κB 蛋白表達均明顯降低。

本研究首次表明，芹菜素通過調(diào)控動脈粥樣硬化大鼠LOX-1 mRNA、NF-κB 蛋白表達，進而干預動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本研究驗證了，APG 可阻斷LDL 氧化成ox-LDL的過程，進而阻斷LOX-1 介導的一系列反應，從而延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，芹菜素對高脂血癥導致的動脈粥樣硬化具有的積極的干預作用，其分子機制可能與芹菜素抑制LOX-1、NF-κB 表達有關(guān)。當然，研究還有不足之處，如動脈粥樣硬化的早期，繼內(nèi)皮損傷后，另一個顯著的變化是內(nèi)皮凋亡，那么芹菜素是否對相關(guān)凋亡基因的表達產(chǎn)生影響，有待后續(xù)研究。