劉靜靜 王振華 李素紅 張靜 吳萌 杜順豐 張巖 李春生

摘 要：制備抗羊骨骼肌肌鈣蛋白T（skeletal muscle troponin T，sTnT）的單克隆抗體，評價單抗的特性。通過煮沸提取、切膠純化制備sTnT，融合后獲得分泌抗羊sTnT的雜交瘤細胞株，用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測單抗效價、亞型、特異性等。結果表明：篩選后獲得3 株單克隆抗體（2E11、3D3、4C2），其中4C2特異性好，效價達到15.12×105以上，為IgG1亞型，親和常數(shù)（Ka）為1.1×109 L/mol;免疫印跡結果顯示，該單抗能與牛、羊的骨骼肌提取物反應，與雞、鴨的骨骼肌提取物無明顯反應，表明4C2可以用于區(qū)分反芻動物和禽類的骨骼肌組織。

關鍵詞：羊骨骼肌肌鈣蛋白T;單克隆抗體;肉類來源;免疫鑒別;特異性

Abstract： Monoclonal antibody against sheep skeletal muscle troponin T （sTnT） was prepared and its properties were evaluated. For this aim， sTnT was prepared by extraction in boiling NaCl solution and purified by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis. Hybridoma cell lines with stable secretion of sTnT were obtained after fusion. The titer， subtype and specificity of monoclonal antibodies were analyzed by enzyme linked immunosorbent assay. Three stable monoclonal antibodies （2E11， 3D3 and 4C2） were obtained after cloning. Among these， 4C2 had the best specificity with a titer of 1：5.12 × 105. The subtype of 4C2 was IgG1 and its affinity constant was 1.1 × 109 L/mol. Western blot results showed that the monoclonal antibody reacted with bovine and sheep skeletal muscle extracts but not chicken and duck skeletal muscle extracts. Accordingly， 4C2 could allow discrimination of ruminant from poultry skeletal muscle.

Keywords： sheep skeletal muscle troponin T; monoclonal antibody; meat sources; immunological identification; specificity

肉類食品鮮香味美、營養(yǎng)豐富，一直以來在百姓餐桌上占據(jù)重要位置[1-4]。但在國內及國際貿易中，在牛、羊肉中攙雜價格便宜的鴨肉、以次充好的欺騙行為屢見不鮮[5-6]。目前，肉類來源的鑒別方法主要有：1）顯微鏡觀察法，通過鑒定肉制品的味道、顏色和肉類紋理等進行判別，但是這種方法費時、費力，對工作人員的技術要求高[7-9];2）基因方法，如核酸探針雜交、DNA指紋分析、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）-限制性片段長度多態(tài)性和PCR特異擴增[9-12]，這類方法鑒定結果比較準確，但是成本較高，而且由于DNA沒有組織特異性，對同一物種的肌肉、脂肪、血液等無法區(qū)分[13-15];3）免疫學檢測方法，如免疫印跡、瓊脂擴散、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[16-18]，ELISA方法操作簡單快速，應用最為廣泛[19-20]。

在加工過程中，肉類通常要經(jīng)過加熱、高壓、輻射等處理，DNA和蛋白質損失較大，隨著熱穩(wěn)定蛋白及其抗體的研究，這一問題得到解決[21-22]。肌鈣蛋白（troponin，Tn）為橫紋肌結構蛋白，是肌肉收縮系統(tǒng)的主要調節(jié)蛋白，由TnC、TnT、TnI 3 個亞基組成[23-24]。Chen等[25-26]研究證實，豬TnI為熱穩(wěn)定標志蛋白，并建立ELISA測定動物飼料中動物肌肉的方法。Rencova等[27]用不同動物肌肉組織的熱提取物作為抗原，制備兔多克隆抗體，并建立間接競爭ELISA方法，成功鑒別熱加工的雞、馬、袋鼠和老鼠的肌肉組織。Kim等[28]用腸道平滑肌的加熱提取物制備單抗，可以用于動物飼料中肉骨粉的免疫學檢測。本研究將羊骨骼肌經(jīng)煮沸提取、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）得到TnT條帶，制備特異性單抗，并對抗體特性進行評價，為羊肉免疫學鑒定方法的建立和產(chǎn)品檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HAT培養(yǎng)基（HAT media supplement（50×），

Hybri-MaxTM）、HT培養(yǎng)基（HT media supplement（50×），Hybri-MaxTM）、福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、免疫球蛋白亞型試劑盒 美國Sigma公司;細胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 美國Gibco公司;辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）?北京中杉金橋生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

BALB/c小鼠 河北醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 儀器與設備

90-2磁力攪拌器 上海浦江分析儀器廠;MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;CKX41SF倒置顯微鏡 日本Olympus公司;1510酶標儀、ND2000超微量核酸蛋白測定儀 德國Thermo公司;VORTEX 1漩渦混合器 上海醫(yī)科大學儀器廠;D37520臺式冷凍離心機、移液器 德國Eppendorf公司;FluorChem? HD2化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha公司。

1.3 方法

1.3.1 抗原的提取

取羊骨骼肌去除脂肪和結締組織，研磨混勻，稱取20 g，加入0.15 mol/L NaCl溶液（1∶2，m/V）;渦旋混勻后，超聲提取5 min（100 W），煮沸20 min后，5 000×g離心20 min;去除沉淀，取上清過濾后作為檢測原;采用相同方法提取，經(jīng)離心后，取上清于121 ℃高壓處理30 min，5 000×g離心30 min，上清用Whatman 1號濾紙過濾，濾液加入90%乙醇（1∶3.74，V/V），靜置2 h;混合液7 000×g離心20 min，取沉淀烘干，為免疫原提取物，經(jīng)SDS-PAGE后切膠用于免疫[20]。

1.3.2 SDS-PAGE鑒定

選擇12%分離膠、5%濃縮膠，對檢測原、免疫原提取物進行SDS-PAGE鑒定。

1.3.3 動物免疫

BALB/c小鼠頸背部注射免疫原，每隔2 周加強免疫1 次，3 免后7～10 d斷尾取血，間接ELISA方法檢測血清抗體效價，選取免疫效果最佳的小鼠進行細胞融合。

1.3.4 單克隆抗體的制備

采用聚乙二醇法進行融合，融合7 d后，出現(xiàn)肉眼可見細胞集落時換用HT培養(yǎng)基;上清液用間接ELISA方法檢測，篩選陽性雜交瘤細胞;檢測結果為陽性的孔，挑選吸光度較高的單個克隆，通過有限稀釋法進行亞克隆，直至得到穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株;小鼠體內誘生腹水，采用辛酸-硫酸銨沉淀的方法純化[30]。

1.3.5 單克隆抗體特性鑒定

1.3.5.1 單克隆抗體效價測定

參考劉青濤[17]的方法，并稍作修改。采用間接ELISA法進行抗血清效價測定，具體步驟如下：檢測原質量濃度為5 μg/mL，96孔酶標板每孔100 μL，4 ℃包被過夜;以含體積分數(shù)0.1%吐溫-20的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）作為洗液，洗滌3 次，每次用量300 mL，拍干（下同）;每孔加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的洗液封閉，37 ℃孵育2 h;洗滌、拍干;將待測血清稀釋1 000 倍，每孔加入100 μL，并且設置空白對照孔（PBS）和陰性對照孔（陰性血清），37 ℃孵育45 min;洗滌、拍干;每孔加入100 μL稀釋10 000 倍的HRP標記山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育30 min;洗滌、拍干;每孔加入底物顯色液100 μL，37 ℃避光反應15 min;每孔加入50 μL終止液，終止反應;450 nm波長處測定吸光度（A），陰性對照孔吸光度為A1，陽性對照孔為A2，以A2/A1≥2.1為陽性結果。

1.3.5.2 單克隆抗體亞型測定

按免疫球蛋白亞型試劑盒說明書步驟進行測定。

1.3.5.3 單克隆抗體特異性測定

用間接ELISA法測定單克隆抗體與牛、羊、雞、鴨、魚骨骼肌提取物的效價，提取方法同1.3.1節(jié)。

1.3.5.4 免疫印跡

參考康潔[30]的方法。SDS-PAGE后轉膜，轉膜后經(jīng)封閉、洗膜，加入稀釋的辛酸-硫酸銨純化抗體，洗膜后加入稀釋的HRP標記山羊抗小鼠IgG，洗膜后加入顯色液，采用化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。

1.3.5.5 單克隆抗體親和力測定

參照文獻[29]的方法，采用間接ELISA法測定親和常數(shù)（Ka）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Gradpad作圖軟件、Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 抗原的提取及測定

對羊骨骼肌進行提取后，得到固體物質115 mg，得率為0.57%。經(jīng)考馬斯亮藍G-250法測定，免疫原提取物蛋白含量為48.7%;用超微量核酸蛋白測定儀測得檢測原質量濃度為10.2 mg/mL。

2.2 SDS-PAGE結果

泳道1. 檢測原;泳道2. 免疫原提取物。

由圖1可知，帶形清晰、顏色較深的條帶有3 條，對應的分子質量約為37、24、17 kDa，與文獻[30]報道的骨骼肌的TnT、TnI、TnC亞基分子質量相符。與檢測原相比，免疫原提取物雜帶較少，顏色較深，證明經(jīng)過進一步處理的抗原純度更高。取37 kDa條帶研磨后用于免疫。

2.3 雜交瘤細胞株的篩選

融合后出現(xiàn)肉眼可見細胞集落時，取上清進行間接ELISA檢測陽性克隆，陽性孔繼續(xù)進行亞克隆，直至全陽性。經(jīng)過3～4 次亞克隆，篩選出羊骨骼肌肌鈣蛋白T（skeletal muscle troponin T，sTnT）單克隆抗體細胞株3 株，分泌的單克隆抗體分別命名為2E11、3D3、4C2。

2.4 單克隆抗體效價測定結果

小鼠腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法純化后即為單抗，用超微量核酸蛋白測定儀測定其蛋白質量濃度，間接ELISA測定效價。由表1可知，3 株單克隆抗體細胞株分泌的抗體效價均在105以上。

2.5 單克隆抗體亞型測定結果

采用間接ELISA方法測定3 種單克隆抗體的亞型。由圖2可知，不同雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體與不同亞型的抗體顯色有明顯差異，其中2E11與抗體IgG1反應的A450 nm最高，與抗體IgM反應的A450 nm較低，而與抗體IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA反應的A450 nm均低于0.2;4C2與抗體IgG1反應的A450 nm最高，與抗體IgA、IgM反應的A450 nm較低，而與抗體IgG2a、IgG2b、IgG3反應的A450 nm均低于0.2;因此2E11、4C2分泌的抗體類型以IgG1為主。3D3與抗體IgM反應的A450 nm最高，與抗體IgG1反應的A450 nm較低，與抗體IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA反應的A450 nm均低于0.2，因此3D3分泌的抗體類型以IgM為主。

2.6 單克隆抗體特異性測定

由圖3可知：2E11與牛、羊、雞、鴨骨骼肌提取物反應效價分別為1∶1.0×106、1∶2.0×106、1∶1.0×106、1∶5.1×105，與魚骨骼肌提取物也有明顯反應;3D3與牛、羊骨骼肌提取物的反應效價均為1∶2.5×105，與雞、鴨、魚骨骼肌提取物的反應效價低于1∶5.1×103;4C2與羊骨骼肌提取物反應效價為1∶2.0×106，與牛骨骼肌提取物反應效價為1∶1.0×106，與雞、鴨、魚骨骼肌提取物的效價低于1∶2.5×105。2E11與雞、鴨、魚的交叉反應較高，3D3的特異性較好，但效價相對較低，綜合評價得出，4C2效價較高、特異性較好，用于下一步實驗。

2.7 單克隆抗體免疫印跡

泳道1. 羊骨骼肌提取物;泳道2. 牛骨骼肌提取物;泳道3. 鴨骨骼肌提取物;泳道4. 雞骨骼肌提取物。

由圖4可知，4C2分別與轉印有牛、羊、雞、鴨骨骼肌提取物的聚偏二氟乙烯膜反應，顯色后僅在牛、羊骨骼肌提取物的37 kDa位置出現(xiàn)單一條帶，而雞、鴨骨骼肌提取物無明顯條帶，初步證實4C2能結合牛、羊骨骼肌提取物，主要結合骨骼肌TnT亞基，不與雞、鴨骨骼肌提取物結合。

2.8 單克隆抗體Ka

采用間接ELISA法測定4C2的Ka，以抗體質量濃度的對數(shù)為橫坐標，以A450 nm為縱坐標，繪制S型曲線，經(jīng)計算，Ka為1.1×109 L/mol，表明4C2的親和力較高。

3 結 論

將羊骨骼肌經(jīng)過粗提，免疫小鼠后進行融合，篩選高效價、高特異性的單克隆抗體，最后獲得3 株穩(wěn)定分泌抗羊骨骼肌肌鈣蛋白單克隆抗體的細胞株。通過小鼠體內誘生腹水，用辛酸-硫酸銨沉淀方法進行純化，得到單克隆抗體。經(jīng)過鑒定，4C2特異性較好，與羊骨骼肌提取物的反應效價為1∶2.0×106，與牛骨骼肌提取物的反應效價為1∶1.0×106，與雞、鴨骨骼肌提取物的反應效價低于1∶2.5×105，特異性較好。4C2的類型以IgG1為主，Ka為1.1×109 L/mol。免疫印跡結果顯示，4C2能夠用于區(qū)分牛、羊和雞、鴨的骨骼肌提取物，在37 kDa條帶顯色，證明4C2是骨骼肌TnT的抗體，且可以用于區(qū)分反芻動物和禽類的骨骼肌組織。本研究為食品中羊肉源性成分免疫學鑒別方法的建立提供了參考。

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