田瀟然 呂世鑫 陳玉春 王洪濤

摘 要：通過對秘魯莖柔魚及澳洲雙柔魚的線粒體16S rRNA基因片段進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增和序列比對，確定2 種柔魚品種的特異性位點(diǎn)，并由此設(shè)計(jì)品種特異性引物。利用多重PCR體系對秘魯莖柔魚和澳洲雙柔魚進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地鑒定和區(qū)分，并對該體系的靈敏度進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果表明：在多重PCR體系下，秘魯莖柔魚和澳洲雙柔魚分別擴(kuò)增出長度400、229 bp的品種特異性條帶，2 種柔魚的混合樣品則同時(shí)擴(kuò)增出長度400、229 bp的條帶;且該多重PCR體系可以檢測澳洲雙柔魚中1%秘魯莖柔魚的摻入，檢測限為0.1 ng。

關(guān)鍵詞：秘魯莖柔魚;澳洲雙柔魚;16S rRNA;多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

Abstract： The aim of this study is to establish a rapid and accurate method for molecular discrimination of two squid species， Nototodarus gouldi and Dosidicus gigas. The fragments of mitochondrial 16S rRNA were amplified by polymerase chain reaction （PCR） from the genomic DNA of each squid species. Polymorphic sites were determined by multiple sequence alignments and species-specific primers were designed. Multiplex PCR was conducted for molecular identification of the two squid species with the species-specific primer pairs. Multiplex PCR results showed that specific amplicons of 400 and 229 bp were generated from D. gigas and N. gouldi， respectively. Both 400 and 229 bp amplicons were obtained from the mixtures of the two species. The sensitivity test results showed that the method could detect D. gigas adulteration at 1% in N. gouldi with a limit of detection of 0.1 ng.

Keywords： Dosidicus gigas; Nototodarus gouldi; 16S rRNA; multiplex polymerase chain reaction

頭足類（Cephalopoda）為軟體動(dòng)物門（Mollusca）的重要類群，現(xiàn)存總類800余種[1]，是海洋中最大的食物資源之一。頭足類水產(chǎn)品一直以來都屬于全世界重點(diǎn)開發(fā)的海洋漁業(yè)資源，近幾十年來，世界頭足類捕撈量在海洋捕撈漁業(yè)中的份額呈現(xiàn)持續(xù)增長趨勢[2]。頭足類海產(chǎn)品數(shù)量龐大，種類豐富，目前已經(jīng)進(jìn)行商業(yè)性開發(fā)的主要有柔魚類（Ommastrephidae）、槍烏賊類（Loliginidae）、烏賊類（Sepiidae）和章魚類（Octopodidae）等，其中，柔魚類的開發(fā)比重最大[3]。柔魚類生長周期短，味道鮮美，富含蛋白質(zhì)和多種人體必需氨基酸，營養(yǎng)價(jià)值很高[4]，可食用部分可達(dá)80%以上，素有“窮人的鮑魚”之稱。莖柔魚（Dosidicus gigas）亦稱“秘魯莖柔魚”，柔魚科（Ommastrephidae）、莖柔魚屬（Dosidicus）[5]。

廣泛分布于中部太平洋以東海域，尤其在秘魯沿岸及外海資源豐富[6-7]。秘魯莖柔魚生長速度快、體型較大、世界范圍內(nèi)產(chǎn)量較高，是全球最重要的經(jīng)濟(jì)頭足類資源之一[8]。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）統(tǒng)計(jì)，2003—2012年世界秘魯莖柔魚的年平均產(chǎn)量達(dá)到77.84 萬t[9]。澳洲雙柔魚（Nototodarus gouldi）亦稱“澳大利亞魷”，只分布于澳大利亞東南部和西部海域以及新西蘭海域[10]，目前開發(fā)力度不大，年最高產(chǎn)量不足萬噸，因此價(jià)值較高。

秘魯莖柔魚營養(yǎng)豐富，但是由于體內(nèi)非蛋白氮（nonprotein nitrogen，NPN）和某些游離氨基酸的存在，會(huì)散發(fā)出氨的氣味，且肉質(zhì)偏苦[11]。因此，秘魯莖柔魚的市場價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于相對稀少的澳洲雙柔魚。往往會(huì)有不法商販為了追求更高的經(jīng)濟(jì)利益，而將秘魯莖柔魚假冒或摻入澳洲雙柔魚中進(jìn)行市場銷售。傳統(tǒng)的柔魚鑒定方式主要是通過形態(tài)學(xué)特征，如大小的差異、形狀的不同及色澤的多變來加以區(qū)分和鑒定[12-13]，但在不同環(huán)境生長、處于不同發(fā)育階段、經(jīng)歷不同加工方式的同種柔魚之間，外觀形態(tài)也會(huì)產(chǎn)生很大差異。并且為了保證遠(yuǎn)洋柔魚的鮮度，一般制成凍品或半成品保存[14]，或是通過加工成柔魚丁、柔魚圈、柔魚絲和烤柔魚片等柔魚制品進(jìn)行市場流通[15]。形態(tài)學(xué)鑒定適合整條魚的物種鑒定，一旦進(jìn)行了切片、絞碎等工藝，形態(tài)學(xué)特征徹底缺失以后，柔魚的鑒定將變得異常困難[16]。因此，尋求一種高效、快速鑒別澳洲雙柔魚和秘魯莖柔魚的方法顯得尤為重要。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)由于具有特異性好、靈敏度高、操作簡單且重復(fù)性好等優(yōu)勢，已被越來越多地運(yùn)用到物種鑒定中，它能夠反映不同物種個(gè)體或種群之間基于基因組的某些差異特征，是DNA分子水平上遺傳多樣性的直接反映[17-18]。在魚類基因組序列中，核基因和線粒體基因?yàn)槌Ｓ玫膬纱箢惙肿訕?biāo)記，但由于核基因中存在大量內(nèi)含子等非編碼序列，因此很難找到合適的分子來進(jìn)行標(biāo)記。線粒體基因組作為獨(dú)立存在于高等動(dòng)物細(xì)胞核外唯一的遺傳物質(zhì)，基因排列結(jié)構(gòu)緊密，進(jìn)化速度快，嚴(yán)格母系遺傳且在細(xì)胞質(zhì)中大量存在，相對簡單且適合運(yùn)用于DNA分子標(biāo)記生物學(xué)研究。本研究通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)擴(kuò)增秘魯莖柔魚和澳洲雙柔魚的線粒體16S rRNA基因片段，并進(jìn)行測序和分析，根據(jù)2 種柔魚品種測序結(jié)果序列之間單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)的差異，設(shè)計(jì)品種特異性引物，從而通過多重PCR體系對2 種柔魚單獨(dú)樣品和混合樣品進(jìn)行區(qū)分和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秘魯莖柔魚和澳洲雙柔魚由某公司提供，產(chǎn)地分別為秘魯和澳大利亞。

海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（DP324-02）天根生化科技（北京）有限公司;2×Premix DNA polymerase、Agarose、100 bp PlusII DNA Ladder（BM321）、雙蒸水 北京全式金生物技術(shù)有限公司;無水乙醇（分析純） 天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TG18W臺式高速微量離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器公司;T100TM PCR儀 美國Bio-Rad公司;DYY-10C電泳儀 北京六一儀器廠;Microchemi 4.2凝膠成像

系統(tǒng) 以色列DNR公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

以所選秘魯莖柔魚和澳洲雙柔魚的冷凍樣品作為原料，剪取肌肉組織保存于95%乙醇中。取保存樣品肌肉組織30 mg左右，剪碎后置于已滅菌的研缽內(nèi)，混合液氮研磨至粉末狀，采用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，所得基因組DNA于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴(kuò)增與測序

對于所提取2 種柔魚基因組DNA片段，針對海洋動(dòng)物線粒體16S rRNA基因序列，使用16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[19]。用于擴(kuò)增線粒體16S rRNA基因的通用引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，序列分別為16SF：5-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3和16SR：5-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3。

PCR反應(yīng)總體系為20 μL：模板DNA 10 ng、2×Premix DNA polymerase 10 μL、正向及反向引物各2 μL（0.5 μmol/L），加滅菌雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，通過混有熒光染料溴化乙錠（ethidium bromide，EB）的1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，并將在凝膠成像系統(tǒng)觀測下條帶清晰、明亮且單一的產(chǎn)物送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司北京實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行正反雙向測序。

1.3.3 特異性引物設(shè)計(jì)

測序完成獲得原始序列數(shù)據(jù)后，將正向、反向引物數(shù)據(jù)導(dǎo)入SeqMan軟件，去除兩端不可信部分后進(jìn)行人工拼接，秘魯莖柔魚和澳洲雙柔魚得到長度分別約為552、553 bp的16S rRNA基因序列（Genbank登錄號分別為GU324169和GQ365324）。通過GenBank數(shù)據(jù)庫下載得相應(yīng)柔魚的線粒體16S rRNA基因序列，并在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Nucleotide Blast比對，根據(jù)序列相似度對樣品的物種進(jìn)行鑒別，再次確保所選樣品物種與標(biāo)簽一致。通過Clustal X軟件對測序結(jié)果進(jìn)行多序列對比和分析，并用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)秘魯莖柔魚和澳洲雙柔魚的品種特異性引物。

1.3.4 多重PCR鑒定

以秘魯莖柔魚和澳洲雙柔魚的雙位點(diǎn)特異性引物為正向引物，利用Primer Premier 5軟件篩選二者的反向引物。篩選反向引物時(shí)注意3 條引物的退火溫度保持接近，并避免模板錯(cuò)配及引物間二聚體的產(chǎn)生，確定利用16SR作為反向引物。利用3 條引物對2 種柔魚的模板DNA及混合樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。多重PCR反應(yīng)總體系為20 μL：模板DNA 10 ng、2×Premix DNA polymerase 10 μL、正向引物DGF 1 μL（0.5 μmol/L）、正向引物NGF 1 μL（0.5 μmol/L）、反向引物16SR 2 μL（0.5 μmol/L），加滅菌雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。多重PCR擴(kuò)增結(jié)束后，通過混有熒光染料EB的1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中對多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

1.3.5 靈敏度測定及市售樣品檢測

為測定該多重PCR體系的靈敏度，將DNA模板總量設(shè)置為10 ng，以2 種柔魚的混合樣品為模板，其中秘魯莖柔魚DNA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0%、1%、2%、10%及50%。同時(shí)分別對市售的2 種秘魯莖柔魚和2 種澳洲雙柔魚樣品進(jìn)行檢測，以驗(yàn)證本方法在實(shí)際中應(yīng)用的可行性。多重PCR反應(yīng)條件如1.3.4節(jié)所述。擴(kuò)增結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)中對多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA序列比對

通過線粒體16S rRNA通用引物擴(kuò)增出的秘魯莖柔魚和澳洲雙柔魚基因序列長度分別約為552、553 bp，并上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫。由圖1可知：對2 種柔魚品種的擴(kuò)增基因序列進(jìn)行比對后，第173和174號位秘魯莖柔魚顯示為T、C堿基，而澳洲雙柔魚則為C、T堿基，根據(jù)這2 個(gè)錯(cuò)配堿基設(shè)計(jì)秘魯莖柔魚的正向特異性引物DGF;第345、346、347號位秘魯莖柔魚顯示為A、A、T堿基，而澳洲雙柔魚則為G、G、C堿基，根據(jù)這3 個(gè)錯(cuò)配堿基設(shè)計(jì)澳洲雙柔魚的正向特異性引物NGF。

2.2 特異性引物設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)秘魯莖柔魚的SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)其正向特異性引物DGF（5-GAAGGTTAATCTGTCTCCATC-3），利用通用引物16SR作為反向引物;根據(jù)澳洲雙柔魚的SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)其正向特異性引物NGF（5-TATGATTAATAACTTCCTTAGGC-3），同樣利用通用引物16SR作為反向引物。2 種柔魚的品種特異性引物在16S rRNA基因序列中的相對位置如圖1所示。

2.3 多重PCR鑒定結(jié)果

以秘魯莖柔魚和澳洲雙柔魚的基因組DNA及混合樣品DNA作為模板，利用秘魯莖柔魚的特異性引物DGF、澳洲雙柔魚的特異性引物NGF及16SR 3 條引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。在凝膠成像系統(tǒng)中對多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

泳道M. 100 bp PlusII DNA Ladder;泳道1～2. 秘魯莖柔魚DNA;泳道3～5. 混合樣品（秘魯莖柔魚DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%）DNA;泳道6～7. 澳洲雙柔魚DNA。

由圖2可知，經(jīng)過多重PCR擴(kuò)增后，秘魯莖柔魚和澳洲雙柔魚DNA分別擴(kuò)增出各自的品種特異性條帶，同時(shí)，2 種柔魚的混合樣品DNA同時(shí)擴(kuò)增出2 種特異性條帶。將2 種條帶切膠回收后進(jìn)行克隆測序，測得2 種特異性條帶的序列及長度與圖1中2 種柔魚的序列完全一致，長度分別為400、229 bp。由此可見，2 種柔魚的特異性引物對相應(yīng)柔魚品種產(chǎn)生了絕對特異性。

對秘魯莖柔魚和澳洲雙柔魚的多個(gè)樣品進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)后，檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。表明利用秘魯莖柔魚和澳洲雙柔魚特異性引物所建立的多重PCR體系不僅可以有效鑒定2 個(gè)柔魚品種，也能對其混合樣品進(jìn)行快速、有效地區(qū)分與鑒定。

2.4 靈敏度測定結(jié)果

泳道M. 100 bp PlusII DNA Ladder;泳道1～5. 混合樣品DNA，其中秘魯莖柔魚DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0%、1%、2%、10%、50%;泳道6～7. 市售秘魯莖柔魚DNA;泳道8～9. 市售澳洲雙柔魚DNA。

由圖3可知，秘魯莖柔魚和澳洲雙柔魚的混合樣品均產(chǎn)生2 條特異性條帶，其中秘魯莖柔魚的特異性條帶長度為400 bp，澳洲雙柔魚的特異性條帶長度為229 bp，且隨著混合樣品中秘魯莖柔魚DNA含量的增加，秘魯莖柔魚的特異性條帶亮度也逐漸增強(qiáng)。表明該多重PCR體系可以檢測澳洲雙柔魚中1%秘魯莖柔魚的摻入，檢測限為0.1 ng。在市售的2 種秘魯莖柔魚和2 種澳洲雙柔魚樣品檢測中發(fā)現(xiàn)，1 種澳洲雙柔魚樣品存在摻入秘魯莖柔魚現(xiàn)象，而其他3 種柔魚樣品均可正確檢測其樣品來源。因此，本方法靈敏度高，可對市場上的柔魚原料來源進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。

3 結(jié) 論

通過16S rRNA基因序列確定的品種特異性引物建立多重PCR體系，一管多檢，有效減少了試劑消耗和操作時(shí)間。在秘魯莖柔魚、澳洲雙柔魚混合DNA樣品中，目標(biāo)DNA也能高效擴(kuò)增并且不受非目標(biāo)DNA的干擾，可以在同一個(gè)PCR反應(yīng)中同時(shí)對秘魯莖柔魚、澳洲雙柔魚的單獨(dú)樣品及混合樣品進(jìn)行有效區(qū)分和鑒定，大大提高了檢測效率，滿足了相關(guān)柔魚類品種的檢測需要。進(jìn)行多次重復(fù)性檢測后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好、準(zhǔn)確率高，方法具有操作簡單、檢測時(shí)間短、無污染、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)。

對于魚類水產(chǎn)品的物種鑒定，伴隨著當(dāng)今現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，基于DNA分子水平的鑒定方法愈發(fā)展現(xiàn)出巨大的潛力。常見的DNA分子標(biāo)記技術(shù)有簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）[20-21]、

限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）[22]、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）[23]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）[24]和DNA條形碼（DNA Barcoding）[25-27]等。其中，SSR分子標(biāo)記需經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳，且電泳條帶緊密，區(qū)分往往不太明顯;RFLP分子標(biāo)記作為最早的分子標(biāo)記技術(shù)，需用限制性內(nèi)切酶對DNA進(jìn)行消化，并使用放射性標(biāo)記探針，操作復(fù)雜繁瑣，且DNA消耗量大;AFLP分子標(biāo)記也需對DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶雙酶切處理，再進(jìn)行人工拼接，擴(kuò)增片段常需要經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染等手段進(jìn)行分離檢測，操作繁雜;RAPD分子標(biāo)記為顯性遺傳，存在共遷移問題，并且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差;DNA條形碼技術(shù)需要對每次PCR擴(kuò)增出的片段進(jìn)行測序處理，比較準(zhǔn)確，但也耗費(fèi)較多時(shí)間。相較于其他方法，本方法簡單高效，針對秘魯莖柔魚和澳洲雙柔魚的未知樣品，只需DNA提取、PCR擴(kuò)增和凝膠電泳3 步即可完成鑒定，鑒定成本較低且結(jié)果差異明顯。本方法從分子水平上對秘魯莖柔魚、澳洲雙柔魚的單獨(dú)樣品及其混合樣品進(jìn)行檢測，范圍更加廣泛，結(jié)果更加準(zhǔn)確，為我國柔魚品種真?zhèn)舞b別提供了新依據(jù)，起到規(guī)范市場和保護(hù)消費(fèi)者利益的作用，也為我國柔魚產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展和相關(guān)制度的實(shí)施提供了技術(shù)支持。

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