任孟珂，布冠好，左穎昕

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001）

蛋白質(zhì)是人體六大營養(yǎng)素之一，能夠為人體提供必需氨基酸，對于維持機體代謝、參與組織合成等也具有重要作用。大豆蛋白作為一種氨基酸組成合理、營養(yǎng)價值極高的蛋白質(zhì)，且賴氨酸的含量較高，是一種理想的植物蛋白資源[1]。另外大豆分離蛋白成本低并且有良好的功能特性，如溶解性，乳化性，凝膠性，起泡性等。這些良好功能性質(zhì)可以改善食品的風(fēng)味、顏色、質(zhì)地和儲存穩(wěn)定性[2]。但天然蛋白質(zhì)易受物理或化學(xué)因素的影響，在加工過程中，大豆分離蛋白的功能特性容易隨加工條件的改變而變化，影響其工業(yè)化生產(chǎn)效率和收益，不利于產(chǎn)品品質(zhì)及穩(wěn)定性，制約蛋白質(zhì)新產(chǎn)品的開發(fā)利用。為拓寬大豆蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用，國內(nèi)外許多學(xué)者對蛋白質(zhì)改性進行了多方面的研究，使其在食品行業(yè)的應(yīng)用中達到一種穩(wěn)定的狀態(tài)。目前蛋白質(zhì)改性的主要方法有：物理改性、化學(xué)改性及酶法改性等[3-6]。

糖基化改性，即通過美拉德反應(yīng)改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[7]。糖基化改性的傳統(tǒng)方法有干熱法和濕熱法兩種。經(jīng)過糖基化改性后，其產(chǎn)物同時具備蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)的性質(zhì)，可有效改善蛋白質(zhì)的溶解性和持水性[8]。葡聚糖為中性多糖，它的水溶性和穩(wěn)定性較好，此外葡聚糖還具有清除游離基，溶解膽固醇等功能作用[9]。如今消費者對于蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值也極為重視。除了蛋白質(zhì)含量、必需氨基酸模式等評價指標外，蛋白質(zhì)的消化率也是一項重要的評價指標。本文通過干熱法制備大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）-葡聚糖接枝產(chǎn)物，研究葡聚糖接枝對SPI 功能性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特性以及蛋白質(zhì)消化率的影響，以期改善大豆蛋白的功能特性，為之后大豆蛋白糖基化產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆分離蛋白（SPI，蛋白質(zhì)量分數(shù)為84.94%）：河南鯤華生物技術(shù)有限公司；葡聚糖（分子量10 000 kDa，分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-18 型冷凍干燥機：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；pH 211 酸度計：意大利 HANNA；DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；DYY-6D 型電泳設(shè)備：北京市六一儀器廠；WQF-510 型傅里葉紅外光譜：北京瑞麗分析儀器有限公司；SHZ-82 恒溫水浴振蕩器：常州博遠實驗分析儀器廠；GL-20L 型高速冷凍離心機：上海安亭科學(xué)儀器有限公司；FM200 型高速均質(zhì)機：上海弗魯克流體機械制造有限公司；BT-9300S 激光粒度分布儀：丹東百特儀器有限公司；F-7000 熒光分光光度計：日立高新技術(shù)公司；UV-1901型雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI-葡聚糖的制備

SPI-葡聚糖的制備同之前的研究方法一致[10]。將蛋白與糖按一定比例溶于蒸餾水中，磁力攪拌30 min，使用冷凍干燥機真空干燥。將凍干粉放入恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)，控制溫度50 ℃～60 ℃，相對濕度為79%（飽和KBr 溶液）。所得樣品與-20 ℃儲存。

1.3.2 接枝度的測定

參考 Pan 等[11]的方法，用鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）法測定游離氨基酸含量，制作賴氨酸標曲，并計算接枝程度。

1.3.3 褐變程度的測定

參考穆麗霞[12]的方法，在420 nm 下測定吸光值。

1.3.4 溶解性測定

蛋白質(zhì)濃度測定參照李江河[13]的方法，采用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量。SPI 以及SPI-葡聚糖的溶解性按公式（1）計算。

1.3.5 乳化性測定

參照左穎昕等[14]的葡萄糖接枝對大豆分離蛋白功能特性和結(jié)構(gòu)影響的研究方法測定乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

1.3.6 乳狀液粒徑測定

參照1.3.5 中的方法制備乳化液，通過激光粒度分布儀測定粒度分布。選用D10，D50，D90作為粒徑評價指標。儀器參數(shù)設(shè)置為：大豆油的折光率為1.456，分散相的折光率為1.33，乳液的相對折光率為1.095，用單蒸水作為分散相。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

采用Laemmli[15]的方法并稍作修改，接枝物質(zhì)量濃度為3 mg/mL，使用12%的分離膠和5%的濃縮膠，分別使用考馬斯亮藍R-250 和Schiff 堿試劑進行蛋白質(zhì)和糖蛋白染色（periodic acid-schiff stain，PAS）[16]。

1.3.8 傅里葉紅外光譜分析

準確稱取質(zhì)量比為1 ∶100 的糖基化樣品及干燥的溴化鉀，用傅里葉紅外光譜儀測定，波數(shù)范圍為4 000 cm-1～400 cm-1內(nèi)的吸收光譜，掃描 32 次，環(huán)境溫度25 ℃[17]。使用PeakFit4.12 分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.9 熒光光譜分析表面疏水性

將8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）作為熒光探針測定蛋白質(zhì)的表面疏水性，用0.01 mol/LpH7.0 磷酸鹽緩沖液作為溶劑，配制一定濃度的糖基化產(chǎn)物溶液，后稀釋至蛋白質(zhì)量濃度分別為0.02 mg/mL～0.14 mg/mL 之間的6 組樣品，取20 μL8.0 mmol/L ANS 溶液（用 0.01 mol/L pH7.0 磷酸鹽緩沖液完全溶解）與4 mL 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液混合后用熒光分光光度計測定樣品的熒光強度。儀器參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波長390 nm；散射波長470 nm。以熒光強度為縱坐標、蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標所作曲線的斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)[18]。

1.3.10 體外消化率的測定

大豆蛋白糖基化產(chǎn)物的體外消化率測定采用胃蛋白酶-胰蛋白酶體外消化模型。操作方法如下：

1）三氯乙酸-氮溶指數(shù)（trichloroacetic acid-nitro gensolutionindex，TCA-NSI）法[19]測定消化率。取 5mL 不同消化液于 5 mL10%TCA 中，4 000 r/min 離心 20 min，沉淀用10%TCA 洗滌2 次，離心得到TCA 不溶組分。TCA 不溶性氮含量采用凱氏定氮法GB5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》測定。TCA的作用是使大分子蛋白質(zhì)沉淀。

2）準確稱取一定質(zhì)量的糖基化復(fù)合物溶于蒸餾水，配制一定體積的底物濃度為50 g/L 的溶液，37 ℃水浴中預(yù)熱5 min，用1 mol/L 的HCl 調(diào)溶液pH 值至3.0。加入與底物質(zhì)量比為1 ∶100 的胃蛋白酶，在37 ℃恒溫振蕩器上反應(yīng)2 h，樣品煮沸滅酶后用TCA 法測消化率。

3）取2）中用胃蛋白酶消化2 h 后滅酶處理的蛋白樣品，用1 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)pH 值至7.0 終止酶解反應(yīng)，加入與底物質(zhì)量比為1 ∶100 的胰蛋白酶，在37 ℃恒溫振蕩器上反應(yīng)2 h，樣品煮沸滅酶后用TCA法測消化率。

4）將未發(fā)生糖基化反應(yīng)的大豆蛋白在相同條件下做同樣處理，探究糖基化改性作用對大豆蛋白消化率的影響。

5）TCA 沉淀法測定大豆蛋白-多糖復(fù)合物體外消化率的計算見公式（2）：

式中：N0、Nt分別為消化前、消化后樣品TCA 沉淀物中的氮含量，mg；NA為蛋白質(zhì)樣品中的總氮含量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI-葡聚糖接枝反應(yīng)程度的研究

不同反應(yīng)條件對糖基化復(fù)合物反應(yīng)程度的影響見圖1。

圖1 底物質(zhì)量比和反應(yīng)時間對復(fù)合物接枝度與褐變程度的影響Fig.1 Effect of substrate mass ratio and reaction time on grafting degree and browning degree of composite

從圖1（A）可以看出，在60 ℃及不同底物質(zhì)量比條件下，SPI-葡聚糖的接枝度隨反應(yīng)時間的增加而變化，尤其在0～3 d 內(nèi)迅速增加，3 d 后增長趨勢變緩。其中蛋白與糖底物質(zhì)量比為2 ∶1 的產(chǎn)物接枝度在3 d 后呈現(xiàn)繼續(xù)上升的穩(wěn)定趨勢，3 d 時達到66.52%，反應(yīng)終點7 d 達到78.42%。不同底物質(zhì)量比的SPI-葡聚糖隨反應(yīng)時間的褐變程度變化如圖1（B）所示，底物質(zhì)量比為2 ∶1 的反應(yīng)體系褐變程度較低，隨著反應(yīng)時間的增加，褐變程度變化趨勢平穩(wěn)。通過研究相同反應(yīng)溫度條件下，不同質(zhì)量底物比和反應(yīng)時間對SPI-葡聚糖糖基化反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)溫度60 ℃，蛋白與糖底物質(zhì)量比為2 ∶1 的反應(yīng)條件下，其糖基化接枝度較高，而褐變較低。因此，選擇此條件下的大豆分離蛋白糖基化產(chǎn)物進行下一步研究。

2.2 SPI-葡聚糖接枝物功能特性的研究

2.2.1 SPI-葡聚糖接枝產(chǎn)物的溶解性

2.2.1.1 反應(yīng)時間對糖基化產(chǎn)物溶解性的影響

未改性的SPI 和不同反應(yīng)時間得到的SPI-葡聚糖接枝物的溶解度見圖2。

圖2 不同反應(yīng)時間下SPI-葡聚糖接枝產(chǎn)物的溶解性Fig.2 Solubility of SPI-glucan grafted product at different reaction times

由圖2 可知，SPI 的溶解度在未改性時為17.28%。隨著反應(yīng)時間增加，SPI 的溶解性有顯著變化，在4 d時達到最大值，與空白組相比，溶解性提高了72.72%。其原因可能是由于引入了羥基等親水基團，因此溶解性提高，這與王一熹[20]的研究結(jié)果基本一致。

2.2.1.2 pH 值對糖基化產(chǎn)物溶解性的影響

根據(jù)2.2.1.1 中糖基化修飾對SPI 溶解性的改善效果，選擇以下效果較好的樣品：反應(yīng)2、3、4 d 的SPI-葡聚糖樣品，分別研究不同pH 值對SPI-葡聚糖溶解性的影響，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 不同pH 值對SPI-葡聚糖復(fù)合物溶解性的影響Fig.3 Effect of different pH values on the solubility of SPI-glucan complex

由圖3 可知，未改性 SPI 在等電點 pI4～5 附近，溶解度明顯下降，當pH 值遠離pI 時，溶解度有所提高。此外，圖3 也表明了糖基化產(chǎn)物在堿性環(huán)境下溶解度高，隨著pH 值降低溶解度逐漸減小。SPI 與葡聚糖經(jīng)糖基化修飾2 d 和3 d 后的產(chǎn)物在各pH 值條件下的溶解度均高于未改性SPI，且等電點處的溶解度有明顯改善，證明了糖鏈的引入對SPI 的溶解性有積極作用。與對照SPI 相比，SPI-葡聚糖復(fù)合物的溶解度隨pH 值降低的變化趨勢要相對平緩，說明糖基化反應(yīng)提高了SPI 的抗酸能力，這與賴穎等[21]的研究結(jié)果相符。

2.2.2 SPI-葡聚糖接枝產(chǎn)物的乳化性

2.2.2.1 糖基化修飾對大豆蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

SPI 和不同反應(yīng)時間的SPI-葡聚糖接枝產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性見圖4。

圖4 不同反應(yīng)時間下SPI-葡聚糖的乳化活性和乳化穩(wěn)定性Fig.4 Emulsification activity and emulsion stability of SPI-glucan under different reaction times

如圖4（A）所示，與對照組相比，SPI-葡聚糖的乳化活性隨著反應(yīng)時間呈現(xiàn)先增加后降低直至穩(wěn)定的趨勢；SPI-葡聚糖的乳化活性4 d 達到最大值198.12 m2/g，與空白SPI 相比，乳化活性提高了117.53%。分析圖4（B）可知，SPI-葡聚糖的乳化穩(wěn)定性先增加后減小，3 d 時達到最大值215.90 min，相比空白對照，乳化穩(wěn)定性提高了134.20%，表明葡聚糖接枝對大豆分離蛋白乳化性有明顯改善。原因可能是增大了吸附在油-水界面處油滴上的蛋白質(zhì)與糖鏈結(jié)合形成的保護層厚度，使油滴更不易聚集，因此葡聚糖對大豆蛋白的乳化性質(zhì)有改善效果[22]。

2.2.2.2 糖基化修飾對大豆蛋白乳化液粒徑的影響

表1 為SPI 糖基化產(chǎn)物乳化液的粒度分布。

分析表1 發(fā)現(xiàn)，與空白對照相比，SPI 糖基化產(chǎn)物乳化液的D10、D50和D90均有所減小，說明糖基化產(chǎn)物在水溶分散系中均勻分布，有利于蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)[23]。結(jié)合圖4 可以看出，乳化液粒徑減小的趨勢和其乳化性提高趨勢呈現(xiàn)負相關(guān)的聯(lián)系。粒徑越小，相對應(yīng)的乳化性質(zhì)越好。這一結(jié)果與Yang 等[24]的研究結(jié)果相符。粒徑的結(jié)果也表明了糖基化修飾可以改善大豆蛋白的乳化性質(zhì)，其原因可能是引入蛋白質(zhì)肽鏈上的糖基提供的空間位阻可有效阻止油滴的聚合[25]。

表1 大豆分離蛋白及其糖基化產(chǎn)物乳化液的粒度分布Table 1 Particle size distribution of soy protein isolate and its glycosylation product emulsion

2.3 SPI-葡聚糖接枝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特性研究

2.3.1 SDS-PAGE 分析接枝產(chǎn)物分子量變化

不同反應(yīng)時間得到的SPI-葡聚糖接枝產(chǎn)物的電泳圖譜如圖5 所示。

圖5 不同反應(yīng)時間下糖基化產(chǎn)物的電泳圖Fig.5 Electropherogram of glycosylated products at different reaction times

圖5（A）為考馬斯亮藍染色，圖5（B）為糖蛋白染色（Schiff 試劑）。由圖 5（A）可知，與未改性的 SPI 相比，在反應(yīng)初期（0～3 d），隨著反應(yīng)時間的延長，糖基化產(chǎn)物的各亞基條帶逐漸減弱；反應(yīng)4 d 之后蛋白質(zhì)與葡聚糖結(jié)合明顯，有相對分子量大的復(fù)合物生成，且濃縮膠與分離膠區(qū)域出現(xiàn)較多高分子量物質(zhì)，這與接枝度測定的結(jié)果相符。觀察圖5（B）可知，隨著時間的延長，在高分子量區(qū)域顏色變深，這說明有大分子物質(zhì)在此處聚集，即SPI 與葡聚糖分子之間產(chǎn)生共價結(jié)合，生成了相對分子量較大的物質(zhì)。證明了SPI 與葡聚糖發(fā)生了糖基化反應(yīng)。

2.3.2 傅里葉紅外光譜分析接枝產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)變化

圖6 為大豆蛋白及其糖基化復(fù)合物的紅外圖譜。與未改性SPI 相比，糖基化產(chǎn)物在3 200 cm-1～3 700 cm-1范圍內(nèi)吸收峰變寬，證明了SPI 與葡聚糖共價結(jié)合之后，復(fù)合物的羥基數(shù)量增加，引起了C-OH 的伸縮振動[17]；糖基化產(chǎn)物在 1 000 cm-1～1 260 cm-1，1 350 cm-1～1 500 cm-1的吸收峰的強度增加，說明了糖基化反應(yīng)的發(fā)生引起了C-N、C-H 和C=O 鍵的伸縮振動的增加[26]，這與 Mohsin 等[27]和 Fu 等[28]研究結(jié)果基本一致。

圖6 SPI 及SPI-葡聚糖接枝產(chǎn)物的紅外掃描圖譜Fig.6 Infrared scanning spectrum of SPI and SPI-glucan graft products

蛋白質(zhì)特征吸收譜帶中的酰胺Ⅰ帶（1 600 cm-1～1 700 cm-1）可以反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化，參考Chen 等[29]的研究，α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲產(chǎn)生伸縮振動的吸收峰選取范圍分別為1 650 cm-1～1 660 cm-1、1 610 cm-1～1 640 cm-1、1 660 cm-1～1 700 cm-1、1 640 cm-1～1 650 cm-1。利用 PeakFit 4.12 軟件進行去卷積二階導(dǎo)數(shù)擬合計算分析SPI-葡聚糖復(fù)合物二級結(jié)構(gòu)含量的變化如表2 所示。

由表2 可知，與對照SPI 相比，糖基化改性后，大豆蛋白的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量減少，而β-折疊和無序結(jié)構(gòu)的含量增加，說明糖基化反應(yīng)對大豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)有顯著影響。原因可能是糖鏈的引入使蛋白質(zhì)肽鏈展開，內(nèi)部基團暴露，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象發(fā)生改變。此外反應(yīng)后蛋白質(zhì)的構(gòu)象逐漸由有序轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序，蛋白質(zhì)分子伸展，產(chǎn)物的柔韌性增加，構(gòu)象穩(wěn)定性有所下降，進而改善了接枝產(chǎn)物的功能特性，這與穆利霞[12]的研究結(jié)果相符。

表2 大豆蛋白二級結(jié)構(gòu)含量變化Table 2 Changes in the secondary structure content of soybean protein

2.3.3 糖基化產(chǎn)物的表面疏水性

大豆蛋白糖基化產(chǎn)物的表面疏水性結(jié)果如表3所示。

表3 大豆蛋白及其糖基化產(chǎn)物的表面疏水性Table 3 Surface hydrophobicity of soy protein and its glycosylation products

從表3 中可以看出隨著糖基化反應(yīng)的進行，產(chǎn)物的表面疏水性呈現(xiàn)先顯著降低后緩慢增加的趨勢，原因可能是：ANS 探針與蛋白質(zhì)的疏水基團特異性結(jié)合，隨著糖基化反應(yīng)的進行，大豆蛋白部分結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部疏水基團暴露，然而糖基化產(chǎn)物實際測定的表面疏水性是降低的，這說明蛋白質(zhì)與糖共價結(jié)合，引入親水基團如羥基等，使產(chǎn)物表面親水性增強，疏水性降低；同時由于糖基接入產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)使分子內(nèi)部的疏水基團不能完全暴露，也對表面疏水性起到一定降低作用。反應(yīng)后期表面疏水性逐漸增加的原因可能是隨著反應(yīng)時間的延長，分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)逐漸展開，更多疏水基團暴露出來，而接枝度變化已趨于穩(wěn)定，空間位阻效應(yīng)減弱，導(dǎo)致產(chǎn)物表面疏水性略有增加。進一步分析發(fā)現(xiàn)，糖基化產(chǎn)物表面疏水性的變化與2.2.1.1 中產(chǎn)物溶解度變化呈現(xiàn)負相關(guān)的趨勢，這一點與劉春雷等[30]的結(jié)論一致。

2.4 大豆分離蛋白-葡聚糖的體外消化性研究

圖7 表示SPI 及不同反應(yīng)時間的大豆分離蛋白-葡聚糖復(fù)合物的體外消化性。

圖7 SPI 及不同反應(yīng)時間的SPI-葡聚糖復(fù)合物的體外消化性Fig.7 In vitro digestibility of SPI and SPI-glucan complexes with different reaction times

分析可知，在模擬胃腸道消化過程中，SPI-D 的體外消化率隨著糖基化反應(yīng)時間的變化呈現(xiàn)波動的趨勢。大豆分離蛋白-葡聚糖在反應(yīng)后期6、7 d 時胃消化率稍低于未改性的SPI，其它反應(yīng)時間點的大豆分離蛋白-葡聚糖胃消化率有一定增加。大豆分離蛋白-葡聚糖在反應(yīng)時間3、4 d 時胰消化率稍低于未改性的SPI，其它反應(yīng)時間點的胰消化率有一定增加。說明葡聚糖糖基化修飾對大豆分離蛋白體外消化率的影響不顯著。原因可能是葡聚糖作為一種多糖，引入到蛋白分子上的糖鏈分子量大，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，降低了消化酶的酶解位點的暴露，從而影響了大豆分離蛋白-葡聚糖的消化率。因此，葡聚糖糖基化修飾對SPI 體外消化率沒有明顯改善作用。

3 結(jié)論

本研究以大豆分離蛋白和葡聚糖為原料，通過干熱法進行糖基化反應(yīng)。結(jié)果表明，反應(yīng)溫度60 ℃，蛋白與糖底物質(zhì)量比為2 ∶1，糖接枝產(chǎn)物的接枝效果好，褐變程度中等。在SPI-D 反應(yīng)4 d 后，溶解性提高了72.72%；SPI-D 反應(yīng)3 d 后，乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別提高了117.53%和134.20%；說明糖基化可以顯著改善大豆分離蛋白的功能特性。SDS-PAGE 結(jié)果表明，隨著時間的延長，在高分子量區(qū)域條帶顏色變深，這說明有大分子物質(zhì)在此處聚集，證明了大豆分離蛋白與葡聚糖發(fā)生了共價結(jié)合。通過紅外光譜分析與對照SPI相比，糖基化改性后，大豆蛋白的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量減少，而β-折疊和無序結(jié)構(gòu)的含量增加，說明糖基化反應(yīng)對大豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)有顯著影響。熒光光譜分析表明，產(chǎn)物的表面疏水性呈現(xiàn)先顯著降低后緩慢增加的趨勢。此外，葡聚糖糖基化修飾對SPI 體外消化性的改善效果不明顯。該研究為拓寬大豆蛋白的應(yīng)用范圍及開發(fā)大豆蛋白新制品提供重要的理論依據(jù)。