靳 妲 馬微微

（1 東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室 哈爾濱150030 2 黑龍江中醫(yī)藥大學 哈爾濱150040）

他汀類藥物是臨床上常用的改善高膽固醇血癥的藥物，然而長期服用他汀類藥物可能造成肌肉疼痛、疲勞，還可能提高糖尿病的風險[3-4]，因此益生菌療法走進人們的視野。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織將益生菌定義為“當達到一定數(shù)量時，對宿主有益的活性微生物”[5]。乳酸菌在人類腸道系統(tǒng)中的代謝和功能性質(zhì)對人類的健康有很大的益處。有很多研究證明益生菌具有降膽固醇的作用。2009年，Jungae Jeun 等[6]在基因水平上證明了植物乳桿菌具有明顯的降膽固醇功效。2016年，Damodharan K 等[7]用瑞士乳桿菌發(fā)酵酸乳，在體內(nèi)和基因水平上證實乳桿菌的降膽固醇作用。

植物乳桿菌KLDS1.0386 分離自中國內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，有研究證明KLDS1.0386 具有體外降膽固醇能力、良好的胃腸拮抗性和粘附性[8-9]。本試驗通過建立C57BL/6 小鼠高膽固醇模型研究此菌株的降膽固醇能力，利用蛋白免疫印記法測定其對小鼠肝臟膽固醇調(diào)節(jié)的幾個關(guān)鍵基因表達的影響，為開發(fā)具有降膽固醇功能的益生菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

總膽固醇檢測試劑盒、甘油三酯檢測試劑盒、高密度脂蛋白檢測試劑盒、低密度脂蛋白檢測試劑盒，上?？迫A生物工程股份有限公司；CYP7A1一抗、LDLR 一抗、FXR 一抗、SREBP2 一抗，Santa Cruz；HMGCR 一抗，Abcam；β-actin 一抗，北京博奧森；普伐他汀鈉片，第一三共制藥有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 設備與儀器

BCN1360 型生物潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器公司；DHP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；全自動高壓滅菌鍋HVE-50，HIRAYAMA 公司；超低溫冰箱，SANYO 轉(zhuǎn)移脫色搖床，海門其林貝爾儀器制造有限公司；低溫離心機，Eppendorf 公 司；UVP 凝 膠 成 像 系 統(tǒng)，Thermo公司；電泳儀，北京六一；半干轉(zhuǎn)膜儀，ATTO 公司；紫外-可見分光光度計，MILTON ROY COMPANY公司；超純水儀，北京康銘泰克科技發(fā)展有限公司；美國UVP 分析儀。

1.3 乳酸菌與培養(yǎng)基

植物乳桿菌KLDS1.0386（Lactobacillus plantarum）由東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室提供。供試菌株在試驗前需進行復蘇與純化，經(jīng)MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，連續(xù)傳代3 次以恢復菌種活力用于后續(xù)試驗。

MRS 培養(yǎng)基：蛋白胨 5.0 g，牛肉膏5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1.0 g，酵母粉5.0 g，硫酸錳0.25 g，硫酸鎂0.58 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，用蒸餾水溶解后定容至1 L，在121 ℃條件下高壓滅菌15 min。

1.4 試驗方法

1.4.1 小鼠的分組與飼養(yǎng) 6 周齡C57BL/6 雄性小鼠購買自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，將40 只小鼠按平均體質(zhì)量無顯著差異隨機分成5 組，每組8 只：空白組、高膽固醇模型組、KLDS1.0386 低劑量組、KLDS1.0386 高劑量組、普伐他汀對照組（見表1）?？瞻捉M小鼠喂普通基礎飼料，其它4 組小鼠喂高膽固醇飼料，培養(yǎng)30 d，建立高膽固醇模型小鼠。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度45%～50%，自由采食與飲水，12 h 光-暗循環(huán)。

供試樣品通過灌胃的方式給予小鼠，將活化好的植物乳桿菌KLDS1.0386 按2%的接種量接種到MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，經(jīng)3 000 r/min 離心10 min 獲得培養(yǎng)菌株，用無菌生理鹽水洗滌2 次，最后用無菌生理鹽水重懸調(diào)至109，1010CFU/mL，分別作為低劑量組和高劑量組[6]。普伐他汀按小鼠3 mg/kg 體重劑量給藥[10]?？瞻捉M和高膽固醇模型組以無菌生理鹽水代替。各組按照每只小鼠1 mL/100 g 體重的劑量灌胃，每日灌胃1 次，連續(xù)灌胃4 周。

激光剝蝕技術(shù)(LA)作為一種應用于大部分固體樣品的引入方法，與干擾少、靈敏度高的電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)聯(lián)用，可以避免溶液制備中的稀釋效應，對降低方法檢出限更為有利。該技術(shù)僅僅需要極少的樣品消耗量，可以實現(xiàn)微區(qū)分析和微損分析[1-9]。Christopher L[1]等人用此項技術(shù)成功地分析了鎂合金表面元素的分布。本文以63Cu的強度穩(wěn)定且達到最大值為考察依據(jù)，對激光剝蝕的實驗條件進行優(yōu)化，確定了最佳儀器參數(shù)，并通過計算各雜質(zhì)元素的相對靈敏度因子(RSF)[10]，最終實現(xiàn)了LA-ICP-MS內(nèi)標定量法對純銅中Fe、Zn、As、Sn、Sb、Pb、Bi共7種痕量元素的測定。

高膽固醇根據(jù)文獻[11]改良后自行配制，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司制造。

基礎飼料配方：面粉20%，麩皮25%，玉米20%，米粉10%，豆料20%，魚粉2%，骨粉2%，食鹽0.9%，維生素0.1%。

高膽固醇飼料：膽固醇3%，膽鹽0.3%，豬油10%，蛋黃粉5%，基礎飼料81.7%。

表1 各組別小鼠飲食情況對照表Table 1 The diet compositions for mice of the different groups

1.4.2 血液采集與血脂檢測 小鼠灌胃第28 天取血，小鼠采血前禁食12 h。采取毛細玻璃管眼眶后靜脈叢取血方法，室溫放置1 h。4 000 r/min 離心5 min，收集血清，采用酶法檢測試劑盒利用全自動生化分析儀分別檢測小鼠血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇濃度。

1.4.3 Western-blotting 檢測 小鼠灌胃第28 天進行解剖取肝臟，肝臟取出后裝進無菌凍存管中，迅速放入液氮中防止蛋白降解。選取5 種肝臟膽固醇代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因作為檢測對象，即HMGCR、CYP7A1、LDLR、FXR 和SREBP2。送樣至成都楊克斯生物技術(shù)有限公司進行Western-blotting 試驗，分析供試菌株對肝臟膽固醇代謝的影響。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差來表示，采用SPSS 20.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，應用單因素方差分析進行多組數(shù)據(jù)之間的比較，P＜0.05為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 血脂分析

小鼠血清膽固醇水平變化直接反應供試菌株的體內(nèi)降膽固醇效果，分別檢測了不同飲食處理組小鼠血清甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白濃度，結(jié)果如表2所示。

本試驗通過采食高膽固醇飼料，30 d 后成功構(gòu)建出高膽固醇小鼠模型。通過灌胃植物乳桿菌KLDS1.0386，28 d 后，在血清甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白水平上，與高膽固醇對照組相比，灌胃KLDS1.0386 低劑量組和高劑量組均有所下降，尤其是高劑量組，與高膽固醇對照組相比均屬于明顯差異（P＜0.05），分別下降了23.61%，16.97%和31.11%，高密度脂蛋白水平變化不顯著（P＞0.05），這與已報道的結(jié)果類似。Jungae Jeun 等[6]以C57BL/6 小鼠為模型，每天灌胃濃度為109CFU/mL 活性的植物乳桿菌和1010CFU/mL 失活的植物乳桿菌，維持4 周，結(jié)果顯示，與對照組相比，小鼠血清低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯水平顯著下降42%和32%。丁盼盼等[12]采用一株從羊糞中提取的植物乳桿菌灌胃小鼠，為期30 d，結(jié)果顯示，與對照組相比，小鼠血清膽固醇、甘油三酯水平分別下降了31.3%和20.44%。

表2 不同飲食處理小鼠血清膽固醇水平Table 2 The cholesterol levels in the serum of mice fed a different diet

2.2 Western-blotting 檢測

Western-blotting 檢測菌株KLDS1.0386 對高膽固醇模型C57BL/6 小鼠肝臟膽固醇相關(guān)代謝基因在蛋白水平表達的影響，如圖1所示。

圖1 不同飲食處理小鼠肝臟相關(guān)蛋白表達的免疫印跡分析Fig.1 Western blot of protein expression in the liver of mice fed a different diet

2.2.1 HMGCR 蛋白表達量水平分析 HMGCR是肝臟膽固醇合成的限速酶，降低HMGCR 的表達可以抑制體內(nèi)膽固醇水平[13]，研究顯示，高脂飲食對HMGCR 的表達具有抑制作用，這可能是由于體內(nèi)膽固醇水平上升過快，而對HMGCR 導致的負反饋調(diào)節(jié)作用，以防止更多的膽固醇合成。如圖2所示，與單純的進食高膽固醇飼料相比，劑量組小鼠HMGCR 蛋白表達量要更低一些，尤其是高劑量組，明顯低于模型組，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這說明植物乳桿菌KLDS1.0386 可以通過抑制HMGCR 的表達來降低體內(nèi)膽固醇水平。

2.2.2 SREBP2 蛋白表達量水平分析 SREBP2是SREBPs 家族的成員之一，主要用于膽固醇合成的調(diào)節(jié)，是HMGCR 和LDLR 的上游基因[14]，可促進其表達。如圖3所示，與模型組相比，高低劑量組表達并沒有明顯差異，而Kim 等[15]采用大鼠動物模型，灌胃植物乳桿菌發(fā)酵豆乳，結(jié)果顯示與對照組相比，灌胃豆乳的大鼠的SREBP2 蛋白表達量明顯下降，這與本試驗結(jié)果不符，可能是由于菌種特異性的緣故，KLDS1.0386 可能通過其它途徑去調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇水平。

圖2 不用飲食處理小鼠肝臟HMGCR 蛋白表達的免疫印跡分析Fig.2 Western blot of HMGCR protein expression in the liver of rats fed a different diet

2.2.3 LDLR 蛋白表達量水平分析 LDLR 是一種細胞表面糖蛋白，大多存在于組織細胞中，其可以將血液中的低密度脂蛋白膽固醇吞進肝細胞中來保持膽固醇平衡，過度的膽固醇則可能抑制LDLR 的表達，而有些降脂藥就是通過升高LDLR的表達來完成其作用機制[16]。如圖4所示，與模型組相比，高低劑量組小鼠LDLR 表達量有所上升，但差異不顯著，這可能與KLDS1.0386 對SREBP2的作用不顯著有關(guān)，普伐他汀組與其它4 組相比表達量明顯增加，由此說明，KLDS1.0386 并不是通過調(diào)節(jié)LDLR 的表達降低膽固醇水平。

圖3 不用飲食處理小鼠肝臟SREBP2 蛋白表達的免疫印跡分析Fig.3 Western blot of SREBP2 protein expression in the liver of rats fed a different diet

2.2.4 CYP7A1 蛋白表達量水平分析 CYP7A1是膽固醇代謝經(jīng)典途徑中的限速酶，其催化膽固醇合成7α-膽固醇，經(jīng)過一系列酶反應形成膽汁酸，研究顯示，CYP7A1 的表達受到抑制會導致膽汁酸合成的下降，從而升高體內(nèi)膽固醇水平，而食物中的膽固醇和內(nèi)源性膽固醇都可以提高CYP7A1 的表達[17]。如圖5所示，與單純進食高膽固醇飼料相比，灌胃益生菌的兩組小鼠CYP7A1的表達量有所升高，尤其是高劑量組，與模型組形成顯著差異 （P＜0.05），這說明KLDS1.0386 升高CYP7A1 的表達量，加速了肝臟中膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)移，反饋降低體內(nèi)膽固醇水平。

2.2.5 FXR 蛋白表達量水平分析 FXR 是CYP7A1 的上游基因，F(xiàn)XR 的表達量上升會導致FXR 與膽汁酸結(jié)合形成膽汁酸-FXR 復合物，此復合物可以反過來與CYP7A 基因結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄，CYP7A 基因負責限速酶CYP7A1 的轉(zhuǎn)錄，從而CYP7A1 轉(zhuǎn)錄也被抑制，導致膽固醇合成膽汁酸減少，體內(nèi)膽固醇水平上升[18]。如圖6所示，灌胃KLDS1.0386 后，F(xiàn)XR 的表達量出現(xiàn)下調(diào)，尤其是高劑量組，與模型組形成顯著差異 （P＜0.05），而KLDS1.0386 具有膽鹽水解酶活性[8]，由此可推測，CYP7A1 表達量的升高可能是由于FXR 表達的抑制導致的，而FXR 表達量的抑制可能是由于KLDS1.0386 產(chǎn)生的膽鹽水解酶使體內(nèi)產(chǎn)生更多游離型膽汁酸，而非游離型膽汁酸減少的緣故。

圖5 不用飲食處理小鼠肝臟CYP7A1 蛋白表達的免疫印跡分析Fig.5 Western blot of CYP7A1 protein expression in the liver of rats fed a different diet

圖6 不用飲食處理小鼠肝臟FXR 蛋白表達的免疫印跡分析Fig.6 Western blot of FXR protein expression in the liver of rats fed a different diet

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明植物乳桿菌KLDS1.0386 通過抑制小鼠肝臟HMGCR 蛋白表達與通過下調(diào)小鼠肝臟FXR 蛋白的表達激活CYP7A1 的表達，調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇水平，為開發(fā)具有降膽固醇特性的益生菌提供了理論基礎，為生產(chǎn)降膽固醇發(fā)酵乳制品提供了理論依據(jù)。