陶鳳華 蔣婷 向威

骨關(guān)節(jié)炎是一類因軟骨損傷退變引起的關(guān)節(jié)疾病，常伴有軟骨基質(zhì)的分解代謝增強(qiáng)和不恰當(dāng)?shù)膿p傷修復(fù)，其病理表現(xiàn)主要為進(jìn)行性的軟骨丟失，軟骨下骨硬化和骨贅形成，能引起受累關(guān)節(jié)的疼痛和功能障礙，影響病人生活質(zhì)量［1］。目前，藥物治療雖然能夠緩解骨關(guān)節(jié)炎引起的疼痛癥狀，但卻不能阻斷其疾病進(jìn)程。而改善疾病的骨關(guān)節(jié)炎藥物（disease?modifying osteoarthritis drugs, DMOADs）能夠通過抑制軟骨的分解代謝，同時促進(jìn)合成代謝來阻斷軟骨組織的退變并且促進(jìn)其再生，不僅能緩解疼痛癥狀，還能促進(jìn)軟骨結(jié)構(gòu)改善和功能恢復(fù)，具有重要的研究意義［2］。

成纖維細(xì)胞生長因子18（fibroblast growth factor 18,FGF18）是成纖維細(xì)胞生長因子家族中的一類亞型，在調(diào)控骨骼系統(tǒng)的發(fā)育過程中扮演著非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF18 能夠維持軟骨細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)穩(wěn)定，減少因軟骨損傷導(dǎo)致的軟骨厚度和體積的丟失，并且促進(jìn)軟骨損傷的愈合及再生軟骨的整合［3，4］。FGF18 主要通過與成纖維細(xì)胞生長因子受體3（FGFR3）結(jié)合參與FGF 信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)來發(fā)揮其生長發(fā)育調(diào)控作用［5］。與其他DMOADs 相比，F(xiàn)GF18對軟骨細(xì)胞的促合成代謝作用伴有較少的副反應(yīng)，如較少引起骨贅形成、軟骨鈣化和炎癥等［6］。目前FGF18 在臨床應(yīng)用的價值不斷得到重視，但是其改善骨關(guān)節(jié)炎的潛在機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

初級纖毛作為凸出于細(xì)胞表面的“天線”樣結(jié)構(gòu)，是一類具有特殊功能的細(xì)胞器，能夠參與感受細(xì)胞微環(huán)境中的理化刺激并介導(dǎo)多種信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，其組裝聚合過程還與細(xì)胞周期相關(guān)，參與細(xì)胞的生長發(fā)育調(diào)控［7］。前期研究發(fā)現(xiàn)，初級纖毛能夠作為調(diào)節(jié)生長板功能和骨骼系統(tǒng)發(fā)育重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)樞紐［8］。同時，初級纖毛參與細(xì)胞新陳代謝，與代謝相關(guān)的細(xì)胞自噬具有明顯的關(guān)聯(lián)性［9］。并且初級纖毛結(jié)構(gòu)和功能的完整性還能夠影響力學(xué)刺激對軟骨細(xì)胞生長發(fā)育的調(diào)控［10］。

本研究探究了不同濃度的FGF18 對軟骨細(xì)胞增殖和分化的影響，通過使用水合氯醛調(diào)控初級纖毛結(jié)構(gòu)，再結(jié)合FGF18 干預(yù)，探索FGF18 在不同纖毛表達(dá)條件下對軟骨細(xì)胞生長發(fā)育的影響，旨在闡明初級纖毛在FGF 18 調(diào)控軟骨細(xì)胞發(fā)育中的作用及機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料與儀器

SD 大鼠乳鼠購自武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心，水合氯醛購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，胎牛血清購自美國Gibco Life Technologies 公司，小鼠源acetylated?α?tubulin 抗體購自美國Sigma 公司，DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基、小鼠源GAPDH 抗體、兔源CyclinD1 抗體、CY?3 標(biāo)記的熒光二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、Western blot凝膠配制試劑盒、ECL顯色液、甲苯胺藍(lán)染液、CCK8等均購自武漢博士德公司，兔源COL Ⅱ抗體購自英國Abcam 公司，兔源ERK 和P?ERK 抗體購自美國CST 公司，Live/dead 試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Green DNA 聚合酶均購自日本Toyobo 公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購自中國香港Heal Force公司，熒光顯微鏡為美國賽默飛公司的EVOS FL Auto全自動細(xì)胞成像系統(tǒng)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）細(xì)胞培養(yǎng)

取新生3 d 的SD 大鼠乳鼠，處死后分離膝關(guān)節(jié)軟骨，剪碎成1 mm3大小軟骨塊，加入胰酶，37 ℃消化30 min，離心后棄上清，加入Ⅱ型膠原酶37 ℃消化6 h后將細(xì)胞懸液離心棄上清，培養(yǎng)基重懸后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

（二）CCK8實(shí)驗(yàn)

胰酶消化軟骨細(xì)胞，96孔板中每孔加入約2 000個細(xì)胞，設(shè)置5 個不同濃度的FGF18 組（0 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml），依次加入相應(yīng)濃度FGF18 重組細(xì)胞因子，分別干預(yù)細(xì)胞48 h 和72 h。檢測時每孔更換成100 μl新鮮培養(yǎng)基并加入10 μl CCK8 溶液，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育90 min 后于450 nm波長下檢測吸光度值（OD值）。

（三）免疫熒光染色

將不同濃度的FGF18 干預(yù)軟骨細(xì)胞48 h 后棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定15 min 后加入0.1%濃度TritonX?100破膜，10 min后加入5%的牛血清白蛋白室溫封閉1 h。加入以1∶300稀釋的小鼠源acetylat?ed?α?tubulin抗體，4 ℃孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液洗滌3 遍后加入熒光二抗，室溫孵育1 h，隨后加入4，6-二氨基-2-苯基吲哚（4,6?diamino?2?phenylindole,DAPI），室溫下避光孵育10 min 后于熒光顯微鏡下觀察。

根據(jù)不同濃度的FGF18 干預(yù)軟骨細(xì)胞后CCK8和免疫熒光染色結(jié)果，選取最佳濃度設(shè)置為FGF18組，另外設(shè)置對照組、水合氯醛組（40 μmol/L）、水合氯醛+FGF18組，均在干預(yù)軟骨細(xì)胞48 h和72 h后進(jìn)行CCK8 實(shí)驗(yàn)，干預(yù)軟骨細(xì)胞48 h 后進(jìn)行免疫熒光染色，實(shí)驗(yàn)步驟同上。

（四）甲苯胺藍(lán)染色

將上述不同分組的藥物干預(yù)軟骨細(xì)胞72 h后棄培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定15 min，再加入甲苯胺藍(lán)染液室溫孵育15 min，棄染液后用磷酸鹽緩沖液洗滌3遍，用相機(jī)拍照觀察細(xì)胞染色情況。

（五）Live/dead實(shí)驗(yàn)

在10 ml磷酸鹽緩沖液中加入20 μl 2 mmol/L的EthD?1 儲備溶液，震蕩混勻后再加入5 μl 4 mmol/L的鈣黃綠素AM 儲備液，震蕩混勻后得到濃度為2 μmol/L 鈣黃綠素AM 和4 μmol/L EthD?1 的工作液。軟骨細(xì)胞經(jīng)不同分組藥物干預(yù)48 h 后棄培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液洗滌3遍后加入工作液，37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育5 min，熒光顯微鏡下拍照觀察。

（六）Western blot實(shí)驗(yàn)

軟骨細(xì)胞經(jīng)不同分組的藥物干預(yù)48 h后提取總蛋白，取20 μg總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后，用5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，分別加入CyclinD1（1∶200）、COL Ⅱ（1∶1 000）、ERK（1∶1 000）、P?ERK（1∶1 000）、GAP?DH（1∶300）一抗，4 ℃孵育過夜后用三乙醇胺緩沖鹽+Tween 20 溶液（tris?buffered saline and tween 20,TBST）洗滌3遍，再在室溫下孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔及羊抗鼠二抗（1∶5 000）1 h，TBST 洗滌后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiliuminescent,ECL）顯色系統(tǒng)檢測。

（七）RT?PCR實(shí)驗(yàn)

軟骨細(xì)胞經(jīng)不同分組藥物干預(yù)48 h后，用Trizol法提取總RNA，根據(jù)試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在八聯(lián)管中配制20 μl 的反應(yīng)體系進(jìn)行RT?PCR，其中包括1 μl cDNA、1 μl 引物、10 μl SYBR?Green DNA 聚合酶和8 μl 去RNA 酶水，引物序列如表1所示。

表1 引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 軟件（IBM 公司，美國），數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同濃度FGF18促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖活性

以不同濃度的FGF18 分別干預(yù)軟骨細(xì)胞48、72 h，CCK8 細(xì)胞活性檢測結(jié)果如圖1 所示，不同濃度的FGF18 對軟骨細(xì)胞均表現(xiàn)出促增殖活性作用，并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，在20 ng/ml 時促增殖活性最為明顯，與0 ng/ml 組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 不同濃度FGF18對軟骨細(xì)胞增殖活性的影響（*P＜0.05）

二、不同濃度FGF18 影響軟骨細(xì)胞初級纖毛表達(dá)水平和長度變化。

以不同濃度FGF18 干預(yù)軟骨細(xì)胞48 h 后通過熒光染色檢測初級纖毛表達(dá)水平（圖2），0 ng/ml 時初級纖毛發(fā)生率為（77.91±5.53）%，長度為（1.63±0.67）μm；FGF18 濃度為5 ng/ml 時，初級纖毛發(fā)生率為（52.91±5.61）%，長度為（2.67±0.90）μm；FGF18濃度為10 ng/ml 時，初級纖毛發(fā)生率為（42.12±5.20）%，長度為（2.71±0.97）μm；FGF18 濃度為20 ng/ml 時，初級纖毛發(fā)生率為（36.53±4.88）%，長度為（2.76±1.37）μm；FGF18 濃度為40 ng/ml 時，初級纖毛發(fā)生率為（33.44±5.98）%，長度為（2.79±1.13）μm。與0 ng/ml組相比，各濃度組初級纖毛表達(dá)水平和長度的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

三、初級纖毛參與FGF18 對軟骨細(xì)胞增殖和表型的調(diào)控

根據(jù)前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇FGF18 組中FGF18 的濃度為20 ng/ml。如圖3 所示，F(xiàn)GF18 組干預(yù)48 h、72 h 后軟骨基質(zhì)的分泌增多，有效維持軟骨細(xì)胞活性和軟骨表型。而水合氯醛組初級纖毛表達(dá)明顯下調(diào)（9.10%±2.44%），凋亡軟骨細(xì)胞比例增加（活細(xì)胞占比為72.86%±2.95%），而水合氯醛+FGF18組初級纖毛的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化（10.01%±2.23%），同時伴有一定比例的細(xì)胞凋亡（活細(xì)胞占比為76.94%±5.62%），相比對照組（纖毛發(fā)生率為77.91%±5.53%，活細(xì)胞占比為96.81%±1.38%）和FGF18 組（纖毛發(fā)生率為36.53%±4.88%，活細(xì)胞占比為96.29%±2.17%）均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

CCK8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，F(xiàn)GF18組軟骨細(xì)胞的增殖活性上調(diào)，而當(dāng)水合氯醛破壞纖毛結(jié)構(gòu)后，不論是否再加入FGF18，軟骨細(xì)胞的增殖活性較FGF18 組均明顯受到抑制，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。此外，破壞初級纖毛結(jié)構(gòu)能夠明顯抑制FGF18 對軟骨基質(zhì)的促分泌作用，并且明顯下調(diào)軟骨表型相關(guān)基因COLⅡ和SOX9 的表達(dá)，結(jié)果與FGF18 組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

圖2 不同濃度FGF18對初級纖毛表達(dá)水平和長度變化的影響 a～e：初級纖毛的熒光染色；f：不同濃度組初級纖毛的發(fā)生率；g：不同濃度組初級纖毛的長度（*P＜0.05）

圖3 初級纖毛參與FGF18對軟骨細(xì)胞增殖和分化發(fā)育的調(diào)控 a～d：Live/dead熒光染色；e～h：初級纖毛的熒光染色；i：活細(xì)胞所占比例；j：初級纖毛的發(fā)生率；k：藥物干預(yù)48 h和72 h后細(xì)胞增殖活性；l：甲苯胺藍(lán)染色；m：藥物干預(yù)后表型相關(guān)基因COL Ⅱ的mRNA相對表達(dá)量；n：藥物干預(yù)后表型相關(guān)基因SOX9的mRNA相對表達(dá)量（C：對照，CH：水合氯醛，*P＜0.05）

四、ERK通路參與FGF18對軟骨發(fā)育的調(diào)控

如圖4所示，20 ng/ml FGF18能夠明顯促進(jìn)增殖蛋白CyclinD1 和表型蛋白COLⅡ表達(dá)增加，而水合氯醛破壞初級纖毛結(jié)構(gòu)后，F(xiàn)GF18 對相關(guān)蛋白的促表達(dá)作用受到抑制，與對照組和FGF18 組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與此同時，F(xiàn)GF18能維持P?ERK 的表達(dá)，并且呈上調(diào)趨勢；破壞纖毛結(jié)構(gòu)后，P?ERK 的表達(dá)降低，此時再加入FGF18時，其對P?ERK 的促表達(dá)效應(yīng)明顯受到抑制。與FGF18組相比，水合氯醛組中P?ERK/T?ERK 的比值均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

討 論

FGF18作為成纖維細(xì)胞生長因子家族中的重要成員，是一種具有潛力可以改善骨關(guān)節(jié)炎疾病的藥物，對調(diào)控軟骨細(xì)胞的生長發(fā)育具有非常重要的作用，同時因其具有較少的副作用，表現(xiàn)出重要的臨床應(yīng)用價值，但是目前對FGF18調(diào)控軟骨發(fā)育機(jī)制的認(rèn)識仍十分有限。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF18 能夠作為軟骨合成代謝的促進(jìn)因子。體內(nèi)環(huán)境中，F(xiàn)GF18 廣泛分布于軟骨膜和關(guān)節(jié)間隙，可以作為軟骨細(xì)胞增殖的啟動因子，促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)的合成代謝［11］。FGF18能特異性結(jié)合FGFR3 活化FGF 信號通路來調(diào)控軟骨基質(zhì)的合成及分泌，進(jìn)而調(diào)控軟骨發(fā)育［6］。FGF18還能參與調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨誘導(dǎo)分化，促進(jìn)軟骨基質(zhì)的分泌并且延緩細(xì)胞向終末期肥大軟骨細(xì)胞分化［12］。FGF18還能參與骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織的再生修復(fù)，延緩軟骨退變。例如，F(xiàn)GF18可以通過調(diào)控PI3K?AKT信號傳導(dǎo)減弱白細(xì)胞介素1β（Interleukin?1β,IL?1β）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時增強(qiáng)線粒體融合和裂變，恢復(fù)線粒體功能并減少炎癥因子誘導(dǎo)的活性氧（Reactive oxygen species, ROS）產(chǎn)生［6］。FGF18能夠促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)并分泌更多的透明軟骨細(xì)胞基質(zhì)，促進(jìn)功能化的軟骨再生［11］。在關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射FGF18 能延緩創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎軟骨退變，增加軟骨厚度，而FGF18 在體內(nèi)的抗分解代謝效應(yīng)可以通過調(diào)控金屬蛋白酶組織抑制因子1（tissue inhibitors of metalloproteinase?1,Timp1）的表達(dá)來發(fā)揮效應(yīng)［13］。而在骨關(guān)節(jié)炎病人中，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射FGF18 能減少軟骨厚度與體積的丟失，并且呈一定的濃度依賴性［14］。目前，F(xiàn)GF18在臨床的應(yīng)用價值不斷得到重視，深入認(rèn)識其軟骨保護(hù)作用機(jī)制具有重要的研究價值。

初級纖毛作為具有多樣功能的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，被證實(shí)能夠參與調(diào)控軟骨組織發(fā)育，軟骨力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，軟骨相關(guān)疾病和軟骨腫瘤的發(fā)生［8，10，15，16］。初級纖毛結(jié)構(gòu)和功能的完整性對維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，調(diào)控軟骨生長發(fā)育至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR 能夠通過與細(xì)胞內(nèi)激酶的交互作用來影響初級纖毛的長度和功能［17］。而調(diào)節(jié)FGFR3 介導(dǎo)的FGF 信號能夠影響初級纖毛的長度和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能，初級纖毛是FGF通路中重要的組成部分［15］。這些研究有助于認(rèn)識異常的FGF 信號和初級纖毛在軟骨發(fā)育不全和軟骨腫瘤發(fā)生過程中的作用及機(jī)制。而本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的FGF18 對體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞具有明顯的促增殖活性，并且在20 ng/ml 濃度時表現(xiàn)出最顯著的促增殖效應(yīng)。初級纖毛作為一種由微管結(jié)構(gòu)聚合而成的細(xì)胞器，其在結(jié)構(gòu)上與紡錘體同源，參與細(xì)胞的分裂周期，在功能上又具有感受外界理化刺激、轉(zhuǎn)導(dǎo)信號分子等多種功能，其表達(dá)水平和長度改變能反應(yīng)細(xì)胞新陳代謝和功能的變化。

圖4 ERK通路參與FGF18對軟骨細(xì)胞增殖和表型的調(diào)控 a：不同組別中表型蛋白COL Ⅱ、增殖蛋白CyclinD1、通路蛋白P?ERK和T?ERK的表達(dá)情況；b：定量分析COL Ⅱ蛋白的相對表達(dá)量；c：定量分析CyclinD1蛋白的相對表達(dá)量；d：定量分析P?ERK/T?ERK 的蛋白表達(dá)比值（C：對照，CH：水合氯醛，*P＜0.05）

在本研究中，通過分析軟骨細(xì)胞初級纖毛的發(fā)生率和長度變化時發(fā)現(xiàn)，隨著FGF18 濃度的增加，初級纖毛的表達(dá)水平逐漸降低，但是其纖毛的平均長度則逐漸增加。這可能是因?yàn)镕GF18 能夠通過啟動細(xì)胞進(jìn)入分裂周期，促進(jìn)了初級纖毛結(jié)構(gòu)和紡錘體結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化，初級纖毛微管解聚并且重新聚合為紡錘體樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)，此時細(xì)胞代謝活動增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)活躍，在紡錘體與初級纖毛周期性轉(zhuǎn)化的同時也在不斷強(qiáng)化初級纖毛的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能，包括對營養(yǎng)物質(zhì)和信號蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而又促進(jìn)纖毛的延長以強(qiáng)化其物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和理化感受器等功能［18］。而破壞初級纖毛后，F(xiàn)GF18對軟骨基質(zhì)的促分泌作用受到抑制，增殖活性受到抑制，凋亡軟骨細(xì)胞增加，下調(diào)軟骨表型基因表達(dá)，同時在蛋白水平抑制FGF18 對軟骨細(xì)胞增殖和表型蛋白的促表達(dá)效應(yīng)。說明破壞初級纖毛結(jié)構(gòu)后，軟骨細(xì)胞內(nèi)新陳代謝紊亂，微管結(jié)構(gòu)破壞，無法實(shí)現(xiàn)紡錘體和初級纖毛的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，細(xì)胞增殖活性受到抑制，而初級纖毛結(jié)構(gòu)的破壞使得其物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能、感受器功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能均受到破壞，也直接影響了軟骨細(xì)胞對微環(huán)境變化的反應(yīng)和適應(yīng)能力，并且阻斷了纖毛相關(guān)信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而對軟骨細(xì)胞包括增殖、分化等多種生命活動產(chǎn)生負(fù)面調(diào)控效應(yīng)［19］。因此，初級纖毛結(jié)構(gòu)和功能的完整性可能影響FGF18 對軟骨細(xì)胞增殖和表型維持的調(diào)控過程，而初級纖毛在軟骨細(xì)胞內(nèi)的解聚、重構(gòu)以及延伸變化可能是影響FGF18 發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因素，也為探究FGF18 介導(dǎo)的軟骨發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供了新的思路。