王水苗， 張迪， 范榮華， 商磊， 張陽(yáng)蕾

（1. 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生， 遼寧 沈陽(yáng)110034； 2. 公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)教研室； 3. 藥學(xué)院藥理學(xué)教研室； 4. 沈陽(yáng)市第十人民醫(yī)院）

沈陽(yáng)作為我國(guó)重要的工業(yè)基地［1］， 大氣污染問題日益突出。 PM2.5是指大氣中直徑≤2.5 μm 的顆粒物［2］， 與呼吸系統(tǒng)疾病、 心腦血管疾病、 免疫疾病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等有著密切聯(lián)系［3］。通過對(duì)大氣污染物與高血壓大鼠呼吸道微生態(tài)的影響研究發(fā)現(xiàn)， 暴露于大氣污染物中可導(dǎo)致高血壓大鼠口咽部細(xì)菌出現(xiàn)菌群失調(diào)， 破壞機(jī)體的微生態(tài)平衡［4］。 國(guó)內(nèi)外大量研究表明， PM2.5通過呼吸進(jìn)入母體后， 不僅能夠影響孕婦本身的狀態(tài)，而且可能通過其他途徑造成胎兒早產(chǎn)、 流產(chǎn)、 死胎、 吸收胎、 子代出生體重降低等不良妊娠， 具有一定的胚胎毒性［5－10］， 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了這一點(diǎn)［11］。 相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)， PM2.5等空氣污染物和菌群失調(diào)常與兒童哮喘發(fā)作有關(guān)［12］。 但PM2.5暴露所致的孕鼠呼吸道菌群失調(diào)與胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系目前并不清楚。 本研究采用16S rDNA 高變區(qū)測(cè)序分析沈陽(yáng)市交通相關(guān)的PM2.5對(duì)Wistar 孕鼠呼吸道微生態(tài)和對(duì)胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育造成的影響， 探討PM2.5改變?cè)惺蠛粑牢⑸鷳B(tài)與胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育的聯(lián)系， 以期為孕婦和胎兒健康的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取SPF 級(jí)Wistar 大鼠雄性10 只， 雌性20 只， 體重（200±10） g， 均未經(jīng)生育交配， 由沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)： SYXK （遼） 2015－0001）， 常規(guī)飼養(yǎng)于沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 實(shí)驗(yàn)初始將發(fā)情期雌鼠與雄鼠按照2∶1 比例合籠飼養(yǎng)， 次日清晨采用顯微鏡觀察法確定雌鼠是否懷孕， 鏡下可見精子團(tuán)或肉眼可見陰道栓者記為孕1 d。 隨后將受孕成功的20 只雌鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10 只。

1.2 主要試劑及儀器 沈陽(yáng)市空氣污染細(xì)顆粒物（采集于沈陽(yáng)市黃河北大街） 制成混懸液； 無(wú)菌咽拭子培養(yǎng)管（蘇州康健醫(yī)療器械有限公司）； 顯微鏡（北京瑞科中儀科技有限公司）； 超聲儀（必能信超聲上海有限公司）； TE－6070VFC 大流量顆粒物采樣器（美國(guó)Tisch Environmental 公司）； 低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Sigma 公司）； HRH－MNE 型動(dòng)物口鼻吸入暴露系統(tǒng)（北京慧榮和科技有限公司）； －80 ℃低溫冰箱（日本Panasonic 公司）； 純水機(jī)（美國(guó)Milli－Q Integral 公司）； 16S rDNA 高變區(qū)測(cè)序分析（廣州基迪奧生物公司）。

1.3 方法

1.3.1 PM2.5標(biāo)本采集與混懸液制備 將恒重超純石英纖維濾膜放置在沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院交通活躍、 生活污染區(qū)距地面高1.6 m 的大流量顆粒物采樣器內(nèi)，于冬季采暖期收集大氣細(xì)污染物PM2.5， 24 h 持續(xù)采樣， 采集6 個(gè)月。 采樣前濾膜干燥稱重， 采樣后的濾膜剪成3 cm×3 cm 的方塊， 置于提前備好的含有100 ml 超純水的燒杯中， 常溫（25 ℃） 超聲震蕩3 次（15 min／次）， 收集震蕩后粗洗液并用6 層紗布過濾， 除去殘?jiān)?后將濾過液離心（1 000 r／min） 1 h， 棄上清， 收集底部混懸液。

1.3.2 PM2.5暴露孕鼠模型 將實(shí)驗(yàn)組孕7 d 孕鼠放入動(dòng)物口鼻吸入暴露系統(tǒng)的口鼻暴露室內(nèi)以1.3 mg／m3細(xì)顆粒物的濃度霧化吸入PM2.5至孕20 d，隔天暴露一次（4 h／次）， 共暴露7 次； 對(duì)照組以同等方式等量霧化吸入超純水。

1.3.3 標(biāo)本的采集 孕20 d 用微生物專用無(wú)菌咽拭子棉簽采集孕鼠咽后壁的菌群樣本（注意取樣時(shí)勿致口腔咽頰及舌黏膜出血）， 采樣后標(biāo)記并立即放入－80 ℃冰箱內(nèi)低溫保存。 完成咽拭子標(biāo)本的采集后， 用乙醚麻醉和頸椎脫位法將孕鼠處死后剖腹， 取出子宮稱取窩重。 剖開子宮取出全部胎鼠， 記錄每窩胎鼠數(shù)并測(cè)量每窩胎鼠重量和胎盤重， 以及單只胎鼠的體重、 體長(zhǎng)， 比較不良妊娠結(jié)局。

1.3.4 16S rDNA 高變區(qū)測(cè)序分析 采用16S rDNA高變區(qū)測(cè)序方法對(duì)孕鼠口咽部菌群進(jìn)行分析鑒定。 經(jīng)過基因組DNA 提取、 PCR 擴(kuò)增、 建庫(kù)和測(cè)序以及數(shù)據(jù)處理與分析獲得OTU 后， 依次進(jìn)行物種注釋、 Alpha 多樣性分析、 Beta 多樣性分析等群落功能預(yù)測(cè)， 在有效分組的情況下進(jìn)行組間差異檢驗(yàn)及差異比較。 與環(huán)境因子結(jié)合進(jìn)行特定的高級(jí)分析， 確定呼吸道微生態(tài)與PM2.5暴露之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)和Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OTU 分析 本研究共得到7 174 個(gè)OTU。 選取比較分組平均豐度大于1 的所有OTU （即高豐度并集OTU） 進(jìn)行韋恩圖分析得到， 兩組間共有的OTU 數(shù)為208 個(gè)， 分別占實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組OTU總數(shù)的86%和36%； 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組獨(dú)有OTU 數(shù)分別為33 個(gè)和370 個(gè)， 實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組的微生物種類更加集中， 見圖1。

圖1 PM2.5暴露后組間比較的韋恩圖

2.2 Alpha 多樣性分析 本研究繪制稀釋曲線（rarefaction curve）， 見圖2， 并采用Chao1、 Ace、Shannon、 Observed _ species、 Simpson 和Goods_coverage六大類常用統(tǒng)計(jì)方法分析Alpha 多樣性，見表1。 結(jié)果可以看出， PM2.5暴露影響孕鼠口咽部微生物的多樣性， 對(duì)照組的多樣性高于實(shí)驗(yàn)組。

圖2 樣品在0.03 距離下的OTU 稀釋曲線圖

2.3 Beta 多樣性分析 利用R 語(yǔ)言的Pheatmap包， 以熱圖形式展示組間Weighted 和Unweighted Unifrac 指數(shù)， 見圖3； 基于樣本間的Weighted 和Unweighted Unifrac 數(shù)據(jù)結(jié)果， 繪制PCoA 圖形， 見圖4。 結(jié)果顯示， 實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組的微生物種類少。

2.4 物種分類分析 經(jīng)物種分類熱圖分析， 20 個(gè)樣品中總共有19 個(gè)門、 32 個(gè)綱、 47 個(gè)目、 73 個(gè)科、 114 個(gè)屬、 36 個(gè)種被鑒定， 結(jié)果見圖5。

2.5 物種差異分析 通過LEfSe 分析組間菌群差異， 找出實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間差異顯著的物種，見圖6。 通過組間菌群差異數(shù)據(jù)表更加清晰地體現(xiàn)各主要差異菌群在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的差異， 見表2。 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 變形菌門、 擬桿菌門及厚壁菌門細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異明顯。

圖3 樣本間Weighted （A） 和Unweighted Unifrac （B） 指數(shù)熱圖

2.6 窩重、 胎盤重量及不良妊娠結(jié)局 實(shí)驗(yàn)組窩重低于對(duì)照組（P＜0.05）。 實(shí)驗(yàn)組胎鼠的胎盤重量低于對(duì)照組， 但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。 實(shí)驗(yàn)組中2 只孕鼠流產(chǎn)， 解剖后可見子宮明顯擴(kuò)張但宮內(nèi)無(wú)胎鼠。

2.7 胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況 實(shí)驗(yàn)組每窩胎鼠數(shù)量少于對(duì)照組（P＜0.05）。 實(shí)驗(yàn)組胎鼠平均體重、 平均體長(zhǎng)均低于對(duì)照組， 但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）， 見表4。

圖4 基于Weighted （A） 和Unweighted Unifrac （B） 距離的PCoA 分析

圖5 物種分類熱圖

表2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的LEfSe 結(jié)果

續(xù)表2

表3 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組胎鼠窩重和胎盤重的比較

表3 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組胎鼠窩重和胎盤重的比較

注：*實(shí)驗(yàn)組有2 只孕鼠流產(chǎn)。 與對(duì)照組比較，1）P ＝0.003

組別 n 窩重（g） 胎盤重量 （g）對(duì)照組 10 45.03±12.29 0.51±0.07實(shí)驗(yàn)組 8* 23.82±13.371） 0.39±0.20

圖6 LEfSe 差異分析圖（柱狀圖的長(zhǎng)度代表差異物種的影響大小）

表4 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每窩胎鼠數(shù)及胎鼠平均體重、 平均體長(zhǎng)的比較（）

表4 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每窩胎鼠數(shù)及胎鼠平均體重、 平均體長(zhǎng)的比較（）

注：*實(shí)驗(yàn)組有2 只孕鼠流產(chǎn)。 與對(duì)照組比較，1）P ＝0.026

組別 鼠數(shù)（n） 每窩胎鼠數(shù)（個(gè)） 平均體重（g） 平均體長(zhǎng)（g）對(duì)照組 10 11.00±3.50 2.38±0.12 3.31±0.11實(shí)驗(yàn)組 8* 6.30±5.061） 2.17±1.20 2.65±1.35

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要研究對(duì)象為孕鼠， 為了更好地模擬孕期受大氣PM2.5影響， 考慮到孕婦孕期PM2.5暴露頻率及時(shí)長(zhǎng)， 故選擇隔天暴露（4 h／次） 作為本研究的暴露方式。 Wistar 大鼠孕期通常為19 ～23 d， 本試驗(yàn)選擇21 d 作為大鼠妊娠周期。 張銘［13］研究結(jié)果表明， 模仿人類妊娠周期可以將Wistar 大鼠的妊娠周期分為3 個(gè)階段， 孕早期為懷孕后1～7 d， 孕中期為懷孕后8 ～14 d， 孕晚期為懷孕14 d 以后。 考慮到孕早期母體各項(xiàng)指標(biāo)均不穩(wěn)定， 易導(dǎo)致意外流產(chǎn)、 畸形等不良妊娠結(jié)局，故選擇大鼠孕中期初始即孕7 d 開始進(jìn)行造模。

PM2.5可以改變呼吸道正常菌群定植、 破壞呼吸道微生態(tài)， 從而引發(fā)呼吸系統(tǒng)疾?。?4］。 本研究采用16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)PM2.5暴露后孕鼠呼吸道菌群變化進(jìn)行分析。 菌屬重疊結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組獨(dú)有OTU 數(shù)明顯少于對(duì)照組， 表明PM2.5暴露可使孕鼠呼吸道菌群呈減少的趨勢(shì)。 由表1 可知， 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間Chao1 指數(shù)和Ace 指數(shù)存在顯著差異， 說明暴露孕鼠和非暴露孕鼠呼吸道菌群的豐富度存在不同。 經(jīng)過物種差異分析， 本研究共發(fā)現(xiàn)3 種組間差異明顯的細(xì)菌門， 包括變形菌門、 擬桿菌門及厚壁菌門， 且三種菌門的物種最高豐度平均值均高于對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間菌群豐度、數(shù)量、 多樣性等發(fā)生變化， 意味著當(dāng)大氣污染達(dá)到一定時(shí)間和濃度時(shí)， 微生物防線被打破， 口咽部菌群改變。 張莉等［15］通過PM2.5對(duì)大鼠咽部微生態(tài)的影響研究， 發(fā)現(xiàn)吸入PM2.5后大鼠咽部菌群中正常菌的檢出率明顯降低， 而致病菌和條件致病菌檢出率明顯增加。 該研究表明PM2.5可以破壞大鼠咽部微生態(tài)平衡， 早期主要表現(xiàn)為需氧菌菌群失調(diào)， 晚期可發(fā)生厭氧菌菌群失調(diào)。 郭杰［16］利用16S rDNA 高變區(qū)測(cè)序分析法探討PM2.5對(duì)Wistar 大鼠呼吸道微生態(tài)的影響研究， 發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露對(duì)Wistar 大鼠的口咽部呼吸道微生態(tài)優(yōu)勢(shì)菌菌群構(gòu)成有影響， 并表明這些菌群相對(duì)比例變化可能與人群的肺炎和支氣管疾病等相關(guān)。

此外， 實(shí)驗(yàn)組γ－變形菌綱中， 專性好氧菌及兼性厭氧菌檢出率減少； 擬桿菌綱中， 普雷沃氏菌檢出率減少。 文獻(xiàn)報(bào)道， 健康人群的呼吸道黏膜表面定居著以厚壁菌門、 變形菌門、 擬桿菌門為主的大量細(xì)菌［17］。 研究表明， 慢性阻塞性肺疾病患者支氣管肺泡灌洗液中變形菌門豐度增加［18］；哮喘患者氣道內(nèi)擬桿菌門中的普雷沃氏菌比例低于正常人群［19］。 說明大鼠呼吸道優(yōu)勢(shì)菌群與人類非常相似， 人類呼吸道微生態(tài)與多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。 本研究16S rDNA 高通量測(cè)序結(jié)果表明， PM2.5暴露可致Wistar 孕鼠呼吸道中的厚壁菌門、 變形菌門和擬桿菌門等正常菌群豐度及數(shù)量減少、 多樣性降低， 即PM2.5暴露可致孕鼠呼吸道菌群構(gòu)成發(fā)生變化， 提示PM2.5暴露可能引起孕婦孕期口咽部菌群改變， 破壞呼吸道微生態(tài)平衡， 從而引起生理機(jī)能發(fā)生改變。

本研究統(tǒng)計(jì)學(xué)分析胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)數(shù)據(jù)顯示， 實(shí)驗(yàn)組窩重明顯減輕、 每窩胎鼠數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 表明PM2.5可致胎鼠總數(shù)減少、 窩重減輕， 提示PM2.5暴露對(duì)妊娠有一定影響。 且對(duì)照組整體標(biāo)準(zhǔn)差較小， 顯示PM2.5可致胎鼠胎盤重量和體重減輕、 體長(zhǎng)減小。 文獻(xiàn)報(bào)道，大氣污染可通過影響孕婦的呼吸、 心血管等系統(tǒng)，進(jìn)而影響子宮、 胎盤和臍血血流， 導(dǎo)致新生兒低體重、 胎兒生長(zhǎng)遲緩或早產(chǎn)［20］。 Kannan 等［21］研究表明， 空氣顆粒物可通過全身氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、 血凝變化、 內(nèi)皮功能和血流動(dòng)力學(xué)的變化等生物學(xué)作用途徑， 單獨(dú)或聯(lián)合起作用影響胎盤和胎兒。 Perera 等［22］研究表明， 空氣污染可導(dǎo)致胎兒體重減輕、 體長(zhǎng)減少等不良出生結(jié)局。 本研究統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明， PM2.5暴露可導(dǎo)致一定比例的孕鼠流產(chǎn)； 未流產(chǎn)孕鼠與對(duì)照組相比， 可引起胎鼠總數(shù)減少， 窩重、 胎盤重量和胎鼠體重減輕， 體長(zhǎng)減少的趨勢(shì)。 即PM2.5暴露能夠?qū)υ衅谔ナ笊L(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不良影響。

綜上所述， PM2.5暴露可打破孕鼠呼吸道微生態(tài)平衡， 引起呼吸道菌群失調(diào)， 同時(shí)對(duì)胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不良影響。 在大氣嚴(yán)重污染的天氣情況下， 孕婦出行前應(yīng)做好相應(yīng)防護(hù)措施或盡量避免外出， 以減少或避免PM2.5對(duì)自身和胎兒的危害。