李飛， 徐峰， 陳俠

（沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院生理學教研室， 遼寧 沈陽110016）

血管鈣化是鈣離子在血管壁上過量沉積的結果， 治療不及時則會引發(fā)各種心血管疾病。 然而，臨床上針對血管鈣化的治療主要是緩解癥狀， 仍然缺乏有效的治療手段。 近年來， 一些研究證明維生素K 能夠抑制血管鈣化及心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展［1－2］。 維生素K 作為γ－谷氨酸羧化酶（γglutamate carboxylase， GGCX） 的輔酶參與蛋白質中谷氨酸殘基的羧化過程， 并且因此參與調節(jié)鈣離子在體內各組織的沉積過程。 維生素K2 是維生素K 在體內發(fā)生作用的重要形式， 外源性攝入維生素K2 可顯著降低冠心病的發(fā)病率， 而給予維生素K1 對心血管發(fā)病率無顯著影響［3－4］。 因此， 維生素K2 對心血管健康的保護作用得到人們更多的關注。 Menaquinone－7 （MK－7） 是具有較長半衰期的長鏈維生素K2， 大量存在于大豆發(fā)酵制品納豆之中。 它具有吸收率高［5］、 生物活性強等優(yōu)點，對骨質疏松及血管鈣化都顯示出較強的抑制作用［6－7］。 然而， MK－7 對骨鈣代謝異常導致的血管鈣化的改善作用尚不明確。 我們的前期研究表明MK－7 對糖皮質激素誘導的骨質疏松及鈣代謝異常有顯著的抑制作用。 本研究將考察MK－7 對糖皮質激素性骨鈣代謝異常引起的大鼠血管鈣化的抑制作用及作用機制， 為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 3 月齡SD 大鼠， SPF 級， 100只， 雌雄各半， 體重（200 ± 20） g， 由遼寧長生生物技術有限公司提供， 實驗動物許可證號：SCXK （遼） 2015－0001。 大鼠分籠飼養(yǎng)， 自由攝食飲水， 室溫恒定（22±2）℃， 適應性喂養(yǎng)10 d后進行實驗。

1.2 藥品與試劑 MK－7 （廣東雙駿生物科技有限公司）， 地塞米松磷酸鈉注射液（國藥集團容生制藥有限公司）， 食用油（中糧北海糧油工業(yè)有限公司）， Menaquinone－4 （MK－4， 上海賀普實業(yè)有限公司）， 生長停滯特異性基因產物6 （growth arrest specific gene 6， Gas 6） 多克隆抗體（美國Proteintech 公 司）， 護 骨 素 （ osteoprotegerin，OPG）、 骨橋蛋白（osteopontin， OPN）、 鈣結合蛋白（calcium－binding protein， CaBP）、 骨形態(tài)發(fā)生蛋白－7 （bone morphogenetic protein－7， BMP－7）、血栓素B2 （thromboxane B2， TXB2）、 前列腺素E2 （prostaglandin E2， PGE2） 及6－酮－前列腺素F1α （6－keto－prostaglandin F1α， 6－keto－PGF1α）放射免疫試劑盒（北京華英生物技術研究所）。

1.3 儀器 高速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公 司， 型 號： HC － 3018R）， 多 功 能 酶 標 儀（THERMO scientific， 型號： Mx3000P）， 全自動生化分析儀（寧波美康生物科技有限公司， 型號：MS－880）， 全自動放免計數儀（西安核儀器廠，型號： XH－6020）。

1.4 方法

1.4.1 實驗動物分組與給藥 大鼠按體重隨機分為正常對照組（10 只） 和地塞米松注射組（90只）。 地塞米松注射組大鼠肌內注射地塞米松2.5 mg／kg， 每周3 次， 正常對照組肌內注射相應容量的生理鹽水。 連續(xù)注射6 周后， 停止注射。大鼠禁食24 h， 眼眶靜脈取血， 分離血清， 使用全自動生化分析儀測定大鼠血清堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP） 水平， 將地塞米松注射組大鼠的ALP 水平與正常對照組大鼠的ALP 水平進行比較， 評定造模結果。 將造模成功的大鼠隨機分為5 組： 模型組、 陽性對照組（MK－4，104 μg／kg）、 MK－7 6.5、 26、 104 μg／kg 劑量組。正常對照組和模型組按10 mg／kg 食用油灌胃， MK－7 各劑量組按所設劑量給予食用油溶解的MK－7灌胃， 陽性對照組每天給予食用油溶解的MK－4（104 μg／kg） 灌胃， 每日1 次， 連續(xù)6 周。 各組大鼠分籠飼養(yǎng)， 自由攝食飲水， 室溫恒定（22±2）℃。

1.4.2 觀察指標與方法 末次給藥后， 大鼠禁食24 h， 眼眶靜脈取血， 分離血清， 采用放射免疫法測定 血 清OPG、 OPN、 CaBP、 BMP －7、 TXB2、PGE2 及6－keto－PGF1α 水平。 脫臼處死大鼠， 取主動脈組織約100 mg， 采用Western blot 法檢測血管Gas 6 蛋白水平， 利用Image J 軟件對蛋白條帶進行光密度值分析。 取主動脈2 ～3 cm， 利用Von Kossa 染色法， 于光鏡下觀察血管中黑色深染結構為鈣斑。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析， 計量資料以均數±標準差表示， 采用單因素方差分析及Dunnett－t 檢驗進行數據分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MK－7 對血管壁鈣斑形成的影響 干預6 周后， 經Von Kossa 染色， 正常對照組大鼠主動脈壁未見黑色深染結構， 模型組大鼠的主動脈壁多處呈現條狀黑色深染結構， MK－7 各劑量組及MK－4組大鼠主動脈壁中條狀深染結構明顯少于模型組，見圖1。

圖1 MK－7 對大鼠血管壁鈣斑形成的影響（Von Kossa 染色×400）

2.2 MK－7 對大鼠血清OPG、 OPN、 CaBP 及BMP－7 水平的影響 與對照組比較， 模型組大鼠血清OPG、 OPN、 CaBP 及BMP－7 水平明顯降低；與模型組比較， MK－7 104 μg／kg 組及MK－4 組顯著升高大鼠血清OPG、 CaBP 及BMP－7 水平， 差異均有統(tǒng)計學意義， 見圖2A－C； MK－7 各劑量組對大鼠血清OPN 水平無明顯作用， MK－4 組顯著升高大鼠血清OPN 水平， 差異有統(tǒng)計學意義， 見圖2D。

圖2 MK－7 對大鼠血清OPG、 OPN、 CaBP 及BMP－7 水平的影響（n＝10）

2.3 MK－7 對大鼠血管Gas 6 蛋白水平的影響 與對照組比較， 模型組大鼠血管Gas 6 蛋白水平顯著降低； 與模型組比較， MK－7 104 μg／kg 組及MK－4 組可顯著升高Gas 6 的蛋白水平， 差異均有統(tǒng)計學意義， 見圖3。

圖3 MK－7 對大鼠血管Gas 6 蛋白水平的影響

2.4 MK－7 對大鼠血清TXB2、 PGE2 及6－keto－PGF1α 的影響 與對照組比較， 模型組大鼠血清TXB2 明顯升高， PGE2 及6－keto－PGF1α 水平顯著降低； 與模型組比較， 各劑量MK－7 可顯著降低大鼠血清TXB2 水平， 顯著升高大鼠血清PGE2及6－keto－PGF1α 水平， MK－4 顯著升高大鼠血清PGE2 及6－keto－PGF1α 水平， 差異均有統(tǒng)計學意義， 見圖4。

3 討論

血管鈣化是鈣離子在血管壁上過量沉積的結果， 在血管病變中， 動脈鈣化的出現往往預示著臨床上不良的心血管事件。 現有研究表明， 維生素K2 不僅能夠促進骨鈣沉積， 在預防和治療血管鈣化方面也發(fā)揮重要的作用［8－9］。 本研究結果顯示， 大鼠注射地塞米松后， 其主動脈管壁上可檢測到黑色深染的條狀鈣化斑塊， 提示地塞米松促進大鼠血管壁的鈣鹽沉積。 MK－7 大鼠主動脈壁中條狀深染結構明顯少于模型組， 提示MK－7 能夠抑制鈣鹽在血管壁上的沉積， 減少血管壁中鈣斑的形成。

圖4 MK－7 對大鼠血清TXB2、 PGE2 及6－keto－PGF1α 的影響

Gas 6 是維生素K 依賴蛋白家族成員之一， 在生物體內廣泛分布， 而血管平滑肌是Gas 6 的高表達區(qū)域。 發(fā)生血管鈣化的組織中， Gas 6 蛋白的表達量低于正常血管組織［10］。 在本實驗中， 發(fā)生血管鈣化大鼠主動脈血管中Gas 6 的蛋白水平顯著降低， 而高劑量MK－7 可顯著提升主動脈Gas 6 蛋白水平。 Gas 6 蛋白可抑制單核／巨噬細胞釋放炎癥因子（如TNF－α、 IL－1 及IL－6）［11］， 從而調控炎癥反應。 近年來還發(fā)現Gas 6 具有抗凋亡作用， 可通過Gas6／Axl／Akt 信號通路抑制血管平滑肌細胞的凋亡［12］。 以上結果提示， Gas 6 介導MK－7 對血管鈣化的抑制作用， 可通過抑制炎癥反應及凋亡來抑制地塞米松誘導的動脈鈣化。 OPG、 BMP－7等鈣代謝相關蛋白是重要的血管鈣化抑制因素［13－14］， 高劑量MK－7 能夠顯著提高血清OPG、CaBP 及BMP－7 的水平。 MK－7 抑制血管鈣化的作用可能與其上調上述血管鈣化抑制蛋白的水平有關。

PGE2 是花生四烯酸環(huán)氧合酶代謝產物， 具有擴張血管、 免疫抑制和抗炎作用， 可以劑量依賴性地抑制高磷誘導的血管鈣化及由此引發(fā)的心血管不良事件［15］。 MK－7 顯著升高血清PGE2 水平，進而抑制血管鈣化。 血栓素A2 （thromboxane A2，TXA2） 和前列環(huán)素（Epoprostenol， PGI2） 是花生四烯酸代謝的中間產物， PGI2 擴張血管， 抑制血小板聚集； 而TXA2 收縮血管， 促進血小板聚集。在正常生理狀態(tài)下， TXA2 與PGI2 處于相對平衡狀態(tài)， 這是維持血液通暢的重要因素之一。 TXA2水平升高或者PGI2 水平降低， 會導致血管痙攣和血小板聚集性增強等一系列變化， 是促進動脈硬化及血栓性疾病發(fā)生的重要原因［16］。 由于TXA2與PGI2 性質都極不穩(wěn)定， 不易檢測， 而其代謝產物TXB2 和6－keto－PGF1α 則相當穩(wěn)定， 因此可通過測定TXB2 和6－keto－PGF1α 反映TXA2 和PGI2的水平。 本研究顯示， MK－7 顯著降低大鼠血清TXB2 水平， 升高血清6－keto－PGF1α 水平。 表明MK－7 作用后， 大鼠血清TXA2 水平降低， PGI2水平升高， 有助于改善微循環(huán)， 抑制血管鈣化。

綜上所述， MK－7 可通過上調Gas 6、 OPG、BMP－7 等血管鈣化抑制蛋白的水平進而抑制血管鈣化； 另一方面， MK－7 可以抑制TXB2 的形成，促進PGE2 及6－keto－PGF1α 的形成， 有助于抑制血管鈣化。