楊曉晨，張頌文，周沁，胡韜，邵啟祥

(1.江蘇大學附屬昆山醫(yī)院甲乳外科，江蘇昆山215300；2.江蘇大學醫(yī)學院免疫學教研室，江蘇鎮(zhèn)江 212013；3.江蘇省檢驗醫(yī)學重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江212013)

男性乳腺癌是一種罕見的惡性腫瘤，其發(fā)病率約占所有乳腺癌的1%[1]。研究表明，超過10%的男性乳腺癌由已知的乳腺癌易感基因胚系突變引起。其中，BRCA2基因胚系突變具有最高的已知風險[2-3]。BRCA2是遺傳性乳腺/卵巢癌綜合征的致病基因之一，胚系突變攜帶者發(fā)生乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌等腫瘤的風險顯著增加[4]。

研究表明，約20%～30%的結(jié)直腸癌具有家族性，其中約5%～10%患者與已知的遺傳綜合征有關(guān)[5]。Lynch綜合征是由DNA錯配修復基因胚系突變引起的最常見的遺傳性結(jié)直腸癌綜合征，突變基因攜帶者對結(jié)直腸癌及其他一些腫瘤易感[5]。本研究對1例異時性男性乳腺癌和結(jié)腸癌患者進行全面的基因突變分析，旨在明確病因，為臨床指導風險管理和個體化治療提供依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1研究對象 患者，男，52歲，因“發(fā)現(xiàn)右乳腫塊6個月，增大1個月”就診。查體：于右乳頭外側(cè)乳暈旁可觸及直徑約1.5 cm腫塊，質(zhì)硬，邊界清，活動可，局部皮溫不高，乳頭無溢液，無橘皮征；查乳腺B超(圖1A)示：右乳乳頭旁實質(zhì)性團塊。于2017年3月13日行右乳腫塊切除術(shù)，術(shù)中冰凍切片示：右乳浸潤性癌，遂改行右乳癌改良根治術(shù)，術(shù)后病理(圖1B、1C)示：右乳浸潤性導管癌，送檢腋下淋巴結(jié)(2/11)見癌轉(zhuǎn)移。免疫組化染色示：雌激素受體(estrogen receptor,ER)++，孕激素受體(progesterone receptor,PR)+++，人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,Her-2)+，增殖指數(shù)Ki67+10%。術(shù)后給予表柔比星+環(huán)磷酰胺序貫多西他賽方案化療8程，后口服“他莫昔芬”，隨訪至今無復發(fā)及轉(zhuǎn)移。既往史：患者于2010年3月6日行“乙狀結(jié)腸癌根治術(shù)”，術(shù)后病理(圖1D)示：中分化腺癌，侵及深肌層，淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移，術(shù)后予Folfox4方案化療8療程。于2014年7月及2015年8月復查腸鏡時分別發(fā)現(xiàn)直腸和結(jié)腸多發(fā)息肉，予內(nèi)鏡下治療，病理提示良性。近期復查腸鏡未見明顯異常。有“高血壓”病史。家族史：患者母親72歲時行“乙狀結(jié)腸癌根治術(shù)”，目前健在。先證者父親因腦出血已死亡，哥哥、姐姐和2位侄子目前健在。家系圖譜見圖2A。本研究通過江蘇大學附屬昆山醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準(批準號：2016-03-001-K01)，所有研究對象均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 Qubit 3.0熒光計(美國Thermo公司)；Covaris S220超聲破碎儀(美國Covaris公司)；MGIEasy外顯子組捕獲V4探針試劑套裝和BGISEQ-500測序儀(華大基因公司)；5417R低溫臺式離心機(德國Eppendorf公司)；PTC-200 PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)；DYY-8C電泳儀(北京六一儀器廠)；UV-IV紫外分析儀(北京市新技術(shù)應用研究所)；ABI 3730XL型DNA測序儀(美國ABI公司)；TIANamp Genomic DNA提取試劑盒(北京天根生化公司)；Ex Taq DNA聚合酶(大連TaKaRa公司)。

1.3方法

1.3.1基因組DNA提取 分別采集先證者及其家系成員外周血各2 mL于乙二胺四乙酸鹽抗凝管中，按照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒說明書操作提取基因組DNA，經(jīng)50 μL TE緩沖液洗脫。用Qubit 3.0熒光計檢測DNA樣本的濃度和純度，取濃度在50～200 ng/μL，吸光度(A260/280 nm)在1.8～2.0的樣本用于后續(xù)實驗，DNA樣本置于-80 ℃保存。

1.3.2全外顯子測序與候選基因篩選 用超聲波降解法將1 μg基因組DNA隨機打斷成150～250 bp的片段，在片段兩端加接頭，進行文庫構(gòu)建。使用MGIEasy外顯子組捕獲V4探針對帶接頭的片段進行雜交捕獲，捕獲的片段采用BGISEQ-500測序平臺進行高通量信息采集。將測序獲得的原始數(shù)據(jù)通過BWA和參考基因組hg19進行比對，以SOAPsnp、SAMtools、GATK軟件分析突變及變異，包括對單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和小的插入或缺失突變(insertions or deletions,InDels)進行檢測、注釋和統(tǒng)計分析。根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會指南[6]對變異進行致病性判斷。如果變異具有截短、起始密碼子或剪接供體/受體作用，或者已在基因突變相關(guān)數(shù)據(jù)庫如乳腺癌信息中心(breast cancer information core,BIC)數(shù)據(jù)庫(https://research.nhgri.nih.gov/bic/)、ClinVar數(shù)據(jù)庫(http://www.nibc.nlm.nih.gov/clinvar)和人類基因突變數(shù)據(jù)庫(human genemutationdatabase,HGMD)中報道，或者在已發(fā)表的文獻中證實為致病性，則將其分類為致病性或可能致病性變異。應用dbSNP數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫、ESP外顯子組數(shù)據(jù)庫和炎黃基因組數(shù)據(jù)庫對數(shù)據(jù)進行過濾，將等位基因頻率大于0.01的變異視為良性或可能良性的變異。剩余的變異則視為意義不明確的變異。對于意義不明確的變異，利用生物信息分析工具(包括SIFT、PolyPhen2)對其功能進行預測。同時，對于致病性或可能致病性變異，結(jié)合家系臨床特征進一步篩選確定候選突變位點。

1.3.3Sanger測序驗證 采用Sanger測序技術(shù)驗證候選突變位點在先證者及其家系成員中的表型共分離情況。采用NCBI中的Primer-BLAST對BRCA2基因c.6402_6406delTAACT(p.Asn2134fs)(NM_000059.3)突變位點進行在線引物設(shè)計，由華大基因公司合成，正向引物序列：5′-TTCATCTGCTTTCTCTGGATTT-3′，反向引物序列：5′-TGTTCTTTTCCCAAAACATGAA-3′。PCR反應體系為30 μL，包括DNA 1 μL，10×PCR buffer 3 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O補足至30 μL。采用降落PCR進行擴增，擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，10個循環(huán)(每個循環(huán)退火溫度降低1 ℃)；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；終延伸10 min。采用PTC-200 PCR擴增儀擴增，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將純化后的PCR產(chǎn)物送華大基因公司，采用ABI 3730XL型DNA測序儀進行Sanger測序分析，測序片段序列(5′→3′)：AAAGTTAAGGGAGTGTTAGAGGAATTTGATTTAATCAGAACTGAGCATAGTCTTCACTATTCACCTACGTCTAGACAAAATGTATCAAAAATACTTCCTCGTGTTGATAAGAGAAACCCAGAGCACTGTGTAAACTCAGAAATGGAAAAAACCTGCAGTAAAGAATTTAAATTATCAAATAACTTAAATGTTGAAGGTGGTTCTTCAGAAAATAATCACTCTATTAAAGTTTCTCCATATCTCTCTCAATTTCAACAAGACAAACAACAGTTGGTATTAGGAACCAAAGTGTCACTTGTTGAGAACA，測序峰圖采用Chromas軟件編輯。

2 結(jié)果

2.1全外顯子測序結(jié)果 先證者目標區(qū)域平均測序深度為182.04×，目標區(qū)域覆蓋度達99.73%，其中測序深度達到10×以上的區(qū)域占全部芯片目標捕獲區(qū)域的98.26%。共獲得120 270個SNPs和22 730個InDels突變位點，經(jīng)過濾后共篩選出43個致病性或可能致病性突變位點(表1)。結(jié)合患者臨床特征，進一步數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)在BRCA2基因第11號外顯子的c.6402_6406delTAACT(p.Asn2134fs)(NM_000059.3)缺失突變，該突變位點為5個堿基缺失形成的移碼突變，造成終止密碼子提前出現(xiàn)，引起翻譯提前終止，蛋白質(zhì)氨基酸序列發(fā)生改變，導致蛋白質(zhì)截短。該突變位點在BIC數(shù)據(jù)庫(https://research.nhgri.nih.gov/bic/)和ClinVar數(shù)據(jù)庫中均有報道，為乳腺癌的致病性突變。結(jié)合臨床綜合分析，最終確定該突變?yōu)橄茸C者乳腺癌的致病突變位點，而在其他乳腺癌相關(guān)易感基因(包括DNA錯配修復基因)中未發(fā)現(xiàn)致病性突變。

2.2Sanger測序驗證結(jié)果 先證者在BRCA2基因第11號外顯子上存在c.6402_6406delTAACT(p.Asn2134fs)(NM_000059.3)雜合突變(圖2B)，其兒子同樣攜帶該雜合突變，而其患有結(jié)腸癌的母親則未攜帶上述突變(圖2C、2D)。

注：A，先證者右乳腫塊超聲圖像；B，先證者乳腺癌組織病理標本；C，先證者淋巴轉(zhuǎn)移組織病理標本；D，先證者結(jié)腸癌組織病理標本。

圖1 先證者腫瘤的超聲及病理結(jié)果(×200)

注：A，攜帶BRCA2c.6402_6406delTAACT突變的家族系譜；箭頭示先證者；B，先證者攜帶BRCA2c.6402_6406delTAACT雜合突變；C，先證者兒子攜帶BRCA2c.6402_6406delTAACT雜合突變；箭頭所指處為突變位點；D，先證者母親未攜帶上述突變。

圖2 該家族系譜及Sanger測序結(jié)果

表1 該先證者全外顯子測序篩選出的致病性或可能致病性突變位點

注：BIC，乳腺癌信息中心；MAF，最小等位基因頻率;-表示無數(shù)據(jù)。

3 討論

遺傳性腫瘤綜合征使個體發(fā)生多種腫瘤的風險顯著增加，且發(fā)病早，多數(shù)呈常染色體顯性遺傳。因此，早發(fā)現(xiàn)、早干預和早治療對降低發(fā)病率和死亡率至關(guān)重要。BRCA1和BRCA2是高外顯性的乳腺癌易感基因，此外還有20余個乳腺癌相關(guān)易感基因[7-8]。Rizzolo等[2]應用二代測序技術(shù)對523例男性乳腺癌患者的50個腫瘤相關(guān)基因進行了胚系突變檢測，發(fā)現(xiàn)近9%的患者攜帶致病性突變，其中，BRCA2突變最多，此外，還發(fā)現(xiàn)BRCA1、PALB2、ATM、CHEK2、RAD51D和APC等15個基因發(fā)生突變。Scarpitta等[3]對81例男性乳腺癌患者的24個DNA損傷修復基因進行了胚系突變檢測，也發(fā)現(xiàn)BRCA2突變率最高；此外，還存在BRIP1、MUTYH和PMS2基因突變。本研究在1例乳腺癌伴異時性結(jié)腸癌的男性患者中發(fā)現(xiàn)的BRCA2c.6402_6406delTAACT(p.Asn2134fs)缺失突變?yōu)橐阎蛔?，該突變是由Gayther等[9]首先在1個家族性乳腺癌家系中發(fā)現(xiàn)，之后在乳腺癌和卵巢癌人群中均有報道[10-12]。該突變位于BRCA2基因第11號外顯子的卵巢癌群集區(qū)域，該區(qū)域突變的個體卵巢癌發(fā)病率遠高于該區(qū)域外的突變[9]。本例先證者的家族史僅為母親患有結(jié)腸癌，并無乳腺癌或卵巢癌患者，我們推測可能與家系樣本較小且女性較少有關(guān)。

本例家系的臨床表現(xiàn)符合Lynch綜合征的臨床診斷標準，且全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)BRCA2胚系缺失突變，而無其他DNA錯配修復基因的致病性突變，因此確認先證者乳腺癌的致病基因為BRCA2。目前尚未證實BRCA2胚系突變可增加結(jié)腸癌的風險，故而無法肯定先證者結(jié)腸癌與此有關(guān)，但根據(jù)患者和其母親的測序結(jié)果，我們推測先證者及其母親所患結(jié)腸癌為散發(fā)，先證者的致病基因可能來自父系。

流行病學調(diào)查結(jié)果表明，有男性乳腺癌家族史的男性個體，其乳腺癌、前列腺癌等腫瘤的風險顯著增加，且發(fā)病年齡早。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National comprehensive cancer network,NCCN)指南建議其應當接受遺傳咨詢及基因檢測，并從35歲開始進行乳房自我檢查，每年進行一次臨床乳房體檢，從40歲開始進行前列腺癌的篩查。本案例中，先證者的兒子經(jīng)測序確認為健康BRCA2基因胚系突變攜帶者，通過今后的干預可最大限度增加其早期診治的概率。

綜上所述，外顯子測序技術(shù)在遺傳疾病診斷中具有良好的應用價值，本研究應用Sanger測序技術(shù)明確了1例男性乳腺癌的致病基因，也為臨床遺傳咨詢、早期干預和診療提供了實驗依據(jù)。