包勤敏，梁棟，喬鳳昌，王艷，馬定遠，張翠平，胡平，許爭峰

(南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，南京 210004)

脆性X綜合征(fragile X syndrome，F(xiàn)XS，OMIM 300624)是遺傳性智力低下最常見的原因之一[1]。FXS是由于FMR1基因(位于Xq27.3)5′非翻譯區(qū)CGG重復擴增導致其所編碼的脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP)功能缺失的疾病[2]。FXS以男性發(fā)病為主，主要臨床表現(xiàn)為重度智力低下、大耳朵、大睪丸、大下巴等[3]。FXS可通過PCR擴增結合微流控毛細管電泳技術檢測X染色體上FMR1基因5′UTR區(qū)CGG三核苷酸重復數(shù)而確診。人誘導多能干細胞(human induced stem cells,hiPSCs)具有多向分化和自我更新增殖能力，近年來成為疾病模型研究的熱點[4]。本研究擬利用本課題組前期建立的非整合技術進行人外周血單核細胞(PBMC)重編程的技術平臺[5]，建立2例FXS患者的PBMC來源的iPSCs細胞系，為FXS的臨床研究提供體外細胞模型。

1 材料和方法

1.1主要試劑及儀器 Ficoll淋巴細胞分離液(天津灝洋公司)；仙臺病毒重編程試劑盒、Rock抑制劑、stemPro-34 培養(yǎng)液(美國Life technology公司)；細胞凍存液、10%二甲亞砜(DMSO)、Geltrex基底膜、DPBS、StemFlex培養(yǎng)液(美國Thermo公司)；Triton-X(美國Sigma公司)；小牛血清BSA、無胰蛋白酶EDTA、小鼠抗人TRA-1-60單克隆抗體、小鼠抗人TRA-1-81單克隆抗體、小鼠抗人SSEA4單克隆抗體、DAPI染液、山羊抗小鼠488熒光二抗、山羊抗兔555熒光二抗、0.2 g/L明膠、兔抗人叉頭蛋白A2(FOXA2)單克隆抗體、兔抗人心肌鈣蛋白1(c-TN1)多克隆抗體、兔抗人β微管蛋白(b-Ⅲ-Tubulin)多克隆抗體(英國Abcam公司);cDNA逆轉錄試劑盒、DNA提取試劑盒、FragilEaseTMFragile X PCR試劑盒(美國Perkin Elmer公司)；SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工公司)。ST16離心機、NanoDrop紫外分光光度計(美國Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)；Gel Doc XR凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad公司)；Allegra X-12R離心機(美國Beckman Coulter公司)。

1.2患者PBMC的分離和凍存 于2019年1月至6月在南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心采集2例FXS全突變男性患者(分別為5歲和24歲)新鮮的外周血5 mL，2例先證者在本院均通過PCR擴增結合微流控毛細管電泳技術確診為脆性X綜合征，先證者母親Ⅰ∶2均為前突變攜帶者，家系2中Ⅱ∶2為女性全突變攜帶者(圖1)。本研究經(jīng)南京市婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會審核批準(寧婦倫字[2019]KY-003)，各研究對象均知情同意。根據(jù)Ficoll淋巴細胞分離液說明書操作提取PBMC，用含10% DMSO的細胞凍存液重懸，經(jīng)-80 ℃凍存過夜后置于液氮中長期保存。

注：Ⅱ∶1為先證者；Ⅰ∶2為先證者母親前突變攜帶者；家系2中Ⅱ:2為全突變攜帶者。

圖1 2例脆性X患者家系圖譜

1.3仙臺病毒(sendai virus，SeV)方法重編程PBMC 將凍存的PBMC復蘇后，用PBMC完全培養(yǎng)液(含100 ng/μL SCF、100 ng/μL Flt-3、20 ng/μL IL-3、20 ng/μL IL-6的StemPro-34培養(yǎng)液)調(diào)整細胞密度至1×106/mL，接種至24孔細胞培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下連續(xù)培養(yǎng)4 d，每天半數(shù)換液。用臺盼藍染液進行活細胞染色計數(shù)，調(diào)整細胞密度至1×105/孔，按照KOS(感染復數(shù)multiplicityof infection，MOI)=5，hc-Myc MOI=5，hKlf4 MOI=3，病毒滴度按KOS=1.4×108、c-Myc=1.5×108、Klf4=1.2×108計算病毒使用量，公式:病毒使用量(μL)=[MOI(CIU/cell)×細胞數(shù)量]/[病毒滴度(CIU/mL)×10-3(μL/mL)]計算所需病毒量，在1 mL培養(yǎng)液分別加入含KOS、c-Myc和Klf4的仙臺病毒(仙臺病毒重編程試劑盒提供)，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，棄去含病毒的培養(yǎng)液，將感染后的細胞分別按1×104/孔、5×104/孔、1×105/孔的細胞密度轉移至Geltrex基底膜基質(zhì)包被的6孔細胞培養(yǎng)板中，用不含細胞因子的StemPro-34培養(yǎng)液半換液，3 d后更換為StemFlex培養(yǎng)液。2～3周后，出現(xiàn)大小不一的克隆，挑選合適大小的形態(tài)上類似胚胎干細胞的克隆，用5 mL無菌注射器針頭切割并轉移至Geltrex基底膜基質(zhì)包被的細胞培養(yǎng)板中，按照胚胎干細胞方法進行傳代、擴大培養(yǎng)、鑒定和凍存。

1.4iPSCs細胞系的培養(yǎng)和傳代 取1.3中構建的iPSCs，用StemFlex培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至2×104/mL，加入至Gletrex包被的6孔細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。每24 h更換新鮮StemFlex培養(yǎng)液，當細胞融合度達80%時進行傳代。為了保證克隆均一性，前5代用機械切割法進行單克隆傳代，5代后使用0.1 mmol/L EDTA消化傳代，傳代時加入10 μmol/L Rock抑制劑，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，每日換液。取該細胞用于細胞傳代和后期細胞實驗。

1.5核型分析 取上述成功建立細胞系的iPSCs進行培養(yǎng)，細胞生長至對數(shù)期時，加入0.2 μg/mL秋水仙素處理26 min，后用10 g/L檸檬酸三鈉在37 ℃水浴鍋內(nèi)消化細胞10 min，1 700 r/min離心10 min，棄上清液，充分吹打混勻收集細胞。用甲醇與冰醋酸(體積比為3∶1) 溶液固定3次，用滴管將細胞懸液滴在經(jīng)0 ℃冰水浸泡的潔凈載玻片上并吹散，酒精燈烤干后置55～60 ℃烤箱中烤片過夜。用預溫的1 g/L胰蛋白酶消化10～15 s，10倍稀釋后的Giemsa染色液染色1 min，高倍顯微鏡下觀察分裂中期細胞染色體，并用GSL-120掃描儀獲取細胞核型圖，用Cytovision軟件對其進行結果分析。

1.6iPSCs多能性鑒定

1.6.1免疫熒光染色 將成功建系的穩(wěn)定iPSCs傳代至12孔細胞培養(yǎng)板中，待克隆生長至合適大小，將培養(yǎng)液吸棄，預熱后的PBS輕柔洗滌2次，加入4%多聚甲醛(PFA)，室溫固定1 h，PBS洗滌3次后使用含0.1% TritonX-100通透30 min，用含1%小牛血清(BSA)的PBST封閉1 h。分別加入小鼠抗人TRA-1-60單克隆抗體，小鼠抗人TRA-1-81單克隆抗體，小鼠抗人SSEA4單克隆抗體(均為1∶100稀釋)4 ℃過夜。加入PBST后置于搖床上震搖30 min，重復3次。加入山羊抗小鼠熒光二抗(1∶1 000稀釋)，室溫避光靜置2 h。避光條件下PBS洗滌3次后，加入3 μmol/L DAPI染液，室溫避光靜置10 min后吸棄DAPI染液，PBST洗滌1次，加入1 mL PBS，并在熒光倒置顯微鏡下觀察及拍照。

1.6.2體外擬胚體EB形成和分化試驗 將1.3中成功構建的iPSCs按1×105/mL的密度傳代至6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞融合度大于80%時，使用0.1 mmol/L EDTA將iPSCs室溫消化3 min，并用含4 mg/mL聚乙烯醇(PVA)、10 μmol/L ROCK抑制劑的StemFlex培養(yǎng)液將克隆吹打成單細胞懸液，接種至超低吸附Petri培養(yǎng)板中。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。使用EB培養(yǎng)液[Knockout DMEM 83 mL、血清替代物KSR 15 mL、谷氨酰胺Glutamax 1 mL、非必需氨基酸NEAA 1 mL]隔天半數(shù)換液。7 d后將透亮的擬胚體轉移至1%明膠包被的24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔15～30個。加入含10% FBS的EB培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)2周。待EB貼壁后使用外胚層標志基因——抗人β微管蛋白(b-Ⅲ-Tubulin)抗體(1∶200稀釋)、中胚層標志基因——抗人心肌鈣蛋白Ⅰ(c-TNI)抗體(1∶400稀釋)和內(nèi)胚層標志基因——FOXA2抗體(1∶500稀釋)對遷出的細胞進行免疫熒光染色(方法同1.6.1)。當染色的結果顯示熒光可被檢測時，表明貼壁的擬胚體已定向分化為相應胚層的細胞，以此鑒定擬胚體具有向三胚層多能分化的能力。

1.6.3逆轉錄PCR(RT-PCR) 取正常傳代至第10代iPSCs(約1×106個)，用0.1 mmol/L EDTA消化。用Trizol法提取細胞的總RNA，NanoDrop紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度，選擇濃度>100 ng/μL，吸光度(A260/280 nm)>2.0的RNA樣本，按照cDNA逆轉錄試劑盒說明書操作將1 μL RNA逆轉錄為cDNA。引物設計序列按照參考文獻[5]，由蘇州金唯智生物科技公司合成。采用RT-PCR檢測iPSCs標志性基因OCT4、SOX2、NANOG的表達水平，以GAPDH作為內(nèi)參照。PCR反應體系為20 μL。包括cDNA模板1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，PCR Mixture 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為:95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物行0.2 g/L瓊脂糖凝膠電泳并用凝膠成像系統(tǒng)掃描并拍照。

1.7CGG重復數(shù)測定

1.7.1DNA提取及測定 取1.3中成功構建的iPSCs細胞系和患者原代PBMC，嚴格按照DNA提取試劑盒說明書操作提取人類基因組DNA，紫外分光光度計進行DNA濃度測定，取DNA濃度≥12.5 ng/μL,DNA總量>480 ng，吸光度(A260/280 nm)比值在1.8～2.0之間；A260/230 nm>1.0的樣本用于后續(xù)試驗。

1.7.2PCR擴增及純化 按照FragilEaseTMFragile X PCR試劑盒說明書進行PCR擴增。PCR循環(huán)參數(shù):95 ℃預變性5 min；98 ℃變性35 s，59 ℃退火35 s，72 ℃延伸4 min，循環(huán)25次；72 ℃延伸10 min。采用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化。

1.7.3PCR產(chǎn)物微流控毛細管電泳分析 采用微流控毛細管電泳儀(PerkinElmer/Caliper Lab Chip?MultiDx)及單吸管微流體芯片對96孔細胞培養(yǎng)板中的樣本進行DNA片段大小分析。采用Labchip MultiDx圖標軟件導出結果。

1.7.4軟件分析 電泳結果的數(shù)據(jù)利用FraXsoftTM分析軟件(PerkinElmer公司)繪制標準曲線，并計算待測樣本CGG三聯(lián)重復序列的拷貝數(shù)。

2 結果

2.1患者來源的iPSCs細胞系的建立 仙臺病毒感染的PBMCs培養(yǎng)至15 d，鏡下可見細胞貼壁生長，呈鋪路石狀，細胞團間有明顯邊界，形態(tài)光整。細胞核質(zhì)比較高，核仁明顯，細胞排列緊密，傳代得到的細胞高核質(zhì)比，核仁明顯，細胞排列緊密呈鋪路石樣，邊緣清晰的克隆樣細胞團(圖2)。在克隆樣細胞團中，挑選多個細胞團進行傳代，最終成功建立iPSCs細胞系。

注：A，先證者1的PBMC及重編程后細胞形態(tài)；B，先證者2的PBMC及重編程后細胞形態(tài)；Day-1，加入病毒前1 d的PBMCs；Day15，加入病毒后15 d的PBMCs；iPSC，第5代hPBMC-iPSC克?。槐壤邩俗R為100 μm;放大倍數(shù)(×100)。

圖2 2例先證者PBMC進行重編程的結果

2.2細胞染色體核型分析 對已成功建立細胞系的患者來源的PBMC-iPSCs傳代至第10代后進行染色體核型分析，結果顯示細胞可保持正常核型46，XY，重編程后的iPSCs染色體核型并未發(fā)生改變，表明該構建體系能夠成功獲得核型正常，且不含外源性基因的iPSCs(圖3)。

注：A，先證者1第10代細胞核型(46，XY)；B，先證者2第10代細胞核型(46，XY)。

2.3iPSCs多能性鑒定

2.3.1iPSCs表面標志物表達的鑒定 免疫熒光染色結果顯示，未分化的iPSCs克隆樣干細胞的多能性標志物抗原TRA-1-60，TRA-1-81,SSEA-4的表達均呈陽性(圖4)。

2.3.2擬胚體分化試驗 對iPSCs向三胚層分化能力進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)iPSCs可懸浮培養(yǎng)形成擬胚體，并且這些擬胚體在貼壁培養(yǎng)2周后，對貼壁生長的細胞進行免疫熒光染色，可分別發(fā)現(xiàn)其外、中、內(nèi)三胚層標志基因b-Ⅲ-Tubulin、c-TN1、FOXA2的表達呈陽性。表明建立的iPSCs細胞系具有向三胚層分化的能力(圖5)。

注：A，先證者1的免疫熒光染色結果；B，先證者2的免疫熒光染色結果；比例尺標識為100 μm;放大倍數(shù)(×100)。

圖4 2例先證者iPSCs表面標志物表達的鑒定

注：A，先證者1的三胚層分化鑒定結果；B，先證者2的三胚層分化鑒定結果；b-Ⅲ-Tubulin抗體鑒定外胚層細胞的分化；c-TNI抗體鑒定中胚層細胞的分化；FOXA2抗體鑒定內(nèi)胚層細胞的分化；比例尺標識為100 μm;放大倍數(shù)(×100)。

圖5 2例先證者三胚層分化鑒定試驗

2.3.3干細胞標志性基因的RT-PCR檢測結果 成功建系的iPSCs中，其干細胞標志性基因OCT4、SOX2、NANOG在iPSCs中均呈陽性表達(圖6)。

注：1，Oct4基因(141 bp)；2，Sox2基因(447 bp)；3，NANOG基因(206 bp)；4，GAPDH基因(137 bp)。

圖6 RT-PCR檢測iPSCs干細胞標志基因Oct4、Sox2、NANOG及GAPDH的表達

2.4DNA提取和CGG重復數(shù)測定 對所建立的iPSCs細胞系和患者PBMC，利用PCR擴增結合微流控毛細管電泳技術檢測X染色體上FMR1基因5′UTR區(qū)CGG三核苷酸重復數(shù)，結果顯示重編程前后的CGG重復數(shù)無差異(圖7)。

3 討論

脆性X綜合征是最常見的遺傳性認知障礙，嚴重危害兒童生長發(fā)育，無有效治療方法[6]。目前已建立了許多FXS轉基因和基因敲除動物模型[7-9]，但沒有一種能夠準確完整地再現(xiàn)患者常見的遺傳表型。事實上，來自遺傳性疾病患者的iPSCs的制備不涉及胚胎細胞，回避了倫理學問題。另一方面將患者來源的體細胞重編程得到的hiPSCs已經(jīng)被證實能夠在體外模擬疾病的特征，也可以在體外被定向誘導分化為相應表型[10-11]。因此，由FXS患者來源的體細胞或患病的胚胎組織中直接取材，誘導分化為iPSCs，以此研究FXS胎兒發(fā)育過程中的分子機制，為探索FXS相關組織和/或發(fā)育階段提供了便利。

注：A，家系1的毛細管電泳結果；B，家系2的毛細管電泳結果；pro，PBMC重編程前；#mPn，表示第m號克隆第n代iPSC重編程后毛細管電泳結果；右上角的數(shù)據(jù)為相應細胞CGG重復數(shù)；橫坐標為檢測序列大小(bp)，縱坐標為熒光信號峰值。

圖7 重編程前后毛細管電泳的結果

本研究中，我們通過2例FXS家系患者的PBMCs，利用人OKSM轉錄4個因子及非整合重編程技術，成功將其重編程為iPSCs。進一步通過特異性免疫熒光染色、體外誘導分化為三胚層等方法鑒定獲得的iPSCs具有多能性，此外，采用G顯帶技術檢測證實該iPSCs核型正常。本研究利用PCR擴增結合微流控毛細管電泳技術證實，使用非整合重編程技術前后CGG重復數(shù)無明顯差異。雖然患者來源iPS細胞在再生醫(yī)學和人類遺傳疾病建模方面具有顯著的優(yōu)勢，但在用于研究FXS時仍存在一些潛在的限制，如可能造成額外染色體異常，以及重編程過程可能增加CGG重復數(shù)目的不穩(wěn)定性等[12]。值得注意的是，本研究得到的2個iPS細胞系重編程前后核型均正常，CGG重復數(shù)目無明顯差異，成功保留了CGG重復的全突變長度。本研究結果表明，通過仙臺病毒進行的非整合重編程過程并未造成CGG重復的不穩(wěn)定，所獲得的不同CGG拷貝數(shù)FXS-iPSC為FXS深入研究提供良好的平臺和重要的臨床干細胞資源。然而,我們?nèi)匀恍枰M一步探討這些細胞系如何模擬體內(nèi)的分子和細胞通路等，以及更好地評估CGG拷貝數(shù)不同導致疾病在iPSC水平的表型差異。近年來，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術在FXS-iPSC全突變等位基因中切除擴增的CGG并激活FMR1，可以促進功能性FMRP的重新產(chǎn)生，但某些相關信號通路和功能是否能夠全面恢復仍然是個值得深入研究的問題[13-15]。未來通過FXS-iPSC在這些方面的研究將有助于闡明FXS的基本機制和治療潛力。

綜上所述，由患者來源的iPSCs可成為研究遺傳病的良好疾病模型。通過將其定向誘導分化為與疾病表型相關的細胞類型，并對其進行生理、生化等各項檢測，這些誘導分化細胞類型亦可用于藥物篩查，為移植生成替代細胞，或作為糾正致病突變/缺失的基因編輯的起始材料。而本研究采用X連鎖遺傳性疾病患者來源的iPSCs，其保留了突變?nèi)旧w，并且iPSCs有分化成人體各個類型細胞的潛能，這為以后的研究提供了取之不盡的細胞資源。