任振敏，劉永秋，劉景，劉四喜，李長鋼，陳運(yùn)生

(深圳市兒童醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科，b.血液腫瘤科，廣東深圳 518038)

β地貧是由于β-珠蛋白基因突變使β-珠蛋白肽鏈合成不足(β+)或完全缺乏(β0)而引起的溶血性貧血[1]。目前，市場上的試劑盒可以檢出在我國常見的17種突變類型，且隨著測序技術(shù)的發(fā)展，可檢測的突變類型逐年增加。研究表明，-86突變在我國非常罕見，-86(C>G)雜合突變僅見3例報(bào)道[2-4]，而-86(C>A)在我國尚未見報(bào)道。本研究檢出-86(C>A)復(fù)合IVS-Ⅱ-654(C>T)中間型地貧1例，并對其進(jìn)行基因診斷以及家系分析，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1病歷資料 先證者，女，3歲4月因面色蒼白、發(fā)熱、咳嗽于2018年12月來本院就診。外院血常規(guī)檢測Hb為54 g/L，查體肝脾腫大。其父親，云南人，29歲，無貧血癥狀。其母親，安徽人，26歲，孕1育1，血常規(guī)顯示輕度貧血，HbA2為4.5%，疑似β地貧。采集先證者及其父母的空腹靜脈血標(biāo)本進(jìn)行基因檢測,并對該家系進(jìn)行分析。家系圖譜見圖1。

注：，母親(βN/β-86(C>A))；，父親(βN/βIVS-Ⅱ-654(C>T))；，先證者(βIVS-Ⅱ-654(C>T)/β-86(C>A))。

圖1 該患者的家系圖譜

1.2主要的儀器與試劑 XS-800i全血細(xì)胞分析儀及配套試劑(日本Sysmex公司)；全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀及配套試劑(法國Sebia公司)；KingFisher Flex核酸提取儀(美國賽默飛公司)；PCR擴(kuò)增儀和凝膠成像系統(tǒng)(德國耶拿分析儀器公司)；電泳儀(美國 Bio-Rad公司)；5430 小型臺(tái)式高速離心機(jī)(德國Eppendorf 公司)；YN-H16 恒溫雜交儀和珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測試劑盒(深圳亞能公司)；核酸提取試劑(廣州美基生物公司)。

1.3血液學(xué)分析 按照XS-800i全血細(xì)胞分析儀及及配套試劑說明書操作檢測RBC、Hb、MCV、MCH等血液學(xué)參數(shù)，RBC參考范圍：(3.5～5.5)×1012/L，Hb參考范圍：110～160 g/L，MCV參考范圍：82～96 fL，MCH參考范圍：27～32 pg。按照全自動(dòng)毛細(xì)管血紅蛋白電泳儀及配套試劑說明書操作檢測Hb A、Hb A2以及Hb F等參數(shù)。HbA參考范圍：94.5%～96.5%，Hb A2參考范圍：2.5%～3.5%，Hb F參考范圍：0.26%～2.3%。

1.4突變位點(diǎn)檢測

1.4.1DNA提取 采集先證者以及父母就診時(shí)的空腹靜脈血各1 mL，EDTA-K2抗凝，充分混勻。取200 μL抗凝血，采用磁珠法，按照KingFisher Flex核酸提取儀及核酸提取試劑說明書操作提取DNA。取吸光度(A260/280 nm)為1.8～2.0的樣本用于后續(xù)試驗(yàn)，樣本置-20 ℃保存。

1.4.2PCR-RDB法檢測 采用Gap-PCR法以及PCR-RDB法，按照PCR擴(kuò)增儀及珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測試劑盒說明書操作進(jìn)行PCR擴(kuò)增及結(jié)果判讀，檢測常規(guī)17種β珠蛋白基因突變類型[-28、-29、-30、-32、CD14-15、CD17、CD26(βE)、CD27-28、CD31、CD41-42、CD43、CD71-72、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、IVS-Ⅱ-654、CAP+1、起始密碼子(initiation condon)]，排除合并常見α缺失(-α4.2、-α3.7、--SEA)以及常見α突變[αWS(CD122)，CAC-CAG；αQS(CD125)，CTG-CCG；αCS(CD142)，TAA-CAA]。

1.4.3Sanger測序 取先證者及其母親的靜脈血標(biāo)本500 μL，送深圳亞能公司進(jìn)行Sanger測序。測序結(jié)果與野生型序列進(jìn)行對比分析，以確定是否存在堿基突變。

2 結(jié)果

2.1該家系血常規(guī)檢測結(jié)果 先證者抗感染后表現(xiàn)為中度貧血；其父親無貧血癥狀；其母親表現(xiàn)為輕度貧血(表1)。

表1 先證者及其父母的血液學(xué)分析結(jié)果

2.2該家系PCR-RDB法檢測結(jié)果 先證者基因型為βIVS-Ⅱ-654(C>T)/βN，其父親基因型為βN/βIVS-Ⅱ-654(C>T)，其母親未見突變。

2.3該家系Sanger測序檢測結(jié)果 先證者Sanger測序結(jié)果為β基因上存在雙重雜合突變，α基因未見突變。其母親Sanger測序結(jié)果為β基因上存在1個(gè)罕見突變，α基因未見突變。測序結(jié)果見圖2。根據(jù)血常規(guī)以及血紅蛋白電泳的結(jié)果，其父親未進(jìn)行測序檢測。

3 討論

中間型β地貧常見的基因型為β0/β+或者β+/β+，臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性，輕癥者僅表現(xiàn)為輕度貧血，重癥者需常年輸血[5]。本研究發(fā)現(xiàn)的-86(C>A)突變位于高度保守的近端啟動(dòng)子CACCC序列，此序列是EKLF(erythroid Krüppel-like factor)的紅細(xì)胞特異性結(jié)合位點(diǎn)。EKLF作為一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在紅細(xì)胞生成和β珠蛋白轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)中具有重要的作用。研究表明，該位點(diǎn)突變可破壞EKLF的結(jié)合，從而引起輕型β地貧(β+)[6]。此外，IVS-Ⅱ-654也可引起輕型β地貧(β+)，本例先證者(β+/β+)平日血常規(guī)表現(xiàn)為中度貧血，至本院初診時(shí)因?yàn)榇嬖诟腥厩闆r，表現(xiàn)為重度貧血，感染控制后恢復(fù)為中度貧血。另有文獻(xiàn)報(bào)道-86(C>G)純合子(β+/β+)僅表現(xiàn)為輕度貧血[7]。而本例先證者(β+/β+)表現(xiàn)為中度貧血，表明臨床表型不僅僅取決于基因型，還可能與種族差異性和遺傳修飾有關(guān)[8]。

筆者進(jìn)一步行流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，先證者的母親籍貫為安徽，居住地為江蘇徐州，均不屬于地貧高發(fā)區(qū)，故而輕度貧血癥狀在其懷孕期間并未引起重視。先證者出生后在居住地醫(yī)院就診時(shí)也是首先考慮為缺鐵性貧血進(jìn)行治療。有學(xué)者報(bào)道，HbA2在篩查輕型β地貧中具有較高的敏感性和特異性[9-10]。故而推測，先證者母親如果早期進(jìn)行Hb電泳檢查，或可發(fā)現(xiàn)HbA2升高，并結(jié)合其父親的地貧結(jié)果，從而進(jìn)行產(chǎn)前診斷。本例先證者的HbA2表達(dá)水平升高，與常規(guī)檢出的輕型地貧類型相符，但是其HbF為28%，提示可能是中間型地貧。目前臨床上常規(guī)的地貧基因檢測試劑盒不能覆蓋所有的中國人突變類型。隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步，可檢測到的突變類型尤其是一些稀有類型突變逐年增加[11]。但目前測序技術(shù)價(jià)格昂貴，仍然無法普及至邊遠(yuǎn)地區(qū)，所以要重視血常規(guī)以及血紅蛋白電泳等地貧篩查，如發(fā)現(xiàn)基因型與表型不一致的情況下，要做進(jìn)一步檢測，以避免漏診。

注：A，先證者-86(C>A)HBB:c.-136C>A；B，先證者IVS-Ⅱ-654(C>T)HBB:c.316-197C>T;C,先證者母親-86(C>A)HBB:c.-136C>A。

圖2 該家系β珠蛋白基因Sanger測序結(jié)果