盧曉莉，成樂楠，秦方圓，趙子儀，葛利蔥，翟亞萍，楊秋云

(1.河南大學(xué)，河南 開封 475000；2.河南大學(xué)人民醫(yī)院/河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003；3.吉林大學(xué)，吉林 長春 130023；4.河南省眼科重點實驗室，河南 鄭州 450003)

卵巢癌是女性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮體癌，死亡率居婦科腫瘤死亡率的第1位，占女性惡性腫瘤死亡率的5%[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，2018年有將近30萬新增卵巢癌病例[3]。早期診斷困難，發(fā)病時70%～75%患者已處于晚期，5年生存率約為20%[4]。目前對卵巢癌的治療原則仍以手術(shù)為主，輔以化療、放療等綜合治療，但效果并不顯著。盡管卵巢癌治療在分子和細(xì)胞水平已經(jīng)取得了實質(zhì)性的進(jìn)展，但研究表明，其晚期疾病的長期存活率幾乎沒有提高[5]。卵巢癌的診治仍需進(jìn)一步研究。因此，為研究人類卵巢癌生物學(xué)行為和抗腫瘤實驗性治療，需建立卵巢癌的動物模型。盡管國內(nèi)外有較多成功建立卵巢癌移植瘤的模型[6-7]，但對小鼠模型建立的具體方法及成瘤情況的相關(guān)報道并不多，且各項研究中腫瘤細(xì)胞系的選擇，具體接種細(xì)胞數(shù)量均不同。本研究采用人卵巢癌SKOV3懸浮細(xì)胞液皮下注射接種法構(gòu)建裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，動態(tài)觀察記錄裸鼠成瘤情況并探討移植瘤可用于實驗的時機(jī)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、胰酶(美國Gibco公司)、雙抗青鏈霉素(美國Hyclone公司)、PBS緩沖液(美國Hyclone公司)、血清(美國Gibco公司)；儀器：巴氏管、15 mL離心管、離心機(jī)、酒精燈、培養(yǎng)箱、細(xì)胞計數(shù)板等。

1.2 實驗動物及細(xì)胞SKOV3細(xì)胞株：購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司，培養(yǎng)于DMEM/F12完全培養(yǎng)基中(即含10%FBS，1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，5 mL培養(yǎng)基/25 cm2培養(yǎng)瓶)，置于5% CO2、37 ℃、95%飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每48 h換液1次，細(xì)胞融合度達(dá)80%后進(jìn)行1∶3傳代。裸鼠：BALB/c Nude鼠，雌性，5～6周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物公司，飼養(yǎng)于河南省中藥研究所，生長所需的墊料、飼料和飲水均經(jīng)滅菌處理，高效過濾器每小時換氣10～15次，相對濕度保持在45%～60%，每日保持10 h的光照，14 h無光的陰暗周期。

1.3 人卵巢癌移植瘤模型的建立將培養(yǎng)中處于對數(shù)生長的SKOV3細(xì)胞經(jīng)2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后，用PBS緩沖液洗滌，調(diào)整活細(xì)胞濃度為2×107個·mL-1，于每只裸鼠背部皮下接種0.2 mL(每只4×106個細(xì)胞)。穿刺點距離注射部位1.0 cm，每只裸鼠皮下接種1點，次日記為接種第1天。

1.4 裸鼠生活情況及腫瘤生長情況觀察裸鼠接種腫瘤細(xì)胞后繼續(xù)于SPF級層流室內(nèi)飼養(yǎng)，每天觀察其精神、活動、攝食等狀況，是否有腫瘤生長和腫瘤生長速度等。每3 d測量1次荷瘤裸鼠體質(zhì)量，每3 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤結(jié)節(jié)的長徑、短徑，根據(jù)公式：體積=1/2×長×寬2，計算結(jié)節(jié)體積，并做詳細(xì)記錄，比較各組間腫瘤大小的差異。觀察結(jié)束后，采用二氧化碳安樂死自動儀，將裸鼠安樂死，連同包膜完整剝離出腫瘤組織，對瘤體體質(zhì)量進(jìn)行稱量。

1.5 移植瘤病理觀察將完整剝除的移植瘤組織用40 g·L-1的甲醛溶液進(jìn)行常規(guī)固定，制備石蠟包埋切片，制作常規(guī)4 μm切片，進(jìn)行HE染色；常規(guī)無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠成瘤情況及腫瘤生長情況接種SKOV3細(xì)胞前，實驗組裸鼠的體質(zhì)量、精神、活動等情況與對照組無明顯差異。實驗組裸鼠體質(zhì)量為(19.47±0.74)g，對照組裸鼠體質(zhì)量為(19.53±0.64)g，兩組裸鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。實驗組中有1只裸鼠在觀察期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯的移植瘤體出現(xiàn)，余14只裸鼠接種第3～7天在裸鼠接種部位可見或可觸及皮下結(jié)節(jié)質(zhì)硬，成瘤率為93.33%。整個觀察期內(nèi)，實驗組裸鼠的體質(zhì)量、精神、活動等情況與對照組對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。觀察期間未見瘤體表面皮膚破潰，直至42 d觀察結(jié)束當(dāng)天發(fā)現(xiàn)2例瘤體表面皮膚破潰。整個觀察期間，瘤體體積隨時間逐漸增大，接種30 d時可見腫瘤體積明顯增大。見表1。整個觀察期處死裸鼠后完整剝離瘤體，測得腫瘤質(zhì)量(0.88±0.19)g。

表1 不同時間瘤體體積

2.2 裸鼠移植瘤大體觀察及病理形態(tài)觀察大體觀察移植瘤呈圓形或橢圓形，表面未破潰的移植瘤與周圍組織輕度粘連，容易剝離。但出現(xiàn)破潰的2個移植瘤與瘤體皮膚粘連密切，剝離較困難。腫塊質(zhì)地中等，將瘤體切開，剖面呈魚肉狀，有分葉，色灰白，有4例體積較大的移植瘤中央?yún)^(qū)域可見壞死液化。HE染色后光學(xué)顯微鏡觀察可見腫瘤細(xì)胞豐富，排列密集，細(xì)胞異型性明顯，核大深染，細(xì)胞核質(zhì)比例明顯增大，畸形核和核分裂相多見。細(xì)胞內(nèi)可見大量空泡，少數(shù)細(xì)胞核固縮，裂解，偶見凋亡細(xì)胞。腫瘤組織內(nèi)有較多壞死組織和炎癥細(xì)胞浸潤，纖維化形成明顯。見圖1。

圖1 裸鼠移植瘤組織HE染色(×200)

3 討論

裸鼠腫瘤模型作為人類研究腫瘤生物學(xué)特性以及臨床治療的實驗?zāi)Ｐ?，其可以保留原發(fā)腫瘤本身的形態(tài)特征及遺傳性[8]。卵巢癌動物模型是探索人卵巢癌生物學(xué)特征、治療方法或評估療效的重要研究工具。目前，卵巢癌動物模型的制備主要包括誘發(fā)性腫瘤模型和移植性腫瘤模型。移植性腫瘤模型的建立大多采用皮下注射法[9]和腹腔注射法[10-11]。岳靜等[12]比較了人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤、腹水瘤和原位移植瘤模型，認(rèn)為3種模型從不同方面體現(xiàn)了人卵巢癌的生物學(xué)特點，成瘤率分別為100%、100%、90%；雖然人卵巢癌原位模型較皮下移植瘤更客觀地反映了腫瘤的生物學(xué)特征，但操作困難，耗時，難度大，成瘤率低。本研究采用了卵巢癌SKOV3細(xì)胞懸液皮下注射接種法，操作簡單方便，接種部位在裸鼠右側(cè)肩胛背部，易于觀察和測量，同時能避免裸鼠撓抓。

本研究中有1只裸鼠移植失敗，可能是因為一次性接種15只裸鼠，處理好的腫瘤細(xì)胞不能及時接種至裸鼠體內(nèi)或接種時腫瘤細(xì)胞分布不均所致。在整個觀察期荷瘤小鼠的體質(zhì)量與對照組無明顯差異，但如果去除瘤體體質(zhì)量，荷瘤裸鼠的體質(zhì)量相對對照組較低。本研究結(jié)果顯示，在接種第30天，腫瘤體積明顯增大，且30 d后腫瘤體積增大速度較快。本實驗有2例瘤體表面皮膚出現(xiàn)破潰，在剝離時發(fā)現(xiàn)與皮膚粘連致密，很顯然這樣的荷瘤鼠不是進(jìn)行實驗研究的較好選擇，而且在解剖時發(fā)現(xiàn)有些體積較大的瘤體內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)液化壞死現(xiàn)象，這可能與瘤體生長過快有關(guān)。但30 d前裸鼠的瘤體過小，不宜實驗。因此，進(jìn)行下一步實驗探究時應(yīng)選擇體積在100～450 mm3之間較為適宜。

本實驗結(jié)果顯示，SKOV3細(xì)胞株在裸鼠右側(cè)肩胛背部生長良好，所有裸鼠在觀察期內(nèi)未出現(xiàn)明顯惡病質(zhì)和意外死亡。如果研究卵巢癌生物學(xué)特性或評估藥物療效，在卵巢癌原位移植瘤難以建立時，將SKOV3細(xì)胞株接種于裸鼠右側(cè)肩胛皮下部位是可行的。移植瘤組織符合人卵巢癌細(xì)胞的病理學(xué)特征，具有操作簡單，成瘤時間短，成瘤率高，易于觀察等優(yōu)點，是較為實用的臨床癌動物模型，為后續(xù)體內(nèi)卵巢癌的基礎(chǔ)研究、臨床治療提供了可靠的依據(jù)。