吳姍姍 王柏山 嚴(yán) 峰 張 寧 張 程 李志靜

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，沈陽 110032)

肺癌是目前世界最常見的癌癥類型，占全部癌癥病例的11.6%，并且是癌癥相關(guān)性死亡的主要原因[1]。這些足以證明肺癌的巨大危害，世界衛(wèi)生組織基于生物學(xué)特性、治療和預(yù)后等因素，將肺癌主要?jiǎng)澐譃閮纱箢?，即非小?xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(smal cell lung cancer，SCLC)，NSCLC更加常見占所有肺癌病例的80%以上[2]，NSCLC包括鱗癌、腺癌、腺鱗癌和大細(xì)胞肺癌等。盡管在過去的幾十年已經(jīng)研發(fā)多種化療方案，但是多數(shù)NSCLC仍會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)[3]。近年來眾多研究發(fā)現(xiàn)扶正抗癌方聯(lián)合化療，能有效增加化療藥物敏感性并減低其毒副作用[4,5]。扶正抗癌方能扶正補(bǔ)虛和抗癌抑瘤，提高患者的免疫功能但具體機(jī)制尚不清楚。CD8+T細(xì)胞又稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cell，CTL)，是體內(nèi)免疫監(jiān)視腫瘤細(xì)胞的主要細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞也可表達(dá)一些NK相關(guān)受體，如活化性受體NKG2D和抑制性受體NKG2A等，通過識(shí)別靶細(xì)胞上相應(yīng)的配體傳遞抑制或活化信號(hào)，抑制與活化信號(hào)疊加，最終決定CD8+T細(xì)胞能否殺傷靶細(xì)胞[6]。Vivier等[7]的研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞上的NKG2D是作為TCR激活的一個(gè)重要共刺激分子。而且結(jié)腸癌患者的CD8+T細(xì)胞可以分別通過TCR或NKG2D受體識(shí)別自體和同種異體的腫瘤細(xì)胞[8]。Ⅲ/Ⅳ期食道癌患者的CD8+T細(xì)胞表達(dá)NKG2D顯著低于Ⅰ/Ⅱ期患者，與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[9]。有報(bào)道稱由CTL介導(dǎo)的腫瘤殺傷機(jī)制主要依賴于穿孔素和顆粒酶[10]。CD8+T細(xì)胞表面表達(dá)CD107a是其激活誘導(dǎo)脫顆粒的標(biāo)志[11]?？乖磻?yīng)性T細(xì)胞可分泌IFN-γ和TNF-α等多種細(xì)胞因子，上述細(xì)胞因子可加強(qiáng)CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷的敏感性[12]。因此顆粒酶、CD107a和IFN-γ可作為評(píng)價(jià)CD8+T細(xì)胞細(xì)胞毒活性的指標(biāo)。本研究旨在通過觀察非小細(xì)胞肺癌患者服用扶正抗癌方前后CD8+T細(xì)胞表達(dá)NKG2D和NKG2A與其細(xì)胞毒活性的相關(guān)性，初步探索扶正抗癌方的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象 本研究通過本院倫理委員會(huì)審批以及患者的知情同意。選擇我院2018年5月至2019年1月期間收治的有病理學(xué)明確診斷的NSCLC晚期患者31例，其中男性18例，女性13例；年齡35～79歲，平均年齡(45.5±3.8)歲，其中鱗癌14例，腺癌17例；TNM分期Ⅲa期8例，Ⅲb期11例，Ⅳ期12例。上述患者為治療組，根據(jù)服用扶正抗癌方前后分別定義為治療前組和治療后組。

1.1.2病例入選標(biāo)準(zhǔn) 入選標(biāo)準(zhǔn)：①患者符合原發(fā)性NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]且無其他腫瘤史；②患者不伴發(fā)自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性骨關(guān)節(jié)病等；③患者未服用激素類藥物或接受免疫抑制劑的治療；④除外活動(dòng)性(病毒)感染。Karnofsky評(píng)分≥70分。選擇與患者性別年齡相匹配的健康人21例即健康對(duì)照組，其中男11例，女10例；年齡32～77歲，平均(42.3±3.5)歲。

1.2方法

1.2.1藥物干預(yù) 治療組服用院內(nèi)扶正抗癌方(基本組成：苦參15 g，生白術(shù)12 g，生甘草5 g，半夏15 g，大貝20 g，半枝蓮15 g，白花蛇草30 g，茯苓20 g，陳皮15 g，生苡仁30 g)。辨證加減：反復(fù)咳嗽并痰中帶血可加三七和仙鶴草等；胸痛者可加枳殼、香附、延胡索等；陰虛者可加沙參和麥冬等；陽虛者加巴戟天、肉蓯蓉和杜仲等。上述中藥由我院藥房提供并按正規(guī)流程制備，每日一劑水煎至150 ml，每日3 次，連續(xù)服用30日為一個(gè)療程。

1.2.2T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量檢測 完全依照1997年美國CDC頒布的《CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值檢測指導(dǎo)方法》嚴(yán)格執(zhí)行。具體步驟：將20 μl CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP試劑加入BD公司TruCOUNT管中，逆向加樣法加入50 μl EDTA抗凝血，室溫避光15 min，加入經(jīng)10倍稀釋的免洗溶血素450 μl，室溫避光15 min，樣本溶血充分后采用流式細(xì)胞儀FACSCalibur檢測，MULTISET 軟件進(jìn)行分析。

1.2.3CD8+T細(xì)胞表面NKG2D和NKG2A的表達(dá) 具體步驟：采用熒光標(biāo)記的單克隆抗體組合CD3 PE-Cy7/CD8 Percp-Cy5.5/NKG2D APC/NKG2A PE 對(duì)治療組和健康對(duì)照組的外周靜脈血進(jìn)行表面染色，即每個(gè)研究對(duì)象均有一管按上述組合染色的樣本管，另設(shè)一管同型對(duì)照管。樣本管內(nèi)加入100 μl EDTA抗凝全血，按上述組合的單克隆抗體分別加入樣本管內(nèi)，室溫避光25 min后加入溶血素3 ml，繼續(xù)室溫避光8 min溶血充分后，300 g離心10 min棄上清。加入3 ml PBS進(jìn)行洗滌，室溫下300 g離心10 min后棄上清，共洗滌2次。最終加入含有1%多聚甲醛的PBS 200 μl懸浮，采用BD FACSCalibur的CellQuest軟件檢測，F(xiàn)lowJo7.6軟件分析。

1.2.4CD8+T淋巴細(xì)胞體外功能檢測 具體步驟：使用Ficoll-Hypaque通過密度梯度離心法，提取外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液將PBMC的濃度調(diào)整為2.0×105ml-1，加入50 ng/ml的PMA和1 μg/ml的離子霉素，加入抗 CD107a 抗體和GolgiStop，在96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)孔板底部加入100 μg/ml的鏈霉素和100 U/ml的青霉素。37℃ 5% CO2濃度的培養(yǎng)箱共同孵育4 h。用抗體組合CD3-PE/CD8-Percp進(jìn)行表面染色。使用BD Cytofix/CytopermTMFixation/Permeabilization Kit在4℃破膜30 min，4℃下進(jìn)行胞內(nèi)染色 IFN-γ-FITC和granzyme B-FITC避光30 min，最終用含有1%多聚甲醛的PBS 200 μl懸浮。采用FACSCalibur的CellQuest軟件檢測，F(xiàn)lowJo7.6軟件分析。

1.2.5生存質(zhì)量評(píng)價(jià) 根據(jù)Karnofsky評(píng)分評(píng)價(jià)患者的生存質(zhì)量。降低：比治療前評(píng)分減少≥10分；平穩(wěn)：治療前后評(píng)分變化幅度≤10分；提升：比治療前評(píng)分升高≥10分[14]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用中位數(shù)的95%可信區(qū)間表示。各組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，篩選影響因素采用有序多元Logistic回歸分析，相關(guān)性采用Spearman 秩相關(guān)檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CD4+T和CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值在NC組、治療前組和治療后組的差異 NC組的CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值顯著高于治療前組和治療后組(P<0.01)；治療前組和治療后組的CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值無顯著性差異，見表1。NC組的CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值顯著高于治療前組和治療后組(P<0.01)；治療后組的CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值顯著高于治療前組(P<0.01)，見表1和圖1A。

2.2CD8+T細(xì)胞表面NKG2D+和NKG2A+的百分比在NC組、治療前組和治療后組表達(dá)的差異

2.2.1NC組的NKG2D+CD8+T細(xì)胞的百分比顯著高于治療前組和治療后組(P<0.01)；治療后組顯著高于治療前組(P<0.05),見表1和圖1B。

2.2.2NC組的NKG2A+CD8+T細(xì)胞的百分比顯著低于治療前組(P<0.01)；NC組也顯著低于治療后組(P<0.05)；而治療前組和治療后組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1和圖1C。

2.3NC組、治療前組和治療后組CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD107a、顆粒酶B以及分泌IFN-γ占百分比

2.3.1治療前組CD107a+CD8+T細(xì)胞的百分比顯著低于NC組(P<0.01)；治療后組CD107a+CD8+T細(xì)胞的百分比也顯著低于NC組(P<0.01)；但是治療前組和治療后組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1、圖2A。

2.3.2治療前組Granzyme B+CD8+T細(xì)胞的百分比顯著低于NC組(P<0.01)；治療后組Granzyme B+CD8+T細(xì)胞的百分比也顯著低于NC組(P<0.01)；但是治療前組和治療后組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1、圖2B。

2.3.3治療前組IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的百分比顯著低于NC組(P<0.01)；治療后組IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的百分比顯著低于NC組(P<0.01)；治療后組IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的百分比顯著高于治療前組(P<0.01)，見表1、圖2C。

2.4治療前組和治療后組相關(guān)性分析

2.4.1在治療前組，NKG2D+CD8+T與CD107a+CD8+T細(xì)胞的百分比呈正相關(guān)(P<0.05，r=0.39),見圖3A；NKG2D+CD8+T與IFN-γ+CD8+T的百分比呈正相關(guān)(P<0.05，r=0.38),見圖3B。

2.4.2在治療后組，NKG2D+CD8+T與CD107a+CD8+T細(xì)胞的百分比呈正相關(guān)(P<0.01，r=0.49),見圖4A；NKG2D+CD8+T與Granzyme B+CD8+T細(xì)胞的百分比呈正相關(guān)(P<0.05，r=0.38),見圖4B；NKG2D+CD8+T與IFN-γ+CD8+T的百分比呈正相關(guān)(P<0.05，r=0.36),見圖4C。

2.5治療后生存質(zhì)量評(píng)價(jià) 31例患者治療前后Karnofsky評(píng)分的變化，其中7例患者評(píng)分升高≥10分，占總體的22.0%；19例患者評(píng)分變化幅度≤10分，占總體的61.2%；5例患者評(píng)分減少≥10分，占總體的16.1%。83.9%的患者治療后生存質(zhì)量都穩(wěn)中有升。

表1 治療前、治療后和NC組各項(xiàng)指標(biāo)的比較(%,中位數(shù)的95%可信區(qū)間)

Tab.1 Comparison of indicators in pre-treatment group, post-treatment group and NC group (%,median and 95%CI)

GroupsnCD4+T(cells/μl)CD8+T(cells/μl)NKG2D+(%)NKG2A+(%)CD107a+CD8+T(%)Granzyme B+CD8+T(%)IFN-γ+CD8+T(%)Pre31449(268,623)347(241,437)2)87.5(77.6,90.0)2)9.2(3.7,15.1)2)33.3(26.5,38.8)2)6.4(3.7,7.2)2)13.5(5.4,16.5)2)Post31495(343,672)426(366,547)2)89.9(83.2,93.7)2)5.6(2.6,10.9)1)34.6(29.0,39.8)2)6.5(5.2,8.5)2)17.9(11.5,22.7)2)NC21946(746,1138)679(527,863)95.4(92.2,97.1)2.9(2.2,4.9)50.9(45.3,55.5)28.8(25.5,32.0)56.3(51.1,60.0)

Note:Compared with NC group，1)P<0.05，2)P<0.01.

圖1 治療前組、治療后組和NC組CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值、NKG2D+CD8+T(%)、NKG2A+CD8+T(%)Fig.1 Percentage of NKG2D+CD8+T cells，NKG2A+CD8+T cells and absolute counts of CD8+T cells among pre-treatment group,post-treatment group and NC groupsNote: A.Ccomparison of the absolute counts of CD8+T cells;B.Percentage of NKG2D+CD8+T cells;C.The percentage of NKG2A+CD8+T cells.

圖2 治療前組、治療后組和NC組的CD107a+CD8+T(%)、Granzyme B+CD8+T(%)、IFN-γ+CD8+T(%)Fig.2 Percentage of CD107a+CD8+T cells,Granzyme B+CD8+T cells,IFN-γ+CD8+T cells among pre-treatment group,post-treatment group and NC groupNote: A.Percentage of CD107a+CD8+T cells;B.Percentage of Granzyme B+CD8+T cells;C.Percentage of IFN-γ+CD8+T cells.

圖3 NSCLC患者治療前組的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of pre-treatment group in patients with NSCLCNote: A.The correlation of the percentage of NKG2D+CD8+T cells and percentage of CD107a+CD8+T cells in pre-treatment group;B.The correlation of the percentage of NKG2D+CD8+T cells and percentage of IFN-γ+CD8+T cells in pre-treatment group.

圖4 NSCLC患者治療后組的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of post-treatment group in patients with NSCLCNote: A.The correlation of the percentage of NKG2D+CD8+T cells and percentage of CD107a+CD8+T cells in post-treatment group;B.The correlation of the percentage of NKG2D+CD8+T cells and percentage of Granzyme B+CD8+T cells in post-treatment group;C.The correlation of the percentage of NKG2D+CD8+T cells and percentage of IFN-γ+CD8+T cells in post-treatment group.

表2 有序多元logistic回歸分析

Tab.2 Ordered multiple logistic regression analysis

ItemsRegressioncoefficientSEWaldORP95%CINKG2D+(%)0.1550.0626.3021.20.0121.03-1.32NKG2A+(%)0.0580.0580.9881.10.3201.05-1.19CD107a+(%)0.0270.1290.0441.00.8341.25-1.32Granzyme B+(%)0.3060.3760.6641.40.4151.36-2.84IFN-γ+(%)0.1440.0763.6161.20.0571.00-1.34

2.6有序多元Logistic回歸分析 建立有序多元Logistic回歸模型，以NKG2D+、NKG2A+、CD107a+、Granzyme B+、IFN-γ+CD8+T的百分比為協(xié)變量，以服用扶正抗癌方后生存質(zhì)量評(píng)價(jià)由降低、平穩(wěn)至提升的不同等級(jí)作為因變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示NKG2D+CD8+T的百分比的升高與治療后生存質(zhì)量評(píng)價(jià)等級(jí)的提升有關(guān)(P<0.05，見表2)；IFN-γ+CD8+T的百分比的升高可能與治療后生存質(zhì)量評(píng)價(jià)等級(jí)的提升有關(guān)(P=0.057，見表2)，其他因素暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)與治療后生存質(zhì)量評(píng)價(jià)等級(jí)的提升有關(guān)。

3 討論

肺癌因虛得病，因虛致實(shí)。肺癌患者正氣虛損突出，應(yīng)始終重視顧護(hù)正氣。臨床上扶正抗癌方常聯(lián)合手術(shù)、放化療、靶向治療等治療晚期肺癌，大量研究證實(shí)可明顯改善晚期患者的生存質(zhì)量、機(jī)體免疫力，并提升放化療效敏感性減少其毒副作用[4,5]。中醫(yī)的正氣理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的免疫理論有相通之處但不可等同，本研究旨在探索NSCLC晚期患者CD8+T細(xì)胞表達(dá)NKG2D和NKG2A受體與其細(xì)胞毒活性的關(guān)聯(lián)。

眾多研究表明，CTL能夠有效抑制惡性實(shí)體瘤的生長[15]。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC晚期患者CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值顯著低于NC組，應(yīng)用扶正抗癌方后CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值較治療前明顯升高，有利于抑制患者體內(nèi)腫瘤的生長。腫瘤浸潤的NKG2D+CD8+T細(xì)胞可以識(shí)別并消除表達(dá)NKG2D配體的腫瘤細(xì)胞[16]。有研究發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞表達(dá)NKG2D水平可用于判斷胃癌的預(yù)后，NKG2D表達(dá)下降可能是腫瘤發(fā)生免疫逃逸的機(jī)制[17]。本研究發(fā)現(xiàn)治療前組和治療后組NKG2D+CD8+T細(xì)胞的百分比均顯著低于NC組，治療后組較治療前組NKG2D+CD8+T細(xì)胞的百分比顯著升高。NKG2A是含有酪氨酸抑制性基序的NK相關(guān)性受體，既表達(dá)于NK細(xì)胞又表達(dá)于T細(xì)胞[18]。NKG2A/CD94形成的異二聚體可與人類非經(jīng)典的MHCⅠ類分子復(fù)合物HLA-E結(jié)合，傳導(dǎo)抑制信號(hào)從而抑制NK和CD8+T細(xì)胞的活性[19]。最新研究發(fā)現(xiàn)：阻斷CD8+T細(xì)胞表面的NKG2A受體，可以提高機(jī)體對(duì)治療性腫瘤疫苗的臨床反應(yīng)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)治療前和治療后組NKG2A+CD8+T細(xì)胞的百分比均顯著高于NC組，治療前和治療后組無顯著性差異。服用扶正抗癌方后較治療前NKG2A+CD8+T細(xì)胞的百分比雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異但有下降的趨勢，可能是由于本研究納入的樣本量偏小。

CD107a通常不存在于T 細(xì)胞的表面，只有細(xì)胞活化脫顆粒后才暴露于細(xì)胞表面，可作為CD8+T細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)志[21]。顆粒酶B主要存在于CTL的顆粒內(nèi)，其破壞靶細(xì)胞需要依賴于穿孔素[22,23]。本研究發(fā)現(xiàn)治療前組和治療后組CD107a+CD8+T和Granzyme B+CD8+T細(xì)胞的百分比均顯著低于NC組，而治療前和治療后組卻無顯著性差異。說明NSCLC晚期患者CD8+T細(xì)胞的脫顆粒細(xì)胞毒活性即溶解腫瘤細(xì)胞的能力較健康人顯著下降。服用扶正抗癌方后 CD8+T細(xì)胞的脫顆?；钚噪m有小幅度升高，但并未產(chǎn)生顯著性差異可能是由于納入樣本量偏少。IFN-γ不僅可以誘導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞(APC)的提呈作用，還可以上調(diào)APC上的MHCⅠ/肽復(fù)合物，使抗原特異性CD8+T細(xì)胞再次活化和增殖，活化的腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞可識(shí)別腫瘤細(xì)胞并向其傳送致腫瘤細(xì)胞死亡劑量的細(xì)胞毒性分子[24]。因此IFN-γ是抗腫瘤和細(xì)胞內(nèi)病原體的關(guān)鍵細(xì)胞因子。本研究發(fā)現(xiàn)治療前和治療后組IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的百分比均顯著低于NC組，服用扶正抗癌方后較治療前IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的百分比顯著升高。上述結(jié)果表明扶正抗癌方能有效提升CD8+T細(xì)胞IFN-γ的釋放，有利于清除患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。

本研究發(fā)現(xiàn)無論是治療前還是治療后組NKG2D+CD8+T與IFN-γ+CD8+T的百分比均呈正相關(guān)，NKG2D+CD8+T與CD107a+CD8+T細(xì)胞的百分比也均呈正相關(guān)。在治療后組NKG2D+CD8+T與Granzyme B+CD8+T細(xì)胞的百分比呈正相關(guān)。上述結(jié)果說明NSCLC晚期患者CD8+T細(xì)胞表達(dá)活化性受體NKG2D水平與其細(xì)胞毒活性呈正相關(guān)，服用扶正抗癌方后CD8+T細(xì)胞表達(dá)NKG2D和分泌IFN-γ顯著升高，說明扶正抗癌方確實(shí)可以明顯改善CD8+T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。與上述結(jié)果相對(duì)應(yīng)的患者服用扶正抗癌方后，83.9%的患者生存質(zhì)量評(píng)價(jià)穩(wěn)中有升，只有16.1%的患者生存質(zhì)量評(píng)價(jià)下降。Logistic回歸分析結(jié)果顯示服用扶正抗癌方后，NKG2D+CD8+T的百分比的升高與治療后生存質(zhì)量評(píng)價(jià)等級(jí)的提升有關(guān)。印證扶正抗癌方可以明顯改善CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性和患者的生存質(zhì)量。近年來興起的T細(xì)胞治療和NK細(xì)胞治療等免疫治療手段，已被證實(shí)聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)抗腫瘤的療效。為了獲得更好的療效也可以嘗試靶向治療等多種療法與扶正抗癌方的聯(lián)合應(yīng)用[25]。

綜上所述，NSCLC晚期患者遵循辨證施治原則，服用扶正抗癌方一個(gè)月后大部分患者生存質(zhì)量穩(wěn)中有升，相應(yīng)的CD8+T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量以及表達(dá)NKG2D和分泌IFN-γ均顯著升高，而且表達(dá)NKG2D升高與細(xì)胞毒活性提升呈正相關(guān)，所以扶正抗癌方有助改善患者預(yù)后和提高生活質(zhì)量。