張 軍 王彩蓮 陳 麗 陸褚楚

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院輸血科，蚌埠 233004)

新生兒同種免疫性血小板減少癥(neonatal alloimmune thrombocytopenia,NAIT)是由于母親對(duì)胎兒不相容的HPA產(chǎn)生同種血小板抗體，通過(guò)胎盤輸入胎兒致使胎兒血小板被致敏清除，從而引起胎兒血小板減少的一種疾病[1]。該病在高加索人群中的發(fā)病率約為0.10%，其抗體主要為針對(duì)HPA-1a的抗體，在日本人群中發(fā)病率約為0.15%，其抗體主要為針對(duì)HPA-5b的抗體[2，3]。對(duì)抗-HPA抗體陽(yáng)性孕婦，可于孕12～20周靜注IgG或在后期結(jié)合激素治療來(lái)預(yù)防NAIT的發(fā)生[4]。對(duì)于產(chǎn)后NAIT新生兒，視其血小板計(jì)數(shù)結(jié)果和臨床癥狀的嚴(yán)重程度進(jìn)行靜脈IgG注射或血小板輸注治療[4，5]。由于不同地區(qū)之間血小板表面抗原HLA及HPA的抗原表型頻率相差很大，導(dǎo)致不同地區(qū)血小板抗體的產(chǎn)生情況、抗體抗原特異性以及NAIT的發(fā)病情況也存在著很大的差異；而目前中國(guó)人群孕婦關(guān)于血小板抗體(包括抗-HLA抗體和抗-HPA抗體)的陽(yáng)性率、NAIT的發(fā)病情況及抗體陽(yáng)性孕婦所產(chǎn)新生兒罹患NAIT的比例等基線數(shù)據(jù)仍為空白，現(xiàn)有國(guó)外的數(shù)據(jù)無(wú)法指導(dǎo)是否需要在我國(guó)開展孕婦血小板抗體產(chǎn)前篩查項(xiàng)目。因此，本研究對(duì)皖北地區(qū)孕婦孕期血小板抗體產(chǎn)生情況進(jìn)行檢測(cè)分析，為評(píng)價(jià)我國(guó)孕婦產(chǎn)前進(jìn)行血小板抗體篩查的必要性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象 選取2016年12月至2017年12月在我院進(jìn)行產(chǎn)檢的孕12～40周孕婦 1 025例，年齡18～44歲，初次妊娠者410例，年齡18～34歲，多次妊娠者615例，年齡22～44歲，其中有2次妊娠史者388例，3次妊娠史者188例，4次及以上妊娠史者89例。所有孕婦均簽署書面知情同意書，并記錄孕婦產(chǎn)檢時(shí)的血小板計(jì)數(shù)。

1.1.2試劑與儀器 MASPAT血小板抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自荷蘭Sanquin公司(8000236956、8000240957、8000243453)，GTI血小板抗體檢測(cè)試劑盒(3005907)購(gòu)自北京博富瑞基因診斷技術(shù)有限公司，人類血小板同種抗原HPA基因分型試劑盒(201709005)、HLA-ABDRDQ基因分型中分辨測(cè)定試劑盒(201709005)購(gòu)自天津秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司，核酸提取試劑盒購(gòu)自天隆科技有限公司，瓊脂糖購(gòu)自西班牙BIOWEST公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司，洗板機(jī)購(gòu)自濟(jì)南康堃醫(yī)療器械有限公司，普通PCR儀(ABI9700)購(gòu)自美國(guó)ABI公司，電泳儀(JY300C)購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，電泳槽(JY-SP3)購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，凝膠成像系統(tǒng)(GenoSens1860)購(gòu)自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本制備 采集孕婦的外周靜脈血于EDTA抗凝采血管中，4 000 r/min離心10 min，用一次性移液管將血清移入EP管，血細(xì)胞保存于真空采血管中，EP管和真空采血管置于-86℃冰箱中保存。

1.2.2血小板抗體篩查 ①使用前將所有試劑恢復(fù)至室溫。②操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。③目視判讀結(jié)果。指示紅細(xì)胞彌散分布于反應(yīng)孔底部為陽(yáng)性，表明血清中存在血小板抗體；指示紅細(xì)胞聚集在反應(yīng)孔底部中央為陰性，表明血清中不存在血小板抗體。④對(duì)于陽(yáng)性標(biāo)本需重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，并按照說(shuō)明書用二磷酸氯喹破壞血清中的HLA抗體，然后對(duì)結(jié)果判讀：指示紅細(xì)胞彌散分布于反應(yīng)孔底部為陽(yáng)性，表明血清中存在抗-HPA抗體；指示紅細(xì)胞聚集在反應(yīng)孔底部中央為陰性，表明血清中不存在抗-HPA抗體。

1.2.3血小板抗體抗原特異性檢測(cè) ①用去離子水10倍稀釋洗脫液(1倍體積Conc.Wash+p倍體積去離子水)，混勻，每個(gè)微孔加250 μl稀釋后的洗脫液，室溫靜置10 min，甩干，倒扣于吸水紙上;②用稀釋液SD按照3∶1比例稀釋陰陽(yáng)性對(duì)照、患者血清。在陽(yáng)性對(duì)照孔、陰性對(duì)照孔及患者血清孔中分別加入50 μl稀釋后的陽(yáng)性對(duì)照試劑、陰性對(duì)照試劑及患者血清，封膜，37℃水浴30 min，取出甩干，洗脫液洗板4次，最后1次結(jié)束后倒扣于吸水紙上；③用稀釋液SD按照100∶1比例稀釋抗-IgG(3 000 μl∶30 μl)，混勻，除去空白孔，每孔中加50 μl已稀釋的抗-IgG,封膜，37℃水浴30 min，取出甩干，洗板4次；④用0.5 ml去離子水溶解1瓶PNPP粉末，然后用底物緩沖液100∶1(6 000 μl∶60 μl)稀釋，除空白孔，每孔加100 μl已稀釋的PNPP，室溫(22～25℃)避光靜置30 min；⑤空白孔加200 μl終止液，其余孔加100 μl終止液；酶標(biāo)儀405 nm讀值，490 nm為參照波長(zhǎng)。結(jié)果判斷：(陰性對(duì)照孔的均值)×2=Cutoff 值，OD≥Cutoff 值即被判定為陽(yáng)性。

1.2.4DNA提取及PCR-SSP法檢測(cè)HLA、HPA基因型 ①DNA 的提取：凍存血室溫下溶解，振蕩混勻10 s，采用DNA提取試劑盒(201706002)從全血樣本中提取基因組DNA,具體操作過(guò)程詳見試劑說(shuō)明書。②HLA、HPA基因型：使用秀鵬生物HLA-ABDRDQ基因分型中分辨測(cè)定試劑盒在PCR儀器上對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，HLA基因與HPA基因擴(kuò)增參數(shù)如下：96℃ 2 min，96℃ 20 s，68℃ 60 s，96℃ 20 s，65℃ 50 s，72℃ 45 s，96℃ 20 s，55℃ 45 s，72℃60 s，72℃ 3 min，共37個(gè)循環(huán)，4℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，使用2.5%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳(150 V，10～15 min )。電泳結(jié)束后使用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，并根據(jù)試劑盒讀板紙對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行解讀。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1血小板抗體篩查結(jié)果分析 在1 025例孕婦中血小板抗體陽(yáng)性者共45例，總陽(yáng)性率為4.39%，其中41例為抗-HLA抗體陽(yáng)性，4例為抗-HLA抗體和抗-HPA抗體同時(shí)陽(yáng)性，抗-HLA抗體陽(yáng)性率為4.39%，抗-HPA抗體陽(yáng)性率為0.39%。45例血小板抗體陽(yáng)性孕婦年齡在25～44歲，妊娠次數(shù)1～5次，均未有血小板輸注史、血小板減少病史及自身免疫性疾病病史，其中有2例孕婦因?yàn)樨氀袘腋〖t細(xì)胞輸注史。4例抗-HPA抗體陽(yáng)性孕婦年齡均≥38歲，妊娠次數(shù)均≥3次，無(wú)血小板減少患兒生產(chǎn)史，在此4例孕婦中僅有1例被確定為抗-HPA-5b抗體陽(yáng)性，該孕婦年齡41歲，此次為第4次妊娠，順產(chǎn)1次，流產(chǎn)2次，無(wú)輸血史、血小板減少病史及自身免疫性疾病病史。

2.2血小板抗體的產(chǎn)生與妊娠次數(shù)相關(guān)性分析 初次妊娠孕婦與多次妊娠孕婦血小板抗體陽(yáng)性率比較，初次妊娠孕婦共410例，血小板抗體陽(yáng)性者6例，陽(yáng)性率為1.46%；多次妊娠孕婦共615例，血小板抗體陽(yáng)性者39例，陽(yáng)性率為6.34%。兩組數(shù)據(jù)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.95，P<0.05)。見表1。妊娠次數(shù)與血小板抗體陽(yáng)性率比較在有多次妊娠史孕婦中，有2次妊娠史者388例，血小板抗體陽(yáng)性者18例，陽(yáng)性率為4.64%；3次妊娠史者138例，陽(yáng)性者10例，陽(yáng)性率為7.25%；4次及4次以上者89例，陽(yáng)性者11例，陽(yáng)性率為12.36%。三組數(shù)據(jù)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.51，P<0.05)。見表2。

2.3抗-HLA抗體陽(yáng)性孕婦HLA-A、B、DR、DQ基

表1 初次妊娠與多次妊娠孕婦血小板抗體陽(yáng)性率比較

Tab.1 Comparison of platelet antibody positive rate in pregnant women with first pregnancy and multiple pregnancies

GroupsPositiveNegativeTotalPositive rate(%)First pregnancy64044101.46Multiple pregnancies395766156.34Total459801 0254.39

表2 血小板抗體陽(yáng)性率與妊娠次數(shù)相關(guān)性比較

Tab.2 Comparison of relationship between platelet antibody positive rate and pregnancy frequency

Number ofpregnanciesPositiveNegativeTotalPositiverate(%)2183703884.643101281387.25≥411788912.36Total395766156.34

圖1 瓊脂糖電泳圖Fig.1 Photographa of agarose electrophoresisNote: A.Sample hole;B.Internal parameter quality control hole;C.Positive typing hole;D.Primer dimer;Lane 1,3,7.Positive results;Lane 2,4,5,6,8.Negative result.

因分型結(jié)果 在抗-HLA抗體陽(yáng)性孕婦的HLA-A、B、DR、DQ基因分型結(jié)果中，見圖1、2。共檢出HLA特異性抗原位點(diǎn)53個(gè)，見表3。其中檢出HLA-A特異性抗原位點(diǎn)12個(gè)，頻率較高的特異性抗原有A2(0.274 2)、A24(0.225 8)、A11(0.145 2)、A33(0.112 9)，HLA-B特異性抗原位點(diǎn)22個(gè)，頻率較高的為B46(0.129 0)、B13(0.112 9)、B60(0.112 9)、B62(0.112 9)和B58(0.096 8)，HLA-DQ特異性位點(diǎn)7個(gè)，頻率較高的有DQ6(0.241 9)、DQ2(0.161 2)、DQ9(0.161 2)、DQ5(0.145 2)、DQ7(0.145 2)，HLA-DR特異性位點(diǎn)12個(gè)，頻率較高的有DR9(0.161 2)、DR4(0.145 2)、DR15(0.129 0)、DR7(0.096 8)、DR12(0.096 8)、DR13(0.096 8)。

2.4抗-HPA抗體陽(yáng)性孕婦的HPA1-17基因分型結(jié)果 在4例抗-HPA抗體陽(yáng)性孕婦中，有3例孕婦HPA1-17基因型組合為HPA-(1,2,4-14,16,17)aa-3ab-15ab(見圖3,其中HPA15擴(kuò)增孔中的高分子量條帶為參考基因，低分子量條帶為目的基因)，1例為HPA-(1, 2, 4-14,16,17)aa-3aa-15aa。其中確定抗-HPA-5b抗體陽(yáng)性孕婦的HPA1-17基因型組合為HPA-(1,2,4-14,16,17)aa-3ab-15ab。

2.5關(guān)于新生兒NAIT的發(fā)病情況 在隨后對(duì)1 025例孕婦的隨訪中，通過(guò)對(duì)新生兒出生后血小板計(jì)數(shù)情況(血小板計(jì)數(shù)均<150×109L-1)或者臨床表現(xiàn)(皮膚黏膜有瘀點(diǎn)、瘀斑或有顱內(nèi)出血)的觀察，未發(fā)現(xiàn)有新生兒發(fā)生NAIT。

圖2 HLA-A、B、DR、DQ基因分型瓊脂糖電泳圖Fig.2 Photographa of HLA-A，B，DR，DQ genotype agarose electrophoresisNote: HLA genotypes is A11/A24/B48/B54 DQ5/DQ9/DR9/DR14 accoding to the formula in the instruction.

表3 皖北地區(qū)抗-HLA抗體陽(yáng)性孕婦HLA-A、B、DR、DQ抗原頻率

Tab.3 HLA-A，B，DR，DQ antigen′s frequency of anti-HLA antibody positive pregnant women in North of Anhui Province

AntigenLocusFrequencyAntigenLocusFrequencyAntigenLocusFrequencyA2170.274 2B4510.016 1DQ590.145 2A320.032 2B4680.129 0DQ6150.241 9A1190.145 2B4820.032 2DQ790.145 2A1310.016 1B5010.016 1DQ850.080 6A2310.016 1B5120.032 2DQ9100.161 2A24140.225 8B5210.016 1DR120.032 2A2620.032 2B5420.032 2DR490.145 2A3040.064 5B5520.032 2DR760.096 8A3110.016 1B5710.016 1DR840.064 5A3220.032 2B5860.096 8DR9100.161 2A3370.112 9B6070.112 9DR1130.048 3A6820.032 2B6120.032 2DR1260.096 8B710.016 1B6270.112 9DR1360.096 8B810.016 1B6310.016 1DR1420.032 2B1370.112 9B6510.016 1DR1580.129 0B3530.048 3B7530.048 3DR1620.032 2B3810.016 1DQ2100.161 2DR1740.064 5B4420.032 2DQ440.064 5---

圖3 HPA1-17基因分型瓊脂糖電泳圖HPA基因型為HPA-(1,2,4-14,16,17)aa-3ab-15abFig.3 Photographa of HPA1-17 genotype agarose electrophoresisHPA genotype is HPA-(1,2,4-14,16,17) aa-3ab-15ab

3 討論

在本次研究的1 025例孕婦中，血小板抗體陽(yáng)性率為4.39%，陽(yáng)性率低于國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道(8.1%)[6]，考慮原因可能有兩點(diǎn)：一是在本研究中孕婦孕齡為12～40周，部分孕齡較小的孕婦可能還未產(chǎn)生血小板抗體，二是可能存在人群地域之間的差別。但本研究中有多次妊娠史孕婦血小板抗體的陽(yáng)性率明顯高于初次妊娠孕婦，并且隨著妊娠次數(shù)的增加，血小板抗體陽(yáng)性率明顯增高，這與國(guó)內(nèi)報(bào)道結(jié)果是一致的[7]。對(duì)于血小板抗體初篩陽(yáng)性的45例標(biāo)本，我們用二磷酸氯喹預(yù)處理血小板抗原以除去HLA的作用后[8]，重復(fù)進(jìn)行初篩試驗(yàn)，血小板抗體仍為陽(yáng)性(即抗-HPA抗體陽(yáng)性)的有4例，抗-HPA抗體陽(yáng)性率為0.39%，該4例孕婦妊娠次數(shù)均在3次及以上，后通過(guò)隨訪發(fā)現(xiàn)，該4例孕婦所產(chǎn)新生兒并未發(fā)生血小板減少，考慮有兩點(diǎn)原因，一是因?yàn)槟阁w轉(zhuǎn)運(yùn)IgG類抗體時(shí)受到胎兒Fc受體調(diào)節(jié)所致[9]，二是可能與抗-HPA抗體滴度較低有關(guān)，也有研究顯示，在白種人中最具免疫原性的抗原是HPA-1a中，但也只會(huì)使10%的HPA-1bb母親致敏，因此并不是所有胎母HPA抗原不合和抗-HPA抗體都導(dǎo)致新生兒發(fā)生NAIT[10,11]。為明確4例抗-HPA抗體陽(yáng)性孕婦是否同時(shí)伴有抗-HLA抗體陽(yáng)性并確定抗-HPA抗體抗原特異性，4例標(biāo)本采用抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用一組已知表型的血小板抗原對(duì)待測(cè)血小板抗體進(jìn)行篩檢后發(fā)現(xiàn)，4例標(biāo)本都同時(shí)伴有抗-HLA抗體陽(yáng)性，這與文獻(xiàn)中提到的抗-HPA抗體單獨(dú)存在的頻率較低而常與抗-HLA抗體共同存在的現(xiàn)象一致[12]。值得提出的是，4例抗-HPA抗體陽(yáng)性標(biāo)本用此方法檢測(cè)后抗-HPA抗體陽(yáng)性者反而只有1例，為抗-HPA-5b抗體，考慮是因?yàn)镚TI血小板抗體檢測(cè)試劑盒雖可鑒定血小板抗體抗原特異性，但該試劑盒中血小板抗原只包括HPA-1,3,4,5和HLA-I，并沒有包含目前發(fā)現(xiàn)的所有35種HPA，尤其是比較常見的HPA-2,15。該例抗-HPA-5b抗體陽(yáng)性孕婦的HPA1-17基因型為HPA-(1,2,4-14,16,17)aa-3ab-15ab，因此考慮該抗體是孕婦針對(duì)胎兒遺傳自父親的不相容同種異體抗原HPA-5b產(chǎn)生的，但遺憾之處是并沒有對(duì)胎兒及其父親做HPA基因分型。很多文獻(xiàn)報(bào)道，同屬亞洲人群的日本人群中導(dǎo)致NAIT發(fā)生的主要是抗-HPA-5b抗體，因此，我們也有理由假設(shè)在皖北地區(qū)人群中甚至中國(guó)人群中致NAIT發(fā)生的致病抗體可能為抗-HPA-5b抗體。在對(duì)山東漢族人群的HLA-A、B的基因分型中[12]，頻率較高的抗原為A2、A11、A24、A33、B13、B61、B62，這與本次研究中血小板抗體陽(yáng)性孕婦的HLA-A、B基因分型結(jié)果一致，由于本次研究并沒有檢測(cè)皖北地區(qū)血小板抗體陰性孕婦及非孕婦普通人群的HLA基因分型作為對(duì)照，因此，我們只能猜測(cè)，抗-HLA抗體陽(yáng)性孕婦的HLA基因分型可能和普通人群一樣，抗-HLA抗體的產(chǎn)生與孕婦HLA基因分型可能沒有關(guān)系。

總之，孕婦妊娠次數(shù)越多，血小板抗體產(chǎn)生的機(jī)率就越大，因此血小板抗體篩查在孕婦日常產(chǎn)檢中也應(yīng)當(dāng)發(fā)揮巨大的作用[13]，尤其是對(duì)于有多次妊娠史和輸血史、反復(fù)流產(chǎn)、血小板輸注無(wú)效和產(chǎn)過(guò)患血小板減少癥患兒的孕婦[14]，可于妊娠第16周至第28周篩查血小板抗體并監(jiān)測(cè)血小板抗體變化情況[15],它能夠有效地探討反復(fù)流產(chǎn)的病因、早期預(yù)測(cè)及預(yù)防新生兒同種免疫性血小板減少癥的發(fā)生，對(duì)于抗-HPA抗體陽(yáng)性的孕婦，應(yīng)引起醫(yī)生及孕婦的高度重視，可于孕12～20周時(shí)靜脈注射丙種免疫球蛋白或在孕后期結(jié)合激素治療來(lái)預(yù)防NAIT的發(fā)生[16,17]，國(guó)外也曾報(bào)道過(guò)通過(guò)體外受精成功避免NAIT發(fā)生的案例[18]。若產(chǎn)后新生兒發(fā)生血小板減少癥，應(yīng)視其血小板計(jì)數(shù)結(jié)果和臨床癥狀的嚴(yán)重程度進(jìn)行靜脈丙種免疫球蛋白注射或血小板輸注治療[19]。診斷NAIT時(shí)需要對(duì)孕婦血清中的抗-HPA抗體進(jìn)行鑒定，并對(duì)母子之間的HPA抗原是否相容進(jìn)行分析[20,21]。有條件的醫(yī)院可以應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步對(duì)患兒及其父母進(jìn)行HLA及HPA基因分型檢測(cè)，根據(jù)相應(yīng)的抗原進(jìn)行抗體特異性分析，以明確病因及指導(dǎo)臨床治療。同時(shí)我們也建議育齡期婦女在孕前進(jìn)行血小板抗體的篩查，評(píng)估由于血小板抗體引起的早期流產(chǎn)和NAIT的發(fā)生概率，確保優(yōu)生優(yōu)育。

雖然NAIT及血小板血型已經(jīng)得到越來(lái)越多人的關(guān)注，但都是由于生產(chǎn)過(guò)患有該病的新生兒后才被重視[22]，目前多數(shù)國(guó)家都沒有開展對(duì)該病的篩查工作和對(duì)該病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，這可以成為婦產(chǎn)科、兒科及輸血科共同的研究方向。文獻(xiàn)報(bào)道，在亞洲人口中與免疫介導(dǎo)的血小板減少有關(guān)的最重要的血小板抗體是抗-HPA-3抗體和抗-HPA-4抗體[23]，其中并未包括我國(guó)，而目前我國(guó)只是部分地區(qū)建立了血小板HLA和HPA基因型資料庫(kù)[12,24-26]，其抗原基因型都有區(qū)域性分布特征。雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)不同群體的 HPA 和 HLA 分布已有較多研究,但因 HPA和 HLA 基因分布在不同種族、不同民族甚至同一民族的不同人群中各不相同,具有臨床意義的抗原也不盡相同,故仍有必要了解各個(gè)地區(qū)的 HPA和 HLA 分布頻率,并藉此建立本地化的血小板供者資料庫(kù)。因此每個(gè)地區(qū)都應(yīng)調(diào)查本地區(qū)HLA和HPA基因型分布特征，掌握本地區(qū)的優(yōu)勢(shì)同種抗原及高?？乖到y(tǒng)，針對(duì)特殊人群如孕婦、患有自身免疫性血小板減少癥的患者進(jìn)行血小板抗體篩查，同時(shí)建立本地區(qū)血小板捐獻(xiàn)者HLA 和HPA基因型資料庫(kù)，以便能達(dá)到HLA血型和HPA血型均匹配的血小板輸注治療，這樣可以減少血小板輸注無(wú)效的發(fā)生，孕婦及伴有血小板減少的患者能及時(shí)、有效地輸注血小板制劑，節(jié)約醫(yī)療資源，提高臨床治療效果，更有重要的免疫學(xué)意義和社會(huì)效益。