王曌華 張 永 裴敬仲

(新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院燒傷科，新鄉(xiāng) 453000)

腸道作為人體最大的免疫器官，在正常生理條件下腸黏膜能夠阻止內(nèi)毒素、腸道細菌進入血液內(nèi)循環(huán)，而在感染、嚴重燒傷等病理條件下，腸黏膜屏障被破壞，機體免疫力下降，導致腸道內(nèi)毒素和細菌進入全身循環(huán)，從而引發(fā)機體多器官功能障礙、炎癥反應、膿毒癥等癥狀[1,2]。因此保護燒傷后腸道黏膜屏障是治療的關鍵所在?；⒄?polygonum cuspidatum sieb，et zucc)中醫(yī)臨床上常用于肺熱咳嗽、關節(jié)疼痛、跌打傷、濕熱黃疸、水火燙傷等[3]?；⒄溶?polydatin，PD)作為中醫(yī)虎杖的主要成分，在治療急性腦中風、急性肺損傷方面療效顯著[4,5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，PD具有抗氧化、抗炎的藥理作用[5，6]。沉默調(diào)節(jié)蛋白1(sirtuin 1，SIRT1)能夠通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/NADH的信號轉(zhuǎn)導，進而經(jīng)多轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控蛋白表達，研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)SIRT1水平能夠抑制NF-κB炎癥通路活性，緩解炎癥反應癥狀[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，PD可以激活SIRT1表達，下調(diào)COX-2、NOS、TNF-α、IL-6表達水平，抑制大鼠脊髓炎癥和氧化應激反應，改善大鼠急性脊髓損傷癥狀，促進運動功能恢復[8]。PD能否緩解嚴重燒傷小鼠早期腸損癥狀未見相關報道，因此本研究擬建立嚴重燒傷小鼠早期腸損傷模型，觀察不同濃度PD給藥后腸損傷緩解情況及對SIRT1/NF-κB通路的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑和儀器 虎杖苷(polydatin，PD、貨號：J43812、≥99%)購自上海金穗生物科技有限公司；谷氨酰胺(貨號：NR61055，≥99%)購自北京諾博萊德科技有限公司；阿利新蘭8GX(貨號：JM8313，≥99%)購自北京吉美生物技術有限公司；兔抗鼠SIRT1(貨號：T845-EKB)、兔抗鼠NF-κB p65(貨號：YT827-NJI)、羊抗兔二抗(貨號：BL0924-ILN)均購自北京百奧萊博科技有限公司；TNF-α[貨號：JK-(a)-0016]、IL-1β[貨號：JK-(a)-1438]、IL-10[貨號：JK-(a)-1490]、NO[貨號：JK-(a)-5116]、一氧化氮合酶[iNOS，貨號：JK-(a)-5101]、MDA[貨號：JK-(a)-5002]ELISA試劑盒均購自上海晶抗生物工程有限公司；RM2235型石蠟轉(zhuǎn)輪切片機購自德國徠卡公司；DYS-338倒置生物顯微鏡購自上海點應光學儀器有限公司；ZF-288型全自動凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海金鵬分析儀器有限公司。

1.1.2實驗動物 雌性BALB/c小鼠，體質(zhì)量20～30 g，8周齡，均購自河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK(豫)-2018-0002。適應性飼養(yǎng)一周，均自由飲食、飲水。嚴重燒傷小鼠模型構建采用陳琦等[9]建立的方法，即選取小鼠背部相應區(qū)域電動剃毛，隨后用8%硫化鈉脫毛，造模前禁食12 h，供自由飲水。燒傷面積(S)=0.0913W2/3，W為小鼠體重(g)，嚴重燒傷(15%TBSAⅢ)小鼠模型面積為S×30%。用2%戊巴比妥鈉以2 ml/kg劑量腹腔注射麻醉小鼠，水浴鍋水溫設置為100℃，根據(jù)燒傷面積制作木質(zhì)平面板洞口，并蓋在水浴鍋上，將小鼠背部脫毛處置于洞口處，燙傷8 s，致使小鼠背部30%TBSAⅢ燙傷(下稱燒傷)。燙傷結(jié)束后立刻腹腔注射1 ml生理鹽水，背部涂抹碘伏，每日一次。假燒傷組30℃水燙傷，不注射生理鹽水和涂抹碘伏，建模1 d后，觀察小鼠建模情況，并進行分組。實驗分組：①假燒傷組；②燒傷組；③低劑量PD組(5 mg/kg)；④中劑量PD組(10 mg/kg)；⑤高劑量PD組(20 mg/kg)[10]；⑥谷氨酰胺組(1 g/ml)[11]，均200 μl 灌胃，每天一次，給藥7 d，假燒傷組灌胃等體積生理鹽水，每組20只。

1.2方法

1.2.1樣本采集和保存 給藥治療結(jié)束后，各組小鼠鼠尾采血，離心取上清液，血清置于-80℃冰箱中待用。隨后脫頸處死小鼠，其中任選10只小鼠取回腸段，清洗干凈，除去脂肪和腸系膜待用。另外10只小鼠立刻取回腸段組織，一部分置于液氮中保存，另一部分置于4%多聚甲醛固定。另外10只小鼠取全部腸段，除去脂肪和腸系膜待用。

1.2.2各組小鼠小腸黏液含量的測定 利用阿利新蘭和黏液中糖蛋白結(jié)合，從而形成不溶性復合物的特點，測定各組小鼠黏液含量。將5 ml阿利新蘭溶液充分浸沒回腸段黏液組織，25℃孵育2 h，隨后吸取染液，離心后取上清，使用分光光度計測定615 nm 處的OD值，標準曲線計算黏液結(jié)合的阿利新蘭量以表示黏液含量。

1.2.3各組小鼠回腸病理學組織HE染色 將固定后的回腸段組織常規(guī)石蠟包埋，切片、蘇木素-伊紅染色，在光學顯微鏡下觀察腸黏膜受損情況。

1.2.4蛋白印跡法(Western blot，WB)測定各組小鼠回腸組織中SIRT1、NF-κB p65表達水平 從液氮中取出各組小鼠回腸組織，稱重后放入研缽中，向研缽中加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液，隨后充分研磨至無組織碎片。50 μg蛋白緩沖液升溫至100℃，保持10 min，上樣電泳。首先調(diào)節(jié)電壓80 V，電泳30 min，隨后升高電壓至120 V，電泳120 min，濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下5%BSA封閉結(jié)合位點1 h，分別加入兔抗鼠SIRT1、兔抗鼠NF-κB p65、兔抗鼠內(nèi)參β-Actin(均為1∶1 000)，4℃孵育24 h，加入羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h后，洗膜、ECL顯色、暗室曝光、觀察。

1.2.5酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-10、NO、iNOS、MDA表達水平 從-80℃冰箱中取出各組小鼠血清，按照ELISA試劑盒說明書進行測定各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-10、NO、iNOS、MDA表達水平。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠創(chuàng)面愈合情況觀察 造模后可見小鼠燒傷部位有滲血、感染、水腫發(fā)生，不同濃度虎杖苷給藥治療后，小鼠創(chuàng)面有褐色痂殼形成，創(chuàng)面皺縮，隨后出現(xiàn)創(chuàng)面上皮爬行、干燥，高劑量組治療結(jié)束后痂殼脫離，創(chuàng)面平整、紅潤，基本愈合。谷氨酰胺組癥狀緩解情況與高劑量組相當。

表1 各組小鼠回腸黏液相對含量

Tab.1 Relative content of ileal mucus in mice of each group

GroupsnRelative content of mucus(mg)Sham burn group102.29±0.26Burn group101.14±0.141)Low dose PD group101.42±0.151)2)Medium dose PD group101.62±0.161)2)3)High dose PD group101.87±0.251)2)3)4)Glutamine group101.88±0.261)2)3)4)F-36.687P-<0.001

Note：Compared with the sham burn group，1)P<0.05;compared with the burn group，2)P<0.05,Compared with the low dose PD groups，3)P<0.05;compared with the medium dose PD groups，4)P<0.05.

圖1 各組小鼠回腸段絨毛病理學組織HE染色比較(×400)Fig.1 Comparison of HE staining of ileum villous pathology in mice of each group(×400)Note: A.Sham burn group；B.Burn group；C.Low dose PD groups；D.Medium dose PD groups；E.High dose PD groups;F.Glut-amine group.

2.2各組小鼠回腸黏液相對含量的測定 與假燒傷組相比，燒傷組回腸黏液相對含量顯著降低(P<0.05)，與燒傷組相比，低、中、高劑量PD組，回腸黏液相對含量顯著升高(P<0.05)，隨著PD給藥劑量的升高，回腸黏液相對含量隨之升高，任意兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。谷氨酰胺組回腸黏液相對含量與燒傷組相比顯著升高(P<0.05)，與高劑量PD組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3各組小鼠回腸病理學組織HE染色 假燒傷組(圖1A)回腸黏膜分布均勻，絨毛形態(tài)正常，燒傷組(圖1B)回腸黏膜水腫、充血，大量杯狀細胞分泌，淋巴細胞浸潤，絨毛斷裂壞死。PD給藥治療后，隨著劑量的增加，黏膜充血水腫減弱，淋巴細胞浸潤減少，絨毛形態(tài)恢復正常，高劑量組(圖1E)治療后黏膜趨向正常。谷氨酰胺組(圖1F)癥狀緩解情況與高劑量組相當。

2.4各組小鼠回腸組織中SIRT1、NF-κB p65表達水平 與假燒傷組相比，燒傷組SIRT1蛋白表達水平顯著降低，NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與燒傷組相比，低、中、高劑量PD組SIRT1蛋白表達水平顯著升高，NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，隨著PD給藥劑量升高，SIRT1蛋白表達水平隨之升高，NF-κB p65蛋白表達水平隨之降低，任意兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。谷氨酰胺組與燒傷組相比，SIRT1蛋白表達水平顯著升高，NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，與高劑量PD組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2、表2。

圖2 各組小鼠回腸組織中SIRT1、NF-κB p65表達水平Fig.2 Expression levels of SIRT1，NF-κB p65 in ileum tissue of mice in each groupNote: 1.Sham burn group;2.Burn group;3.Low dose PD groups;4.Medium dose PD groups;5.High dose PD groups;6.Glutamine group.

表2 各組小鼠回腸組織中SIRT1、NF-κB p65表達水平

Tab.2 Expression levels of SIRT1，NF-κB p65 in ileum tissue of mice in each group

GroupsnSIRT1/β-actinNF-κB p65/β-actinSham burn group101.08±0.130.17±0.04Burn group100.15±0.061)1.06±0.121)Low dose PD groups100.25±0.051)2)0.85±0.81)2)Medium dose PD groups100.39±0.071)2)3)0.66±0.071)2)3)High dose PD groups100.57±0.081)2)3)4)0.38±0.061)2)3)4)Glutamine group100.59±0.071)2)3)4)0.39±0.051)2)3)4)F-167.25198.95P-<0.001<0.001

Note：Compared with the sham burn group，1)P<0.05;compared with the burn group，2)P<0.05,Compared with the low dose PD groups，3)P<0.05;compared with the medium dose PD groups，4)P<0.05.

表3 各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-10表達水平

Tab.3 TNF-α，IL-1β，IL-10 expression levels in serum of mice in each group

GroupsnTNF-α(pg/ml)IL-1β(ng/L)IL-10(ng/ml)Sham burn group1015.07±1.1912.97±1.58325.13±34.86Burn group10156.48±18.761)28.46±2.611)93.44±15.071)Low dose PD group10121.92±13.511)2)24.75±2.431)2)126.26±15.221)2)Medium dose PD group1082.49±9.721)2)3)21.29±2.021)2)3)198.99±20.901)2)3)High dose PD group1048.17±5.281)2)3)4)17.68±2.201)2)3)4)254.37±24.081)2)3)4)Glutamine group1047.09±4.471)2)3)4)17.30±2.541)2)3)4)256.63±23.481)2)3)4)F-246.1561.56141.08P-<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the sham burn group，1)P<0.05;compared with the burn group，2)P<0.05;Compared with the low dose PD groups，3)P<0.05;compared with the medium dose PD groups，4)P<0.05.

表4 各組小鼠回腸組織中NO、iNOS、MDA表達水平

Tab.4 Expression levels of NO，iNOS，MDA in ileum tissue of mice in each group

GroupsnNO(μmol/g)iNOS(U/mg)MDA(nmol/mg)Sham burn group102.08±0.271.27±0.132.23±0.27Burn group108.49±0.841)4.01±0.461)5.51±0.461)Low dose PD groups106.90±0.621)2)3.45±0.34ab4.45±0.441)2)Medium dose PD groups105.11±0.591)2)3)2.61±0.251)2)3)3.48±0.391)2)3)High dose PD groups103.84±0.321)2)3)4)1.98±0.161)2)3)4)2.91±0.381)2)3)4)Glutamine group103.89±0.351)2)3)4)1.93±0.151)2)3)4)2.90±0.391)2)3)4)F-185.89139.6795.68P-<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the sham burn group，1)P<0.05;compared with the burn group，2)P<0.05；compared with the low dose PD groups，3)P<0.05;compared with the medium dose PD groups，4)P<0.05.

2.5各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-10表達水平 與假燒傷組相比，燒傷組TNF-α、IL-1β表達水平顯著升高，IL-10表達水平顯著降低(P<0.05)；與燒傷組相比，低、中、高劑量PD組TNF-α、IL-1β表達水平顯著降低、IL-10表達水平顯著升高(P<0.05)，隨著PD給藥劑量升高，TNF-α、IL-1β表達水平隨之降低、IL-10表達水平隨之升高，任意兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。谷氨酰胺組與燒傷組相比，TNF-α、IL-1β表達水平顯著降低，IL-10表達水平顯著升高(P<0.05)，與高劑量PD組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.6各組小鼠回腸組織中NO、iNOS、MDA表達水平 與假燒傷組相比，燒傷組NO、iNOS、MDA表達水平顯著升高(P<0.05)；與燒傷組相比，低、中、高劑量PD組NO、iNOS、MDA表達水平顯著降低，隨著PD給藥劑量升高，NO、iNOS、MDA表達水平隨之降低，任意兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。谷氨酰胺組與燒傷組相比，NO、iNOS、MDA表達水平顯著降低(P<0.05)，與高劑量PD組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

3 討論

腸黏膜屏障是人們機體內(nèi)環(huán)境與外部環(huán)境的隔離帶，主要包含黏液屏障、機械屏障、免疫屏障和生物屏障，可阻礙有害物質(zhì)進入內(nèi)循環(huán)，從而維護機體內(nèi)環(huán)境動態(tài)平衡[12]。燒傷后，腸道黏膜屏障受損是引發(fā)感染和其他并發(fā)癥的病理基礎，因此如何緩解燒傷后腸道黏膜損傷，保持腸道黏膜結(jié)構穩(wěn)定，維持屏障功能是臨床上治療燒傷的重要問題。本研究構建嚴重燒傷小鼠模型，一般情況觀察可見小鼠燒傷部位有滲血、感染、水腫發(fā)生，說明模型構建成功。與假燒傷組相比，燒傷組回腸黏液相對含量顯著降低，黏膜水腫、充血，大量杯狀細胞分泌，淋巴細胞浸潤，絨毛斷裂壞死，說明處理后，小鼠腸道受損，模型構建成功。

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)PD治療后，嚴重燒傷小鼠創(chuàng)面有褐色痂殼形成，創(chuàng)面皺縮，隨后出現(xiàn)創(chuàng)面上皮爬行、干燥，高劑量組治療結(jié)束后痂殼脫離，創(chuàng)面平整、紅潤，基本愈合，回腸黏液含量顯著升高，黏膜充血水腫減弱，淋巴細胞浸潤減少，絨毛形態(tài)恢復正常，說明PD治療后，能夠緩解嚴重燒傷小鼠腸損傷癥狀，提示PD有望成為治療嚴重燒傷腸損傷的備選藥物。但是PD通過何種途徑以緩解此癥狀還有待進一步研究。高友光等[13]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PD治療后，膿毒癥急性腎損傷小鼠血清中IL-6、IL-1β、MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，提示PD可通過抗氧化、抗炎作用，緩解腎損傷。而本研究同樣證明，經(jīng)PD治療后TNF-α、IL-1β水平降低，IL-10水平升高，TNF-α可誘導炎癥因子IL-1β、IL-18、IL-6產(chǎn)生釋放，放大和加強炎癥信號[14]。IL-10可抑制巨噬/單核細胞分泌TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎癥因此，抑制炎癥免疫反應[15]。說明PD能夠緩解炎癥反應，減輕腸道損傷。一氧化氮合酶(iNOS)可由TNF-α、LPS、IL-1β等促炎癥因子誘導上調(diào)，進一步產(chǎn)生大量NO，對機體致炎和氧化損傷[16]。丙二醛(MDA)作為質(zhì)子過氧化物最終產(chǎn)物能夠間接反映組織氧化應激損傷程度[17]。而本研究證明經(jīng)PD治療后，NO、iNOS、MDA水平顯著降低，說明經(jīng)PD治療后，能夠緩解腸道氧化應激反應，保護腸道免受損傷。而文獻報道同樣證明，PD可能通過激活p38 MAPK/Nrf2/HO-1信號通路，下調(diào)MDA水平，上調(diào)SOD、CATS水平，經(jīng)抗氧化途徑發(fā)揮抗炎的藥理作用[18]。

本研究初步探究PD通過調(diào)控何種信號通路參與嚴重燒傷小鼠早期腸損傷進程，有研究報道發(fā)現(xiàn)活化SIRT1能夠下調(diào)Bax、IL-1β、TNF-α水平，上調(diào)Bcl-2、IL-10水平，以改善嚴重燒傷大鼠腎功能，減輕炎癥反應[19]。而本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PD治療后SIRT1蛋白水平升高，NF-κB p65蛋白水平降低，說明PD治療后SIRT1被活化，PD可能基于此通路發(fā)揮抗炎、抗氧化作用。白智曉等[20]同樣發(fā)現(xiàn)，活化SIRT1后，可降低TNF-α、IL-1β、Bax及剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表達水平，緩解大鼠嚴重燒傷早期誘發(fā)的心肌損傷。

綜上所述，PD可能通過抑制炎癥和氧化應激反應以緩解嚴重燒傷小鼠早期腸損傷癥狀，可能與SIRT1/NF-κB通路相關，但是具體作用機制還有待進一步探究。