董 頔 杜 蓉 薛茜文 趙雅文 張旭娟 楊 艷 陳志芳

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,烏魯木齊 830054)

宮頸癌是女性中第二常見(jiàn)的生殖道惡性腫瘤。中國(guó)每年的新增病例約占全球病例的四分之一，且呈年輕病例逐年增加的趨勢(shì)[1]。目前，宮頸癌的致病原因主要與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染有關(guān)，但隨著腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展，對(duì)宮頸癌發(fā)病機(jī)制的研究也在逐漸深入,其中腫瘤的免疫逃逸機(jī)制是目前的一大熱點(diǎn)[2]。近年來(lái)，Tim家族作為一類參與調(diào)解機(jī)體免疫的關(guān)鍵分子引起大家的重視[3-5]。Tim-3是在T細(xì)胞表面上表達(dá)的抑制性受體，在抑制T細(xì)胞對(duì)腫瘤的反應(yīng)至關(guān)重要[6]。半乳糖凝集素9(Galectin-9)已被鑒定為Tim-3的配體，半乳糖凝集素9與Tim-3的結(jié)合導(dǎo)致T細(xì)胞的凋亡和T細(xì)胞免疫的負(fù)調(diào)節(jié)[7]。許多研究支持阻斷Tim-3/Galectin-9途徑可能具有恢復(fù)人類癌癥中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞功能的潛力[8-11]。由于目前關(guān)于Tim-3和Galectin-9與宮頸癌之間關(guān)系的研究尚不清楚，所以我們通過(guò)分析Tim-3和Galectin-9在宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepi-thelial neoplasia，CIN)組織和正常宮頸組織中的表達(dá)以及宮頸癌患者的臨床指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)來(lái)判斷Tim-3和Galectin-9在宮頸癌發(fā)病過(guò)程中的作用。

1 資料與方法

1.1資料 我們選擇了2016年5月至2019年2月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科住院行手術(shù)治療或病理活檢的宮頸癌患者的宮頸組織石蠟標(biāo)本52例，CIN患者的宮頸組織石蠟標(biāo)本30例，正常對(duì)照組為良性子宮肌瘤行子宮全切患者的正常宮頸25例，其中宮頸癌患者按2018 NCCN指南分期，年齡35～60歲，平均(49.3±6.07)歲，CIN患者年齡27～55歲，平均(48.5±6.13)歲，正常組年齡45～65歲，平均(51.3±5.15)歲，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有病理切片均經(jīng)兩名病理專家會(huì)診確診。宮頸癌患者中34例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，18例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；病理分化程度：高分化5例，中分化17例，低分化20例，分化程度不明10例。排除標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病史、高血壓、心血管疾病、妊娠、急性或慢性傳染病、轉(zhuǎn)移性腫瘤及術(shù)前行放、化療的宮頸癌患者。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。見(jiàn)表1。

1.2方法

1.2.1采用qRT-PCR檢測(cè)宮頸癌組、CIN組、正常組組織樣本中Tim-3和Galectin-9的表達(dá) 取各組組織樣本106～107的細(xì)胞，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS，購(gòu)自中杉金橋，pH值7.4)清洗細(xì)胞，去PBS后加1 ml的RNA抽提試劑采用酸性酚抽提法(TRIzol Reagent，購(gòu)自ThermoFisher公司)抽提組織樣本總RNA，經(jīng)一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自TaKaRa公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR后，采用QuantiNova SYBR Green PCR Kit試劑盒(購(gòu)自QIAGEN公司)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，以正常組作為參照物，循環(huán)參數(shù)設(shè)定為95℃ 15 min，95℃15 s，60℃ 15 s，72℃ 35 s，連續(xù)40個(gè)循環(huán)。每份標(biāo)本重復(fù)2次，所有的qRT-PCR產(chǎn)物均經(jīng)熔解曲線分析以分辨目的產(chǎn)物與非特異產(chǎn)物及引物二聚體。用Michael推導(dǎo)的數(shù)學(xué)公式2-ΔΔct來(lái)計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。其中RT-PCR引物序列如下。Tim-3正義鏈：5′-AGG CAG CAA CCC TCA CAA-3′；反義鏈：5′-CCC AGT TCA ATT CCC ATG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度200 bp。Galectin-9正義鏈：5′-ACC AGG TTT GCT GTG AAC T-3′；反義鏈：5′-CCA CGT ACC CTC CAT CTT-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度91 bp。GAPDH正義鏈：5′-TGT TGC CAT CAA TGA CCC CTT-3′；反義鏈：5′-CTC CAC GAC GTA CTC AGC G-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度202 bp。

1.2.2采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)宮頸癌組、CIN組、正常組組織樣本中Tim-3和Galectin-9的表達(dá) 石蠟切片逐級(jí)脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液洗5 min×3次；切片置于枸櫞酸緩沖液(購(gòu)自中杉金橋，pH值6.0)中，微波加熱95℃進(jìn)行抗原修復(fù)12 min；待其自然冷卻至室溫后，磷酸鹽緩沖液洗5 min×3次，滴加過(guò)氧化酶(通用二步法試劑盒PV6000)阻斷、室溫下孵育10 min；滴加封閉血清購(gòu)自中杉金橋，室溫下孵育40 min；除去血清，分別滴加一抗Tim-3(Rabbit Anti- Tim 3 Polyclonal Anti-body購(gòu)自BIOSS,1∶100)、Galectin-9(Rabbit Anti-Galectin-9 Polycl-onal Antibody購(gòu)自BIOSS,1∶100)，4℃過(guò)夜；冰箱內(nèi)取出后，室溫靜置1 h,磷酸鹽緩沖液洗5 min×3次，滴加二抗(通用二步法試劑盒PV6000)，室溫下孵育30 min；磷酸鹽緩沖液洗5 min×3次,DAB顯色，自來(lái)水沖洗；蘇木素(中杉金橋)復(fù)染；脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察。應(yīng)用彩色圖像分析系統(tǒng)(Image.Pro Plus 6.0，美國(guó)Media Cybernetics公司)進(jìn)行圖像分析：吸光度校正，在HIS顏色模式下選中染色陽(yáng)性區(qū)域，過(guò)濾背景干擾，測(cè)定每個(gè)視野的累積吸光度(integral optical density，IOD)值及陽(yáng)性區(qū)域面積(area)值。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野(×400)，測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性區(qū)域的IOD值和area值，計(jì)算平均光密度值MOD=IOD/area，以每組所有視野的MOD值的平均值作為該組的測(cè)量值。

表1 宮頸癌組患者臨床特征

Tab.1 Clinical characteristics of cervical cancer patients

Indexn(%)Age≥4539(75)<4513(25)Histologic diagnosisSquamous carcinoma42(81)Adenocarcinoma8(15)Squamous adenocarcinoma2(4)FIGO classificationⅠ17(33)Ⅱ25(49)Ⅲ7(11)Ⅳ3(5)Lymph node metastasisYes18(34)No34(66)Levels of differentiationWell differentiated5(13)Moderately differentiated17(40)Poorly differentiated20(47)Tumor infiltration depth<15 mm27(52)≥15 mm25(48)Tumor diameter<4 cm37(72)≥4 cm15(28)Vascular invasionNo39(75)Yes13(25)

2 結(jié)果

2.1三組宮頸組織qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果 qRT-PCR結(jié)果顯示，宮頸癌組和CIN組的組織樣本中Tim-3和Galectin-9的表達(dá)均比對(duì)照組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；宮頸癌的組織樣本中Tim-3和Galectin-9的表達(dá)比CIN組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)見(jiàn)表2。

2.2Tim-3和Galectin-9的mRNA表達(dá)水平與宮頸癌臨床特征的關(guān)系 宮頸癌組織中Tim-3和Galectin-9的mRNA表達(dá)水平與FIGO分期(P<0.05)、分化程度(P<0.05)和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)均明顯相關(guān)。但在不同年齡組間、病理分型、浸潤(rùn)深度、腫瘤大小和脈管侵犯中比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1、2。

2.3三組宮頸組織中Tim-3和Galectin-9免疫組化表達(dá)結(jié)果 宮頸癌組織中，Tim-3和Galectin-9的陽(yáng)性反應(yīng)信號(hào)均為棕褐色(圖3)。Tim-3主要在癌細(xì)胞中可見(jiàn)褐色著色，且在少數(shù)細(xì)胞也可見(jiàn)胞核著色；Galectin-9主要在癌中褐色著色。宮頸癌組織中Tim-3的MOD值顯著高于CIN組和正常組(P<0.05),CIN組織中Tim-3的MOD值顯著高于正常組(P<0.05)。宮頸癌組織中Galectin-9的MOD值顯著高于CIN組和正常組(P<0.05)，CIN組織中Galectin-9的MOD值顯著高于正常組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

GroupsnmRNATim-3Galectin-9Cervical cancer52 28.43±15.501)2) 41.78±17.801)2)CIN3010.41±5.171)20.40±7.601)Control251.27±0.321.31±0.41

Note:1)P<0.05 compared with control group;2)P<0.05 compared with CIN group.

圖1 Tim-3的mRNA表達(dá)水平與宮頸癌臨床特征的關(guān)系Fig.1 Relationship between expression level of Tim-3 and clinical features of cervical cancerNote:A.Age；B.Histological types；C.FIGO stages；D.Lymph node metastasis；E.Tumor dierentiation；F.Invasion depth；G.Tumor diameter；H.Vascular invasion.Compared with the FIGO Ⅰ stage,*.P PP P

圖2 Galectin-9的mRNA表達(dá)水平與宮頸癌臨床特征的關(guān)系Fig.2 Relationship between expression level of Galectin-9 and clinical features of cervical cancerNote:A.Age;B.Histological types;C.FIGO stages;D.Lymph node metastasis;E.Tumor differentiation;F.Invasion depth;G.Tumor diameter;H.Vascular invasion.Compared with the positive lymph node metastasis，#.P PP

圖3 宮頸癌組、CIN組和正常對(duì)照組Tim-3及Galectin-9免疫組化染色(×400)Fig.3 IHC of Tim-3 and Galectin-9 in the tissue of cervi-cal cancer patients,CIN patients and normal contr-ols(×400)Note:A.IHC of Tim-3 in the tissue of cervical cancer patients;B.IHC of Galectin-9 in the tissue of cervical cancer patients;C.IHC of Tim-3 in the tissue of CIN patients;D.IHC of Galectin-9 in the tissue of CIN patients;E.IHC of Tim-3 in the tissue of normal controls;F.IHC of Galectin-9 in the tissue of normal controls.

表3 宮頸癌組、CIN組和正常組Tim-3和Galectin-9的MOD值

Tab.3 MOD of Tim-3 and Galectin-9 in tissue of cervical cancer patients,CIN patients and normal controls

GroupsnMOD(x±s)Tim-3Galectin-9Cervical cancer520.14±0.031)2)0.16±0.031)2)CIN300.10±0.061)0.10±0.021)Control250.04±0.010.04±0.01

Note:1)P<0.05 compared with control group;2)P<0.05 compared with CIN group.

圖4 Tim-3的MOD值與宮頸癌臨床特征的關(guān)系Fig.4 Relationship between MOD of Tim-3 and clinical features of cervical cancerNote:A.Age;B.Histological types;C.FIGO stages;D.Lymph node metastasis;E.Tumor differentiation;F.Invasion depth;G.Tumor diameter;H.Vascular invasion.Compared with the ADSC，◇.P PP PP P

2.4Tim-3和Galectin-9的組織學(xué)表達(dá)與宮頸癌臨床特征的關(guān)系 在宮頸癌組織中，Tim-3和Galectin-9的表達(dá)水平在不同年齡間和浸潤(rùn)深度比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而在FIGO分期(P<0.05)、病理分型(P<0.05)、組織病理分化程度(P<0.05)和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)均明顯相關(guān)，見(jiàn)圖4、5。

圖5 Galectin-9的MOD值與宮頸癌臨床特征的關(guān)系Fig.5 Relationship between MOD of Galectin-9 and clini-cal features of cervical cancerNote:A.Age;B.Histological types;C.FIGO stages;D.Lymph node metastasis;E.Tumor differentiation;F.Invasion depth;G.Tumor diameter;H.Vascular invasion.Compared with the ADSC，◇.P PP PP P

3 討論

近年來(lái)，針對(duì)腫瘤免疫逃逸機(jī)制進(jìn)行的癌癥免疫療法取得了令人矚目的臨床效果[12，13]。通過(guò)免疫療法對(duì)抗癌癥已經(jīng)改變了對(duì)一些患者的治療，并且針對(duì)諸如CTLA-4和PD-1的免疫檢查點(diǎn)分子的療法已經(jīng)在黑色素瘤、腎癌、霍奇金病和肺癌中實(shí)現(xiàn)了持久的反應(yīng)[14-17]。然而，這些治療的成功率很低，并且包括結(jié)腸直腸癌在內(nèi)的大量癌癥在很大程度上仍然很難通過(guò)阻斷CTLA-4和PD-1達(dá)到治愈[18]。這為尋找其他抑制性途徑提供了動(dòng)力，通過(guò)阻斷這些抑制性途徑可用于增強(qiáng)當(dāng)前免疫治療劑的應(yīng)答率并實(shí)現(xiàn)針對(duì)癌癥有效的免疫療法。Tim-3及其配體Galectin-9已顯示在傳染病和腫瘤免疫等的小鼠模型中介導(dǎo)免疫耐受[19-21]。除了以上關(guān)于Tim-3在疾病的報(bào)道，Shen等[22]首次證實(shí)了Tim-3在小細(xì)胞肺癌患者腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，并且揭示了Tim-3作為小細(xì)胞肺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素的重要作用。Tim-3在前列腺癌、腎癌、急性白血病及黑色素瘤等多種癌組織中呈強(qiáng)陽(yáng)表達(dá)[23-26]。

qRT-PCR結(jié)果顯示Tim-3在宮頸癌組織中的表達(dá)高于CIN組，并明顯高于正常組，表明Tim-3的表達(dá)可能與宮頸病變惡性程度相關(guān)。同時(shí)免疫組化結(jié)果顯示，宮頸癌組織中Tim-3的MOD值明顯高于CIN組和正常組。說(shuō)明Tim-3在宮頸癌組織中表達(dá)，且在宮頸癌發(fā)生過(guò)程中可能起著重要作用，關(guān)于其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。對(duì)Tim-3的特異性配體Galectin-9的表達(dá)進(jìn)行進(jìn)一步研究。Galectin-9是Tim-3的主要配體，與Tim-3一同在抗腫瘤免疫中起著重要的負(fù)向調(diào)控作用[26]。qRT-PCR和免疫組化結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中Galectin-9的mRNA表達(dá)水平和MOD值明顯高于CIN組和正常組，預(yù)示作為Tim-3的特異性配體Galectin-9可能在癌癥發(fā)展過(guò)程中可能起著重要的調(diào)控作用。這與周曉曦等[27]的研究結(jié)果一致。

我們進(jìn)一步分析Tim-3和Galectin-9的表達(dá)與宮頸癌不同臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Tim-3和Galectin-9的表達(dá)除了與病理分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)外，這與Cao等[28]的研究結(jié)果相符。與馮秀蘭等[29]研究結(jié)果不同的是，Tim-3和Galectin-9的表達(dá)也與宮頸癌FIGO分期相關(guān)。Tim-3和Galectin-9的表達(dá)在低分化宮頸鱗癌、中分化宮頸鱗癌和高分化宮頸鱗癌三組中有明顯差異。因此Tim-3和Galectin-9的表達(dá)與宮頸癌病理分化程度的關(guān)系說(shuō)明了Tim-3和Galectin-9可能可以作為臨床宮頸鱗狀細(xì)胞癌病理分化程度的重要指標(biāo)，為宮頸鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后提供有意義的參考。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的組織中，Tim-3和Galectin-9表達(dá)量明顯高于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移患者；在宮頸癌FIGO分期中，Tim-3和Galectin-9的表達(dá)在Ⅰ期和Ⅳ期間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這說(shuō)明Tim-3和Galectin-9可能參與了宮頸癌的發(fā)病進(jìn)程，在其中扮演重要的角色,可以進(jìn)行深入的研究。針對(duì)Tim-3和Galectin-9的表達(dá)與宮頸癌的病理分型關(guān)系分析，免疫組化和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，這可能與mRNA的選擇性翻譯和甲基化有關(guān)，需進(jìn)一步研究。但Tim-3和Galectin-9的表達(dá)與宮頸癌患者的年齡、浸潤(rùn)深度、腫瘤大小和脈管侵犯均無(wú)關(guān)。

綜上所述，Tim-3和Galectin-9在正常宮頸組織中表達(dá)很少，而在宮頸癌及癌前病變組織中呈高表達(dá)，并且與宮頸癌的FIGO分期、組織分化程度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征相關(guān)，說(shuō)明Tim-3和Galectin-9的異常表達(dá)可能與宮頸病變的惡性進(jìn)展存在密切相關(guān)性，并且在腫瘤形成后可能促進(jìn)了宮頸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使患者的預(yù)后明顯變差。而Tim-3和Galectin-9是否可以作為宮頸癌的臨床診斷和預(yù)后因素，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和分析。