曹益華,劉 安,王李新,高建綱,林 英
(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽 蕪湖 241000)
聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)材料與傳統(tǒng)生色團(tuán)的聚集誘導(dǎo)猝滅(ACQ)不同,它在稀溶液中會(huì)發(fā)出微弱的熒光信號(hào),但在聚集狀態(tài)下熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。自從2000年唐本忠[1]發(fā)現(xiàn)了這類(lèi)具有AIE特點(diǎn)的發(fā)光材料以來(lái),它們已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。其中,四苯乙烯基(TPE)類(lèi)衍生物因其發(fā)光性能優(yōu)異、合成簡(jiǎn)便、易官能團(tuán)化、AIE效應(yīng)顯著等優(yōu)點(diǎn),倍受研究者的青睞。
TPE的可塑性很強(qiáng),可以連接不同的親水或疏水基團(tuán)、不同的小分子和高分子結(jié)構(gòu),因此近年來(lái)在化學(xué)傳感[2-4]、生物探針[5-8]等領(lǐng)域的應(yīng)用研究上不斷取得突破性的進(jìn)展。例如:Dong[9]設(shè)計(jì)合成了一種TPE衍生物,他們將ClO-與1-甲基-1,2-二氫吡啶-2-硫酮的特異反應(yīng)與四苯乙烯基化合物的AIE特征相結(jié)合,設(shè)計(jì)出的熒光探針可以對(duì)ClO-具有非常強(qiáng)的選擇性和檢測(cè)性;Li[10]等設(shè)計(jì)了一種基于苯硼酸和苯酚的酸度差異來(lái)檢測(cè)葡萄糖的熒光探針。通過(guò)加入葡萄糖和葡萄糖氧化酶,產(chǎn)生的H2O2將苯硼酸轉(zhuǎn)化為弱酸性苯酚,降低了聚合物陰離子的負(fù)電荷,導(dǎo)致TPEA的分解,從而聚集誘導(dǎo)發(fā)光。新型的葡萄糖的熒光探針能在4~50 μM范圍內(nèi)檢測(cè)葡萄糖,最低檢測(cè)限為2.6 μM,并具有良好的選擇性,現(xiàn)已成功地應(yīng)用于血糖檢測(cè)。
近年來(lái),為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)和活體高靈敏度標(biāo)記,各種策略被用來(lái)制備出大量雙功能及多功能成像的高分子復(fù)合組裝體。尤其是,唐本忠、劉斌和史向陽(yáng)等課題組在該領(lǐng)域的深度研究引起了廣泛關(guān)注[11-13]。例如:主動(dòng)靶向基團(tuán)修飾的聚合物包覆熒光染料或量子點(diǎn)形成納米組裝體,提升了其對(duì)病變部位富集成像性能[11]。聚合物通過(guò)與超順磁性納米顆粒、金納米棒的非共價(jià)作用得到雙成像功能的納米復(fù)合物,能夠從磁共振造影(MRI)及計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)雙角度提供清晰的組織分析成像[13]。雖然也有利用共軛結(jié)構(gòu)AIE材料與磁性納米粒子整合制備熒光-磁性納米復(fù)合物探索,但結(jié)果探針的熒光效率仍然不盡如人意,而且探針復(fù)合體的粒徑還難以控制。
基于上述分析,研究合成以四苯乙烯基(TPE)為基礎(chǔ),四條臂上可控連接疏水的聚己內(nèi)酯(PCL)和親水的聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的高分子材料,并通過(guò)兩親性自組裝的方式包裹Fe3O4NPs,合成了一種具有聚集發(fā)光和磁性雙功能的高分子復(fù)合材料,合成的高分子復(fù)合材料具有良好的穩(wěn)定性、磁性和聚集誘導(dǎo)發(fā)光性能,在生物的高靈敏度標(biāo)記方面應(yīng)用潛能巨大。
4,4′-二氨基二苯甲酮(分析純,阿拉丁試劑公司);ε-己內(nèi)酯(CL,使用前用氫化鈣除水干燥后,減壓蒸出)、乙烯基吡咯烷酮、Sn粉、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(分析純,上海泰坦化學(xué)品有限公司);2-溴丙酸、乙基黃原酸鉀(分析純,TCI公司);辛酸亞錫、二氯甲烷、乙酸乙酯、己烷、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、二芐醚、1,2-十二烷二醇、油酸(分析純,中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海試劑公司)。
(1)4,4′,4″,4?-四氨基四苯乙烯(TPE-AM)的合成。TPE-AM是由4,4′-二氨基二苯甲酮通過(guò)Mcmurry偶聯(lián)反應(yīng)得到。具體操作:依次向250 mL的三頸燒瓶中加入4,4′-二氨基二苯甲酮(0.800 g)和濃鹽酸(35 mL),升溫至60 ℃下攪拌溶解,待溶解完全后,加入錫粉(3.000 g),然后升溫至75 ℃,攪拌回流9 h后,冷卻至室溫。抽濾后,用1 mol/L的NaOH溶液(25 mL)洗滌,抽濾,重復(fù)兩次,然后用25 mL的去離子水洗滌,抽濾兩次,得到黃色的粉末,濾粉真空干燥,得到產(chǎn)物,即TPE-AM(0.685 g)。
(2)TPE-PCL的合成。TPE-PCL是由TPE-AM與ε-己內(nèi)酯(CL)開(kāi)環(huán)聚合得到。總共按照不同分子量要求投料(如:5 K,10 K,15 K,20 K,25 K)合成了5種鏈長(zhǎng)的TPE-PCL。以10 K分子量的合成為例,具體操作:向100 mL的磨口球瓶反應(yīng)瓶中加入TPE-AM(0.0743 g),甲苯(20 mL),攪拌升溫至140 ℃,共沸除去大部分甲苯,殘留5 mL左右時(shí)迅速換成聚合裝置,密閉換氣閥,冷卻至室溫,再加入ε-己內(nèi)酯(1 mL),換Ar23次,加入辛酸亞錫(9 uL),升溫至110 ℃,攪拌下反應(yīng)48 h。反應(yīng)完全后,冷卻至室溫,加入10 mL的二氯甲烷溶解,后加入到冷己烷(200 mL)中沉淀,抽濾,重復(fù)兩次,固體以乙醚(150 mL)洗滌3次,真空干燥。
(3)TPE-PCL-RAFT的合成。TPE-PCL-RAFT通過(guò)TPE-PCL與乙基黃原酸酯化合成,其中,據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道乙基黃原酸(XA)可以由乙基黃原酸鉀和2-溴丙酸反應(yīng)制得。具體操作:向100 mL的磨口球瓶反應(yīng)瓶中加入TPE-PCL(0.05 mmol)和甲苯(40 mL),共沸至2 mL左右,冷卻至室溫。將DMAP(0.6 mmol)和乙基黃原酸(2 mmol)溶于5 mL二氯甲烷,攪拌下注入體系,密封后換氣3次。將DCC(2 mmol)溶入5 mL二氯甲烷中,注入體系。室溫?cái)嚢?8 h。抽濾除去不溶物,濾液旋蒸至3~4 mL,之后緩慢滴入300 mL冷無(wú)水乙醚中,邊滴邊攪拌,靜置半天后抽濾,濾渣用4 mL二氯甲烷溶解后加入20 mL冷甲醇,攪拌5 min抽濾;再重復(fù)溶解沉淀兩次,最終產(chǎn)品真空干燥。
(4)TPE-(PCL-b-PVP)的合成。TPE-(PCL-b-PVP)是由TPE-PCL-RAFT與乙烯基吡咯烷酮(NVP)通過(guò)RAFT聚合得到。投料控制兩種鏈長(zhǎng)聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的嵌段,分別為40 K和160 K,從而合成了10種兩類(lèi)嵌段鏈長(zhǎng)各異的星形共聚物。以TPE-PCL(10K)-b-PVP(40 K)的合成為例,具體操作:向100 mL的磨口球瓶反應(yīng)瓶中加入TPE-PCL-RAFT(0.247 5 g,Mn=10 650),NVP(1 mL),AIBN(5 mg),瓶口用橡膠塞塞緊,Ar2換氣3次,80 ℃下攪拌8 h,冷卻至室溫。加5 mL的THF溶解,然后加入到150 mL的冷己烷中,抽濾,重復(fù)兩次,室溫真空干燥24 h。干燥完后將產(chǎn)物取出,溶于200 mL的乙酸乙酯,用來(lái)除去均聚物PCL,離心干燥,重復(fù)3次,室溫真空干燥24 h。干燥完后產(chǎn)物取出,溶于200 mL的去離子水,用來(lái)除去均聚物PVP,離心干燥,重復(fù)3次,最終產(chǎn)物室溫真空干燥24 h。
(5)四氧化三鐵納米粒子(Fe3O4NPs)的制備。根據(jù)報(bào)道的溶劑熱法合成磁性Fe3O4NPs[15]:將乙酰丙酮鐵(2 mmol)加入到二芐醚(20 mL)與1,2-十二烷二醇(10 mmol)、油酸(6 mmol)的混合溶液中,并在氮?dú)庀录尤胗桶?6 mmol),加熱至200 ℃,反應(yīng)2 h,然后以20 ℃/min的速度升溫至300 ℃后,老化1 h。冷卻至室溫后,得到深棕色混合物。在空氣中用乙醇沉淀離心,得到深棕色物質(zhì)。將產(chǎn)物溶解在己烷中,并用乙醇再沉淀,得到Fe3O4納米顆粒。
(6)熒光納米膠束與雙功能性納米膠束的合成。高分子及其復(fù)合納米膠束在超聲輔助下,一步簡(jiǎn)單自組裝而制得。關(guān)于熒光納米膠束合成,取10 mg星形嵌段共聚物溶解于1 mL二甲亞砜(DMSO)中,之后在超聲輔助下滴入6 mL的去離子水中,繼續(xù)以250 W功率超聲100 s,獲得泛藍(lán)光乳液。過(guò)濾除去不溶物后,在去離子水中透析24 h,得到的熒光納米膠束貯存待用。雙功能性納米膠束的合成操作如下:100 mg星形嵌段共聚物溶解于10 mL的DMSO中,0.5 mg的磁性Fe3O4NPs被均勻分散在2 mL二氯甲烷溶液中,超聲輔助下將上述兩種溶液滴入50 mL的去離子水中,繼續(xù)以250 W功率超聲100 s,獲得灰色乳液。濾去不溶物后,減壓蒸除二氯甲烷,在去離子水中透析24 h,得到雙功能性納米膠束貯存待用。
核磁共振波譜采用AVANCE Ⅲ HD 600 MHz型(Bruker)核磁共振儀測(cè)定,四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo),氘代氯仿作溶劑。凝膠滲透色譜(GPC)采用Waters 515測(cè)定,檢測(cè)器為Waters 2487紫外檢測(cè)器,Wyatt Technology Optilab rEX示差折光檢測(cè)器。流動(dòng)相為四氫呋喃,流速為1.0 mL/min,檢測(cè)溫度為35 ℃。樣品的X射線(xiàn)粉末衍射(XRD)分析在Bruker D8衍射儀上進(jìn)行,使用銅靶(Kα=0.154 18 nm)作為X射線(xiàn)發(fā)射源。通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)(HT-7700,Hitachi)觀察納米膠束的整體形貌。納米膠束的平均粒徑由Brookhaven BI9000AT動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)測(cè)得,所有結(jié)果取3次測(cè)試平均值。納米膠束的熒光發(fā)射通過(guò)Hitachi F-4500熒光光譜儀獲得。熒光光譜儀激發(fā)和發(fā)射單色器的狹縫寬度都設(shè)定為5 nm,熒光光譜的測(cè)試樣品液均置于1 cm寬度的石英皿中。
作為內(nèi)核的四氨基四苯乙烯(TPE-AM)根據(jù)前人的報(bào)道[16]利用4,4′-二氨基二苯甲酮通過(guò)Mcmurry偶聯(lián)反應(yīng)一步簡(jiǎn)單制成。星形共聚物TPE-(PCL-b-PVP)的合成過(guò)程如圖1所示。采用具有強(qiáng)反應(yīng)活性的TPE-AM作為引發(fā)劑,以辛酸亞錫為催化劑,對(duì)ε-己內(nèi)酯(CL)進(jìn)行開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)得到以四苯基乙烯為內(nèi)核的星形聚ε-己內(nèi)酯。然后,由酯化將乙基黃原酸引入聚己內(nèi)酯鏈末端作為介導(dǎo)試劑,AIBN引發(fā)乙烯基吡咯烷酮RAFT聚合制得基于TPE的具有雙親性的嵌段星形聚合物。至此,研究完成了具有星形結(jié)構(gòu)且?guī)в袩晒夤δ艿墓簿畚锏暮铣伞?/p>
圖1 星形共聚物TPE-(PCL-b-PVP)的合成路線(xiàn)圖
小分子發(fā)光核TPE-AM和星形聚己內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)以核磁共振氫譜分析如圖2所示。由圖2可以看見(jiàn),氨基四苯乙烯的特征峰(δHa=6.82 ppm,δHb=6.43 ppm,δHc=3.54 ppm),說(shuō)明該化合物結(jié)構(gòu)正確。此外,進(jìn)一步開(kāi)環(huán)聚合所得產(chǎn)品展現(xiàn)了明顯的聚己內(nèi)酯的特征峰(δHd=2.30 ppm,δHe=1.64 ppm,δHf=1.38 ppm,δHg=4.05 ppm),證明星形聚己內(nèi)酯化合物已經(jīng)被成功合成。根據(jù)譜圖分析,聚己內(nèi)酯末端連羥基的CH2(δHg)的化學(xué)位移在4.05 ppm,而每條己內(nèi)酯直鏈上的連氧原子的氫化學(xué)位移在3.64 ppm。因每條直鏈的末端僅有一個(gè)羥基,所以可以利用聚己內(nèi)酯末端連羥基的CH2(δHg)積分值與聚己內(nèi)酯末連氧原子的氫峰的積分值計(jì)算聚己內(nèi)酯的分子量[17]。
圖2 TPE-AM和TPE-PCL的核磁共振氫譜
圖3 5種不同分子量TPE-PCL的GPC曲線(xiàn)
為使后續(xù)的自組裝過(guò)程能夠良好地包裹功能納米粒子,同時(shí)降低組裝體的熒光性能,控制作為引發(fā)前體的TPE-AM與單體ε-CL的投料比,合成了分子量不同的5種星形聚己內(nèi)酯(5 K,10 K,15 K,20 K,25 K)。結(jié)合氫核磁共振譜的計(jì)算結(jié)果,GPC色譜分析5種產(chǎn)物的分子量及其分布如表1所示,且兩種技術(shù)分析的結(jié)果基本一致。5種星形聚己內(nèi)酯的分子量按投料量的增加從5.6K增長(zhǎng)至23.2K,基本接近反應(yīng)設(shè)計(jì)的理論分子量。5種不同分子量TPE-PCL的GPC曲線(xiàn)如圖3所示。由圖3可知,所有聚合物在色譜圖上表現(xiàn)為一個(gè)單峰。
表1 5種不同鏈長(zhǎng)的TPE-PCL分子量及分布
通過(guò)乙基黃原酸介導(dǎo)RAFT聚合將親水的PVP鏈段接入聚合物,控制星形聚己內(nèi)酯與NVP單體的投料量,進(jìn)而合成了10種兩嵌段鏈長(zhǎng)不同的雙親性星形聚合物。根據(jù)核磁共振氫譜分析,計(jì)算得到10種星形嵌段共聚物的分子量如表2所示。將這些共聚物分別有序地記作S1,S2,S3,…,S10,表2中顯示的分子量基本接近理論值且符合嵌段共聚物的鏈長(zhǎng)設(shè)計(jì)趨勢(shì)。
表2 10種不同嵌段長(zhǎng)度共聚物TPE-(PCL-b-PVP)的分子量
星形共聚物S8和S7的核磁共振氫譜如圖4所示。由圖4可知,聚己內(nèi)酯的部分特征峰(δHe=4.05 ppm)和聚乙烯基吡咯烷酮的部分特征峰(δHl+δHk=2.96~4.01 ppm),其余基團(tuán)的峰在1.3~2.54 ppm產(chǎn)生了堆積,充分證實(shí)了其嵌段共聚物的結(jié)構(gòu)。在已知聚己內(nèi)酯分子量的前提下,通過(guò)PVP的兩種甲基CH2(δHl)+CH(δHk)的總積分值與聚己內(nèi)酯末端連氧的CH2(δHe)積分值的比值能計(jì)算出TPE基雙親性星形聚合物的分子量。很明顯,圖4中嵌段共聚物S8的親水PVP鏈聚合度遠(yuǎn)大于聚合物S7上的對(duì)應(yīng)鏈段。
圖4 星形共聚物S8和S7的核磁共振氫譜
將星形兩親共聚物TPE-(PCL-b-PVP)溶于DMSO后,在超聲輔助下滴入去離子中得到透藍(lán)光的乳液,表明已組裝成高分子納米膠束。星形嵌段共聚物S8組裝所得納米膠束的透射電鏡圖片如圖5所示。由圖5可知,納米膠束規(guī)則的近球形的形貌、均勻的尺寸和良好的分散性,由對(duì)TEM結(jié)果中150個(gè)膠束進(jìn)行測(cè)算統(tǒng)計(jì)得其粒徑約為56.7 nm。調(diào)控星形共聚物疏水鏈段和親水鏈段的長(zhǎng)度,以獲得親疏水鏈長(zhǎng)不同的10種化合物,達(dá)到調(diào)控最終自組裝所得納米膠束尺寸的目的。因此,源自這10個(gè)星形嵌段共聚物的納米膠束水合粒徑如圖6所示。納米膠束的水合粒徑總體表現(xiàn)為隨疏水鏈段的增長(zhǎng)先增大后減小再增大。究其原因,在親水鏈段占優(yōu)勢(shì)時(shí),多臂嵌段聚合物在水中以單分子膠束形式存在,增加疏水鏈段長(zhǎng)度引起膠束聚集多分子化,持續(xù)增長(zhǎng)疏水鏈導(dǎo)致膠束內(nèi)核收縮降低粒徑,之后內(nèi)核因疏水鏈繼續(xù)堆積而增大膠束體積[18]。為后續(xù)包裹磁性顆粒用作生物標(biāo)記探針,選擇星形嵌段共聚物S8進(jìn)一步進(jìn)行膠束組裝并完成性能研究。
圖5 星形共聚物S8組裝的納米膠束TEM圖 圖6 不同星形共聚物組裝膠束的平均水合粒徑
利用溶劑熱法一步簡(jiǎn)單制備了磁性Fe3O4NPs,其XRD圖譜如圖7所示。納米顆粒的所有衍射特征峰都很好地匹配了Fe3O4標(biāo)準(zhǔn)衍射卡片數(shù)據(jù)(JCPDS No.19-0629)。而后,超聲輔助星形嵌段共聚物S8與Fe3O4NPs自組裝,形成了灰色乳液,即制得了雙功能納米膠束。根據(jù)雙功能納米膠束粉末的XRD圖譜,25°后的衍射峰位置和形狀與純Fe3O4NPs一樣,僅因復(fù)合膠束內(nèi)磁性顆粒量較少而令衍射峰強(qiáng)有所減弱。因此,證明磁性顆粒確實(shí)被組裝進(jìn)入了納米膠束而結(jié)構(gòu)未變。所得雙功能納米膠束的TEM圖如圖8所示。無(wú)機(jī)顆粒極高的電子密度讓人很容易觀察到其在膠束內(nèi)的位置。由圖8可知,納米膠束光滑的表面及球形結(jié)構(gòu),進(jìn)一步說(shuō)明磁性Fe3O4NPs被有效地組裝進(jìn)入納米膠束并生成了熒光磁性雙功能納米膠束。該納米膠束的水合粒徑約為365 nm,如圖9所示。聚合物鏈的干態(tài)收縮導(dǎo)致了DLS所得水合粒徑小于電鏡觀測(cè)的結(jié)果。
圖7 磁性Fe3O4 NPs和雙功能性納米膠束的XRD譜圖 圖8 雙功能性納米膠束的TEM圖
圖9 雙功能性納米膠束的水合粒徑分布
四苯基乙烯自身固有的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)賦予了雙功能納米膠束的熒光標(biāo)記性,故而必須考察小分子核及各種星形嵌段共聚物的納米膠束的光學(xué)性質(zhì)和發(fā)展趨勢(shì)。小分子TPE-AM溶于良溶劑DMSO中獲得澄清溶液,在410 nm處有一個(gè)弱的熒光發(fā)射峰。由聚合反應(yīng)得到的星形嵌段共聚物在不良溶劑中組裝,所得各種膠束粒子的熒光光譜如圖10所示。由圖10可知,隨著嵌段共聚物的生長(zhǎng)和組裝,聚集所得的發(fā)射波長(zhǎng)紅移至488 nm(主要是由連接苯的氨基形成酰胺鍵和聚己內(nèi)酯參與的堆積態(tài)等因素引起)。星形共聚物內(nèi)疏水鏈段的增長(zhǎng)導(dǎo)致苯環(huán)在納米膠束中內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限越來(lái)越嚴(yán)重,因而其熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸增大。星形聚合物的納米膠束液在白光和紫外光照下的情形如圖11所示。由圖11可知,星形共聚物納米膠束由白光轉(zhuǎn)到紫外光照射下,顯示出明亮的熒光發(fā)射,昭示著星形嵌段共聚物因聚集自組裝生成納米膠束的同時(shí)伴生了極強(qiáng)熒光發(fā)射。
圖10 等TPE濃度下各種熒光納米膠束及小分子的熒光光譜(λex=352 nm) 圖11 星形聚合物的納米膠束液在白光(左)和紫外光(右)照下的照片
如前所述,選擇星形共聚物S8與磁性Fe3O4NPs因自組裝得到雙功能納米膠束,其熒光光譜與純S8組裝的熒光納米膠束光譜對(duì)比如圖12所示。由圖12可知,相比于空的熒光納米膠束,雙功能納米膠束的熒光發(fā)射峰因磁性顆粒裹入而稍有紅移,位于500 nm處。雙功能納米膠束的發(fā)射峰強(qiáng)比空熒光納米膠束降低了35%,但不影響其生物成像的使用功能。另外,雙功能納米膠束的紫外光照?qǐng)D片顯示出其仍保留了較強(qiáng)的熒光亮度如圖13所示,進(jìn)一步證明了其作為雙功能成像材料的熒光特征。擁有磁共振成像造影功能的磁性從另一個(gè)角度賦予雙功能納米膠束生物成像功能,促使該納米膠束以高靈敏度優(yōu)勢(shì)在生物標(biāo)記領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛能。
圖12 星形聚合物濃度相等的熒光納米膠束與雙功能納米膠束的熒光光譜(λex=352 nm) 圖13 雙功能納米膠束在白光(左)和紫外光(右)照下的照片
研究采用ROP和RAFT協(xié)同聚合的方式成功合成了星形嵌段共聚物TPE-(PCL-b-PVP),通過(guò)控制反應(yīng)投料比調(diào)控了嵌段共聚物的親疏水兩個(gè)鏈段長(zhǎng)度和分子量。不同分子量星形共聚物自組裝獲得粒徑各異的納米膠束,且熒光強(qiáng)度隨疏水鏈段的增長(zhǎng)而增強(qiáng)。為利于后續(xù)材料的生物成像應(yīng)用,以形成最小粒徑膠束的星形共聚物與Fe3O4NPs自組裝成具有熒光和磁性能的高分子雙功能納米膠束,該膠束的水合粒徑為365 nm。雙功能膠束保持了TPE內(nèi)核的聚集發(fā)光性,磁性顆??梢杂糜谠鰪?qiáng)磁共振成像,且膠束表面的PVP鏈具有優(yōu)良的生物相容性,使所合成的雙功能納米膠束有望成為雙模態(tài)的高靈敏生物標(biāo)記和成像的優(yōu)秀應(yīng)用平臺(tái)。