汪大偉，趙 杰，唐紅進*

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，安徽 合肥 230601；2.安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

糖尿病是一種以高血糖為主要生理特征的代謝性疾病，主要分為1型糖尿病和2型糖尿病。前者由胰島素缺乏導(dǎo)致，約占糖尿病人群的5%～10%；后者主要由胰島素抵抗引起，是最常見的發(fā)病類型[1]。流行病學(xué)調(diào)查表明，糖尿病世界發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且伴隨出現(xiàn)多種嚴重的并發(fā)癥，如中風(fēng)、神經(jīng)系統(tǒng)性疾病、心血管類疾病和腎衰竭等[2]。

對于2型糖尿病，調(diào)控機體餐后高血糖是其主要的治療方向，而延遲或抑制機體內(nèi)碳水化合物的消化和吸收是重要途徑。因此，通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性來調(diào)控餐后血糖水平是當(dāng)前對于2型糖尿病治療的重要途徑[3-4]。α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)是一種膜結(jié)合蛋白，在生物體內(nèi)可將寡聚糖和雙糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，后者吸收進入血液，從而顯著性升高血糖水平。隨著對α-葡萄糖苷酶生理功能的認識不斷加深，其現(xiàn)已被確認為2型糖尿病治療的重要藥物靶點。因此，α-葡萄糖苷酶抑制劑在機體餐后控制和延緩碳水化合物的消化水解以及單糖吸收等方面有著非常重要的生理作用[5]。許多天然來源或化學(xué)合成的結(jié)構(gòu)新穎的α-葡萄糖苷酶抑制劑被篩選發(fā)現(xiàn)，有望開發(fā)成具有潛在成藥性的新型2型糖尿病治療藥物。當(dāng)前，臨床應(yīng)用的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要包括伏格列波糖(Voglibose)、米格列醇(Miglitol)、阿卡波糖(Acarbose)和1-脫氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin，DNJ)，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。但在治療過程中，常伴隨出現(xiàn)許多較為嚴重的不良反應(yīng)，如腸胃脹氣、腹痛、腹瀉、過敏及皮膚問題等[6-7]。因此，發(fā)現(xiàn)高效低毒的新型α-葡萄糖苷酶抑制劑對于糖尿病及其并發(fā)癥的治療具有重要的研究價值。

一直以來，天然產(chǎn)物都是藥物開發(fā)中藥物先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的重要源泉，并取得了豐碩的研究成果。臨床許多針對特定生物靶點的各類型疾病治療藥物都直接或間接來源于天然產(chǎn)物，如青蒿素、紫杉醇、石杉堿、嗎啡、托品烷類生物堿等藥物[8-10]。因此，基于中藥或天然產(chǎn)物尋找針對特定蛋白靶標的活性藥物先導(dǎo)物，具有極其重要的研究意義和開發(fā)價值。黃酮類化合物是非常重要的一類天然產(chǎn)物，廣泛存在于不同種類的植物中，尤其是中草藥、蔬菜和水果中。黃酮類物質(zhì)山奈酚(Kaempferol)被報道具有廣泛的生物學(xué)活性，如清除自由基、抗氧化、免疫抑制、抗病毒、抗腫瘤等作用[11-12]，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。近些年來，黃酮類活性分子已引起眾多研究者的研究興趣，很多針對特定生物靶點來尋找活性黃酮類化合物的研究工作被陸續(xù)展開。Zhang[13]等人綜合應(yīng)用多種光譜學(xué)方法探討了山奈酚與黃嘌呤氧化酶的相互作用機制，發(fā)現(xiàn)山奈酚通過占據(jù)該酶催化活性中心，與該酶形成復(fù)合物并誘使其二級結(jié)構(gòu)變化，從而發(fā)揮較好的酶抑制活性。結(jié)合前期實驗篩選結(jié)果，綜合應(yīng)用酶抑制動力學(xué)實驗、熒光光譜實驗和分子對接從酶分子水平探討了天然黃酮山奈酚與α-葡萄糖苷酶的相互作用機制，為以山奈酚為基礎(chǔ)的2型糖尿病藥物先導(dǎo)物開發(fā)提供參考。

圖1 臨床應(yīng)用α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 實驗材料

天然黃酮山奈酚(純度>99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；α-葡萄糖苷酶(從SaccharomycesCerevisiae中分離獲得)、底物4-硝基苯-α-D-葡吡喃糖苷和陽性對照藥DNJ(Sigma-Aldrich公司(USA))；其他化學(xué)試劑以及實驗用溶劑為分析純級，實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

(1)體外山奈酚對α-葡萄糖苷酶抑制實驗。工作液配制：α-葡萄糖苷酶用75 mM的磷酸緩沖液(PB，pH 7.4)配制為0.1 U/mL；山奈酚、陽性對照藥DNJ用DMSO溶解后配制為10 mM的工作液，實驗過程中用PB稀釋至所需濃度；反應(yīng)底物4-硝基苯-α-D-葡吡喃糖苷用PB配制為50 mM的母液。

實驗測定：在96孔板上分別加入樣品溶液100 μL和α-葡萄糖苷酶溶液50 μL，混合均勻后使用酶標儀(Thermo Multiskan Go V1.01.10，USA)于405 nm處記錄吸光度值，并于37 ℃孵育10 min。隨后，再向孔板中加入反應(yīng)底物4-硝基苯-α-D-葡吡喃糖苷(50 μL，1 mM)以啟動酶促反應(yīng)，繼續(xù)孵育20 min后，測定吸光度值。實驗過程中，用PB作為空白對照實驗組，DNJ作為陽性對照藥，并設(shè)置3組復(fù)孔。抑制率通過如下公式計算：

式中，C0和S0分別表示空白對照組和待測樣品組在0 min的吸光度值；C30和S30分別表示空白對照組和待測樣品組在30 min的吸光度值。通過測定獲得的山奈酚對α-葡萄糖苷酶的抑制率來計算半數(shù)抑制濃度(IC50)(GraphPad Prism V6.0.2)，IC50代表在所述實驗條件下，α-葡萄糖苷酶的活性被抑制50%時所需待測化合物的濃度。

(2)山奈酚對α-葡萄糖苷酶抑制的可逆性分析。將不同濃度的樣品溶液100 μL和α-葡萄糖苷酶溶液50 μL加入孔板中，混合均勻后置于37 ℃孵育10 min。隨后，加入反應(yīng)底物4-硝基苯-α-D-葡吡喃糖苷(50 μL，1 mM)，并于405 nm處每隔30 s讀數(shù)一次，共計入5 min內(nèi)的吸光度值。實驗過程中，設(shè)置空白對照組和3組復(fù)孔。以酶促動力學(xué)反應(yīng)速率(v，ΔA/min)對酶液濃度做圖，來判斷山奈酚對α-葡萄糖苷酶的抑制可逆性。

(3)山奈酚對α-葡萄糖苷酶的抑制類型分析。將不同濃度的樣品溶液100 μL和α-葡萄糖苷酶溶液(50 μL，0.1 U/mL)加入孔板中，混合均勻后置于37 ℃孵育10 min。隨后，再向孔板中加入反應(yīng)底物4-硝基苯-α-D-葡吡喃糖苷(母液50 mM，用PB稀釋至所需濃度)。于405 nm處每隔30 s讀數(shù)一次，共計入5 min內(nèi)的吸光度值。實驗過程中，設(shè)置空白對照組和3組復(fù)孔。使用酶促動力學(xué)反應(yīng)速率(v，ΔA/min)的倒數(shù)對不同濃度的底物4-硝基苯-α-D-葡吡喃糖苷的倒數(shù)來獲得Lineweaver-Burk plots雙倒數(shù)方程，以判斷山奈酚對α-葡萄糖苷酶的抑制反應(yīng)特性，并通過Dixon方程來判斷抑制常數(shù)Ki值。

(4)山奈酚介導(dǎo)的熒光光譜分析。使用Hitachi F-7000熒光分光光度計進行山奈酚介導(dǎo)下的α-葡萄糖苷酶熒光譜分析，激發(fā)光波長為280 nm，發(fā)射光波長范圍為300～500 nm，激發(fā)光和發(fā)射光狹縫寬度均為5 nm，配備150 W氙燈和1.0 cm四面光滑的石英比色皿，所有熒光實驗測定均在室溫下進行。同步熒光光譜的測定通過將激發(fā)光和發(fā)射光譜的波長差值(Δλ)設(shè)定為15 nm和60 nm，二者分別代表熒光發(fā)射基團酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)的熒光光譜學(xué)行為變化。取濃度為0.1 U/mL的α-葡萄糖苷酶酶液3.5 mL加入到比色皿中，再滴加山奈酚，混合均勻后靜置5 min，測定其熒光值，如此往復(fù)進行多次滴加并測定多個待測物濃度下的熒光值。山奈酚濃度點(曲線a→k)依次為0、8.56 μM、17.11 μM、25.65 μM、34.17 μM、42.67 μM、51.17 μM、59.64 μM、68.10 μM、76.55 μM、84.99 μM。山奈酚(曲線m)的熒光曲線測定濃度為5 μM。同時，設(shè)置空白對照(PB緩沖液)以在數(shù)據(jù)處理中扣除背景熒光值從而校正所測得的熒光密度。

(5)分子對接實驗。分子對接實驗通過分子計算模擬軟件AutoDock V4.2完成。α-葡萄糖苷酶/α-D-葡萄糖的蛋白晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：3A4A)從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫中獲得。山奈酚通過Chem3D繪制其分子結(jié)構(gòu)，并經(jīng)SYBYL X-2.0進行小分子能量最優(yōu)化處理。蛋白結(jié)構(gòu)經(jīng)過除水、加氫原子、加Gasteiger電荷和缺失殘基修補以準備擬對接的生物大分子。在進行Auto Grid之前設(shè)定Grid Box參數(shù)，x、y、z值均選定為60 ?，且中心設(shè)定為0.375 ?(Space Center)，使酶的活性催化中心被包含在所設(shè)定的盒子內(nèi)部。在進行AutoDock運算時，選擇拉馬克遺傳算法進行對接運算并設(shè)定100次(runs),其余的計算參數(shù)按照軟件默認值進行設(shè)定。根據(jù)對接構(gòu)象結(jié)果，結(jié)合簇類分析，自由能、氫鍵、疏水性的相互作用，范德華力等影響復(fù)合物構(gòu)象穩(wěn)定性的因素以探討山奈酚—α-葡萄糖苷酶的相互結(jié)合機制并制圖。

2 結(jié)果及分析

2.1 山奈酚對α-葡萄糖苷酶抑制活性的評價

通過體外酶抑制活性實驗來評價山奈酚對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，與陽性對照藥DNJ(IC50=9.87±0.34 μM)相比，隨著山奈酚濃度的不斷升高，對α-葡萄糖苷酶的抑制率也不斷增加，呈現(xiàn)出濃度依賴性，計算獲得的半數(shù)抑制濃度IC50為91.11±1.12 μM。體外酶抑制活性實驗數(shù)據(jù)表明，天然黃酮山奈酚是潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑，可作為2型糖尿病治療的藥物先導(dǎo)物，有待于進一步研究開發(fā)。

2.2 山奈酚對α-葡萄糖苷酶抑制可逆性的判斷

體外酶抑制可逆性評價試驗結(jié)果如圖3所示。在不同α-葡萄糖苷酶酶液濃度下，隨著山奈酚的濃度不斷增加，所有曲線均相交于原點位置，同時各條曲線的斜率呈現(xiàn)不斷降低的趨勢，由此表明該黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制效應(yīng)為可逆性抑制，否則為相交于X軸且斜率保持不變的平行曲線，即非可逆性抑制效應(yīng)。Zhang[14]等在探討天然黃酮木犀草素與α-葡萄糖苷酶相互作用機制時，發(fā)現(xiàn)木犀草素與α-葡萄糖苷酶之間也表現(xiàn)為類似的可逆性抑制作用。

圖2 山奈酚對α-葡萄糖苷酶抑制活性的評價 圖3 山奈酚對α-葡萄糖苷酶反應(yīng)速率的影響

2.3 山奈酚對α-葡萄糖苷酶抑制類型的分析

酶動力學(xué)抑制類型評價實驗測定結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，篩選得到的抑制劑山奈酚表現(xiàn)為非競爭性抑制劑，表明它可以和α-葡萄糖苷酶或α-葡萄糖苷酶—底物復(fù)合物結(jié)合。同時，根據(jù)Dixon作圖(1/v vs[kaempferol])得知，山奈酚和α-葡萄糖苷酶相互作用時的競爭性抑制常數(shù)Ki為20.10 μM。Zhang[14]等在探討天然黃酮木犀草素與α-葡萄糖苷酶相互作用機制時，發(fā)現(xiàn)木犀草素與α-葡萄糖苷酶之間也表現(xiàn)為類似的非競爭性抑制作用。

圖4 山奈酚對α-葡萄糖苷酶抑制類型Lineweaver-Burk plots的分析

2.4 山奈酚對α-葡萄糖苷酶的熒光譜分析

山奈酚介導(dǎo)下α-葡萄糖苷酶熒光淬滅譜分析如圖5a所示。隨著山奈酚濃度的不斷增加，α-葡萄糖苷酶的內(nèi)置熒光值不斷降低(a→k)，表明山奈酚可以與α-葡萄糖苷酶結(jié)合并發(fā)生相互作用，且顯著猝滅山奈酚的內(nèi)置基團熒光(主要為熒光發(fā)射團：芳香氨酸殘基Tyr、Trp、Phe)。Zhang[13]等發(fā)現(xiàn)山奈酚在與黃嘌呤氧化酶相互作用過程中也表現(xiàn)出類似的熒光淬滅效應(yīng)。此外，在不同Δλ值、山奈酚介導(dǎo)下，α-葡萄糖苷酶同步熒光譜分析如圖5b、圖5c所示。當(dāng)Δλ=15 nm時，在山奈酚的介導(dǎo)下，α-葡萄糖苷酶的熒光發(fā)射基團Tyr的熒光密度由290 nm藍移到285 nm處，表明殘基Tyr周圍的微環(huán)境疏水性增加，極性降低。當(dāng)Δλ=60 nm時，在山奈酚的介導(dǎo)下，隨著濃度不斷增加，α-葡萄糖苷酶的熒光發(fā)射基團Trp的熒光密度由280 nm紅移到284 nm處，表明殘基Trp周圍的微環(huán)境疏水性降低，極性增加。山奈酚介導(dǎo)下α-葡萄糖苷酶同步熒光譜RSFQ值分析如圖5d所示。由圖5d可知，氨基酸殘基Tyr、Trp的RFSQ(%)趨于非常接近，表明山奈酚在酶活性中心處與氨基酸殘基Tyr、Trp在空間上距離較為相近，二者對α-葡萄糖苷酶的內(nèi)置熒光效應(yīng)呈現(xiàn)相似的貢獻。同時，從同步熒光光譜還可以發(fā)現(xiàn)，隨著化合物濃度不斷增加，α-葡萄糖苷酶的內(nèi)置熒光密度不斷降低。由此可以得知，山奈酚可以與α-葡萄糖苷酶直接結(jié)合并發(fā)生相互作用，誘導(dǎo)其酶的二級結(jié)構(gòu)變化，從而表現(xiàn)出潛在的抑制效應(yīng)，并淬滅其內(nèi)置熒光。

2.5 分子對接模擬

α-葡萄糖苷酶由一條亞基(589個氨基酸)組成，蛋白晶體結(jié)構(gòu)分辨率為1.6 ?。在對接實驗中，根據(jù)分子對接結(jié)果中的結(jié)合自由能(Free Binding Energy)分析確定，化合物與α-葡萄糖苷酶結(jié)合自由能最低的構(gòu)象，即為最優(yōu)勢結(jié)合構(gòu)象，并對其做進一步相互作用分析。分子對接簇類分析結(jié)果如圖6a所示，共產(chǎn)生6類構(gòu)象簇(42/100，紅色條標記)，山奈酚與α-葡萄糖苷酶結(jié)合自由能為-6.64 kcal/mol。山奈酚在α-葡萄糖苷酶活性口袋處的結(jié)合構(gòu)象如圖6b所示，其活性位點主要由氨基酸殘基Lys156、Tyr158、Phe159、His280、Asp307、Pro312、Leu313、Phe314、Arg315、Tyr316、Glu411、Asn415組成。山奈酚在α-葡萄糖苷酶活性結(jié)合位點處的相互作用分析如圖6c所示。山奈酚與α-葡萄糖苷酶相互作用過程中，分別與氨基酸殘基Tyr158(2.19 ?)、Pro312(1.96 ?)、Arg315(2.20 ?)、Asn415(1.85 ?)之間共形成了4根氫鍵作用。而且，還可以觀察到山奈酚結(jié)構(gòu)中的芳香環(huán)與殘基Phe314、Tyr316的芳香環(huán)以face-to-edge的方式形成了π-π相互作用。此外，由對接結(jié)果還可得知，山奈酚與α-葡萄糖苷酶之間存在疏水性相互作用，如殘基Tyr158、Phe314、Tyr316、Asn415等。

山奈酚和α-葡萄糖苷酶的分子對接結(jié)果如表1所示。綜上可以看出，小分子抑制劑與α-葡萄糖苷酶之間形成的氫鍵、疏水性相互作用以及范德華力等非共價鍵作用力的存在對于維系蛋白受體—配體復(fù)合物構(gòu)象的穩(wěn)定和小分子對酶的抑制效應(yīng)發(fā)揮著非常重要作用。

圖5 山奈酚介導(dǎo)下α-葡萄糖苷酶熒光淬滅譜、同步熒光譜、RSFQ值分析

圖6 山奈酚與α-葡萄糖苷酶分子結(jié)合構(gòu)象的簇類分析結(jié)果、山奈酚在α-葡萄糖苷酶活性口袋處的結(jié)合構(gòu)象以及結(jié)合位點處的相互作用分析

3 結(jié)論

綜上所述，天然產(chǎn)物山奈酚表現(xiàn)出潛在的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50值為91.11±1.12 μM。山奈酚通過非競爭性且可逆性抑制α-葡萄糖苷酶，并呈現(xiàn)濃度依賴性。同時，結(jié)合熒光淬滅光譜和二維熒光譜分析，通過分子對接分析山奈酚—α-葡萄糖苷酶結(jié)合構(gòu)象可以推斷，山奈酚能夠與底物競爭性結(jié)合于α-葡萄糖苷酶的活性中心。如果山奈酚濃度較低，則酶活性被輕度抑制。隨著山奈酚濃度不斷增加，抑制劑山奈酚可能通過誘導(dǎo)酶二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生變化，阻止底物進入活性位點，從而表現(xiàn)出潛在的酶抑制效應(yīng)。因此，天然產(chǎn)物山奈酚可作為新型α-葡萄糖苷酶抑制劑的備選化合物，用于2型糖尿病及其并發(fā)癥藥物先導(dǎo)物進行后續(xù)研究。

表1 山奈酚和α-葡萄糖苷酶的分子對接結(jié)果