王慶高，何亞州，李麗娟，黃彩依，黃景偉，梁 珊

microRNA(miRNA)是一種小型的非編碼區(qū)RNA，具有極強(qiáng)的生物活性，目前認(rèn)為其能特異性地與mRNA結(jié)合從而影響轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)水平[1]。從miRNA被發(fā)現(xiàn)至今，人類對其的探索已有十余年，足夠多的證據(jù)表明miRNA廣泛地參與到細(xì)胞增殖、凋亡、器官的形成與發(fā)育等生理過程及腫瘤生長、靶器官損害等病理過程[2-3]，miRNA的發(fā)現(xiàn)給人類對疾病的診斷及治療提供了新的方法。但盡管經(jīng)過多年的研究，仍有大量miRNA的功能尚未被挖掘，相關(guān)的作用機(jī)制也未得到徹底的闡明，故miRNA仍是一個值得深入探究的巨大寶庫。本研究基于GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫，通過篩選在CHF中差異表達(dá)的miRNA，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測其靶基因并結(jié)合Gene Ontology(GO)及KEGG通路分析，探討差異表達(dá)的miRNA在CHF中生物信息學(xué)價值，為日后研究miRNA調(diào)控CHF的機(jī)制提供前期基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 資料 GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是目前面向社會公開的、最大的高通量分子豐度數(shù)據(jù)庫，其儲存了大量的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。通過該數(shù)據(jù)庫用戶可以檢索、上傳或是下載高通量基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)，并通過數(shù)據(jù)分析找到某個領(lǐng)域內(nèi)差異表達(dá)的基因。

R語言是一種免費(fèi)、開源的工作語言，通過加載種類繁多的軟件包賦予了R強(qiáng)大的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及數(shù)據(jù)分析功能。Bioconductor的Limma為目前主流的基因分析軟件包，利用該軟件包可對基因數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、背景矯正、差異基因篩選等處理，為后續(xù)分析奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

Targetscan(www.targetscan.org/)、miRPathDB(https://mpd.bioinf.uni-sb.de/overview.html)數(shù)據(jù)庫，提供來自人類、大鼠、小鼠miRNA 的預(yù)測信息和經(jīng)過驗(yàn)證的位于其靶基因上的結(jié)合位點(diǎn)，在數(shù)據(jù)庫中直接檢索miRNA名稱后在結(jié)果頁面即可得到預(yù)測結(jié)果。

Cytoscape是一個可以將基因高通量表達(dá)數(shù)據(jù)及其分子相互作用整合成一個可視化網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的開源多功能圖形可視化軟件，通過現(xiàn)有的基因表達(dá)信息可直觀地觀察生物分子間的關(guān)聯(lián)性。BinGO(Biological Networks Gene Ontology tool)為CytoScape的功能插件，其可讓宿主軟件鏈接至GO數(shù)據(jù)庫，實(shí)現(xiàn)GO注釋及富集分析，并構(gòu)建層次網(wǎng)絡(luò)圖。

David(http://david.abcc.ncifcrf．gov/)數(shù)據(jù)庫是一個綜合性數(shù)據(jù)庫，包含了生物學(xué)數(shù)據(jù)及其分析工具，并為基因或蛋白提供了系統(tǒng)的生物功能注釋。通過將基因列表或基因序號上傳后在數(shù)據(jù)庫中可實(shí)現(xiàn)靶基因的功能富集、通路富集。

1.2 方法

1.2.1 篩選差異表達(dá)miRNA 進(jìn)入GEO數(shù)據(jù)庫將檢索平臺的主要對象設(shè)定為miRNA芯片。檢索與CHF相關(guān)的數(shù)據(jù)集，查看相關(guān)數(shù)據(jù)集的介紹，以miRNA在CHF病人及健康對照組中的表達(dá)分析為標(biāo)準(zhǔn)篩選出適合的數(shù)據(jù)集納入分析，下載數(shù)據(jù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。運(yùn)行R語言(版本3.4.0)，加載Bioconductor 的 Limma軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及差異基因的篩選。

老太太猜得沒錯，她剛剛走，思蓉和思遠(yuǎn)就到。與老太太不同的是，思蓉并沒有旁敲側(cè)擊，而是直奔主題。念蓉說：“我與楚墨有些無聊，正好替你救救場子?！彼既貑柍骸斑@是誰的主意？”楚墨說：“當(dāng)然是親愛的念蓉?！彼既卣f：“救場子也不必說自己的老公有外遇??！你可以說……”

1.2.2 miRNA的靶基因預(yù)測 利用miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫Targetscan、miRPathDB查詢miRNA的預(yù)測靶基因，所得結(jié)果以Excel文件下載至本地。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入R，利用intersect命令代碼取兩數(shù)據(jù)庫結(jié)果的交集。

1.2.3 Gene Ontology、KEGG通路富集分析 進(jìn)入GO官網(wǎng)(http://www.geneontology.org/)，下載最新版本的GO功能分類信息及人類基因注釋信息。將所得靶基因列表上傳至Cytoscpe的BinGO插件中，在GO功能分類文件、GO注釋文件選項(xiàng)上分別導(dǎo)入上述下載文件，根據(jù)需求選擇Biological process(生物學(xué)過程)、Cellular component(細(xì)胞組分)、Molecular function(分子功能)后點(diǎn)擊運(yùn)行，Bingo將開始進(jìn)行分析并生成結(jié)果及層次網(wǎng)絡(luò)圖。

應(yīng)用David數(shù)據(jù)庫，對預(yù)測靶基因進(jìn)行人類物種識別，在數(shù)據(jù)庫頁面中勾選“Functinal Annotation Tool”作為分析工具后進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 在GO 分析中采用超幾何分布計(jì)算P值，以P<0.05為界值。KEGG 通路分析中采用Fisher精確概率法計(jì)算，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)集結(jié)果 在GEO數(shù)據(jù)庫中共檢索出5個與CHF相關(guān)的研究，經(jīng)過篩選后選擇數(shù)據(jù)集GSE104150進(jìn)行分析，該數(shù)據(jù)集共有樣本16個，其中包括9個CHF病理樣本，7個健康對照樣本，每個樣本包含2 570個miRNA檢測數(shù)據(jù)。

2.2 差異基因篩選 對16個樣本的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因處理，將所得結(jié)果繪制火山圖(見圖1)。經(jīng)過Limma包差異miRNA篩選后，得到185個差異表達(dá)miRNA，取Top20繪制熱圖(見圖2)。芯片分析結(jié)果顯示miR-197在CHF樣本中明顯上調(diào)，結(jié)合目前現(xiàn)有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)miR-197已被報(bào)道與心肌梗死等心血管疾病相關(guān)，故推測其對CHF的發(fā)生、發(fā)展有一定影響，因此，選擇miR-197其作為進(jìn)一步分析的對象，miR-197表達(dá)情況見圖3。

注：綠色為下調(diào)基因，紅色為上調(diào)基因。

圖3 miR-197在GSE104150數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況

2.3 miR-197的靶基因 Targetscan、miRPathDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因數(shù)目及兩數(shù)據(jù)庫取交集結(jié)果見圖4。

圖4 miR-197靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測基因數(shù)及交集數(shù)

2.4 GO分析 針對上述2 408個預(yù)測靶基因進(jìn)行GO 注釋、富集分析。共得到1 712個基因的GO生物學(xué)功能注釋信息、1 577個基因GO細(xì)胞組分注釋信息以及1 656個基因的GO分子功能注釋信息。將這些靶基因分別投射至GO生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、分子功能上，結(jié)果顯示miR-197的預(yù)測靶基因集合分別富集在生物調(diào)控、基因表達(dá)、RNA生物合成等生物學(xué)過程，細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞核等細(xì)胞組分上以及離子結(jié)合、核苷酸結(jié)合等分子功能中，所得結(jié)果以靶基因富集數(shù)量從高到低排序，取Top10及P<0.05的結(jié)果見表1～表3，制作生物學(xué)過程網(wǎng)絡(luò)層次圖(見圖5)。

表1 miR-197預(yù)測靶基因GO生物學(xué)過程分類

表2 miR-197預(yù)測靶基因GO細(xì)胞組分分類

表3 miR-197預(yù)測靶基因GO分子功能分類

注：分子大小代表基因數(shù)量的多少；顏色深淺代表P值大小。

2.5 KEGG通路富集分析 miR-197的靶基因在KEGG通路富集分析上共得到1 023基因的富集結(jié)果，取Top10且P<0.05的結(jié)果見表4。

表4 miR-197預(yù)測靶基因KEGG通路數(shù)據(jù)庫富集分析結(jié)果

3 討 論

3.1 miR-197與CHF病因的相關(guān)性 目前認(rèn)為CHF的常見病因主要有原發(fā)性心肌損害、心臟負(fù)荷過重兩大類，其中原發(fā)性心肌損害包括：①缺血性心肌損害；②心肌炎、心肌病；③心肌代謝性疾病。而miR-197與上述因素相關(guān)的研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，如Petaki等在研究心肌梗死的miRNA標(biāo)志物時發(fā)現(xiàn)miR-197與心肌梗死的進(jìn)展密切相關(guān)[4]。Schulte等[5]進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn)miR-197與miR-126、miR-223一起參與到血小板活化和血管內(nèi)炎癥的調(diào)控中，對冠心病等心肌缺血疾病具有潛在的預(yù)測價值。在與代謝類心肌疾病相關(guān)因素的研究中，Zampetaki等[6]證實(shí)miR-197在2型糖尿病中明顯上調(diào)，猜測其可能與糖尿病的發(fā)生或糖代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)。Mcmanus等[7]研究發(fā)現(xiàn)miR-197與心血管代謝疾病相關(guān)，其或許通過調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子在疾病風(fēng)險中發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-197的靶基因雖然在GO生物學(xué)過程中主要富集于生物學(xué)調(diào)控、基因表達(dá)調(diào)控等方面。但仍有多數(shù)基因富集于如心臟生長發(fā)育、平滑肌的發(fā)育與增殖、電解質(zhì)代謝等與心肌功能關(guān)聯(lián)的生理過程中，而KEGG通路富集結(jié)果顯示miR-197的靶基因也顯著富集于Wnt、Hippo信號通路以及心律失常性右室心肌病(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy，ARVC)等與CHF相關(guān)的信號通路中，miR-197或許在CHF進(jìn)程中發(fā)揮一定的作用。

3.2 基于KEGG結(jié)果的相關(guān)通路分析

3.2.1 Wnt信號通路 Wnt通路是一條多元復(fù)雜的信號通路，在器官發(fā)育、調(diào)控組織形態(tài)等生理過程中發(fā)揮重要作用。散亂蛋白(Dvl)是Wnt通路需要激活的下游蛋白，研究證實(shí)Dvl在心肌肥厚中有著重要的介導(dǎo)作用。Malekar等[8]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將小鼠體內(nèi)的Dvl過表達(dá)后發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的心肌肥厚。核質(zhì)穿梭蛋白(Dprl)則是Wnt信號通路的組成部分，其與Dvl相結(jié)合后可激活wnt/β-catenin信號通路誘導(dǎo)心肌肥厚[9]，而抑制Dprl則可以顯著阻止心肌肥厚的進(jìn)程[10]。另一方面，目前已有足夠多的證據(jù)顯示，經(jīng)典或是非經(jīng)典的Wnt通路都與CHF心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[11-13]，miR-197與Wnt通路間的關(guān)系有待進(jìn)一步挖掘。

3.2.2 Hippo信號通路 Hippo通路是近年來發(fā)現(xiàn)的相對保守的一條通路，其同樣在器官的生長、細(xì)胞的增殖與凋亡上發(fā)揮顯著調(diào)控作用。有報(bào)道顯示，Hippo通路也廣泛地參與CHF[14]。Heallen等[15]研究發(fā)現(xiàn)Hippo通路能與Wnt通路相互協(xié)作，調(diào)控心肌細(xì)胞增殖及心臟大小。Leach等[16]研究也發(fā)現(xiàn)Hippo信號通路能夠阻止心肌細(xì)胞的再生，通過沉默Hippo信號通路的活性后能夠有效促進(jìn)心臟功能并逆轉(zhuǎn)重度心力衰竭。

3.2.3 鈣信號傳導(dǎo)通路(calcium signaling pathway) 鈣信號傳導(dǎo)通路對心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有重要作用，研究顯示，心肌的收縮與舒張功能受到Ca2+濃度的影響及控制，心肌梗死后心室重塑及心力衰竭中心肌功能異常的主要原因與Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙密切相關(guān)，心肌缺血后心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載可直接引起心肌細(xì)胞的凋亡[17-18]。

綜上所述，miR-197的靶基因在生物學(xué)過程及生物信號通路中富集在與CHF關(guān)系密切的因素上，miR-197或許對CHF的發(fā)生、發(fā)展有潛在作用。值得關(guān)注的是，根據(jù)GO的富集結(jié)果，miR-197的靶基因也同樣富集于囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)、細(xì)胞旁分泌等外泌體相關(guān)的模塊上，或許其可以通過外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)從而對CHF發(fā)揮調(diào)控作用，未來有望進(jìn)一步探索與研究。

4 小 結(jié)

miRNA從被發(fā)現(xiàn)至今就已逐步成為研究熱點(diǎn)之一，有報(bào)道顯示，miRNA參與調(diào)解蛋白編碼的基因數(shù)約占人類基因總數(shù)的三分之一。而目前已有足夠多的證據(jù)表明，miRNA通過調(diào)節(jié)其下游靶基因的表達(dá)水平廣泛地參與生理及病理等生命活動。迄今為止，雖然人類對miRNA的探索已頗具成果，可仍有大量的miRNA在許多領(lǐng)域的潛能未被挖掘，而利用高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫及生物信息學(xué)分析能有效地篩選出特定條件下差異表達(dá)的miRNA，并快速地預(yù)測出其潛在靶基因以及明確miRNA與靶基因的相互作用關(guān)系，對miRNA生物學(xué)功能的研究具有重要的臨床價值。