張 毅，魏緒旺，許 康，張 昭，薛瑤瑤，范天祥

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡是造成ICH后神經(jīng)功能障礙的根本原因[1]。目前修復(fù)神經(jīng)方面的藥物多為腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，只能保護(hù)未受損的神經(jīng)細(xì)胞，缺少直接促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)增殖的藥物。研究證實(shí)，海馬區(qū)存在NSCs，ICH后海馬區(qū)域產(chǎn)生的新生神經(jīng)元可以遷移到腦損傷區(qū)域，有效改善神經(jīng)功能缺損[2]。而海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生的過程主要包括NSCs的增殖、分化以及遷移，這一過程受到Notch信號(hào)的調(diào)控，Notch信號(hào)通路在腦損傷時(shí)被激活，參與ICH后的神經(jīng)再生與修復(fù)過程[3]。補(bǔ)腎填精益髓方源于劉完素《黃帝素問宣明論方》中的地黃飲子，研究證實(shí)地黃飲子能夠促進(jìn)NSCs增殖分化，并改善其神經(jīng)功能[4-5]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立ICH大鼠模型，基于Notch信號(hào)通路灌服補(bǔ)腎填精益髓方，觀察ICH大鼠Bederson神經(jīng)功能評(píng)分、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)/神經(jīng)元核抗原(NeuN)陽性細(xì)胞數(shù)、Notch-1蛋白表達(dá)變化，探討補(bǔ)腎填精益髓法對(duì)ICH大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及Notch-1蛋白表達(dá)的影響，明確其具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用健康SD大鼠126只，體重200～250 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK，陜2017-003，購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房，室溫度維持在22 ℃左右，室內(nèi)濕度維持在30%～40%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 10%水合氯醛(上海運(yùn)佳黃埔制藥)、0.5%碘伏消毒液(規(guī)格為每瓶100 mL)、單唾酸神經(jīng)節(jié)苷脂注射液(北京賽升藥業(yè)股份有限公司)、0.9%氯化鈉注射液(廣東艾希德藥業(yè)有限公司)、γ-分泌酶抑制劑(DAPT，武漢博士德生物工程有限公司)。補(bǔ)腎填精益髓方組成：熟地黃15 g，山茱萸15 g，肉蓯蓉10 g，巴戟天10 g，炮附子6 g，肉桂12 g，石斛12 g，麥冬12 g，石菖蒲10 g，遠(yuǎn)志10 g，茯苓10 g，生姜3片，大棗5枚。由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑室提供，符合2015年版《中國藥典》規(guī)范，按人與動(dòng)物體重劑量折算表進(jìn)行濃縮，煎藥濃縮成生藥濃度為1.54 g/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 Anti-β-catenin抗體(ABCAM公司)、多聚體抗兔IgG-HRP(ABCAM公司)、免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、Notch-1抗體(武漢博士德生物工程有限公司)、BrdU抗體(武漢博士德生物工程有限公司)、Anti-NeuN Antibody(武漢博士德生物工程有限公司)、正常山羊血清(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(深圳永年科技公司)，TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)(儀征市康福醫(yī)療器材有限公司)、BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)(上海珂淮儀器有限公司)，PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(型號(hào)：XLCU-PHY-Ⅲ庫號(hào))，數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)，圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0(美國Media Cybernetics公司)。

1.5 方法

1.5.1 ICH大鼠動(dòng)物模型的建立 參考韓佳煒等[6]ICH大鼠模型制作技巧，采用自體尾動(dòng)脈血注血法制作ICH模型。用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g腹腔麻醉大鼠，仰臥固定在立體定位儀上，使大鼠的前后囟處于同一水平；沿頭皮正中切一長約10 mm切口，參照大鼠立體定位圖譜，定位前囟前0.2 mm，中線右偏3 mm，微量注射器垂直進(jìn)針約5.5 mm，到達(dá)右側(cè)大鼠尾殼核區(qū)，小型牙科鉆顱骨穿透至硬腦膜處；尾動(dòng)脈抽取非肝素抗凝自體動(dòng)脈血進(jìn)針至尾狀核區(qū)，緩慢注入50 μL，2 min內(nèi)勻速注入，緩慢將注射器完全退出，局部醫(yī)用骨蠟封閉，皮膚縫合，尾部切口加壓包扎，創(chuàng)傷處用碘伏消毒，并噴以青霉素以防感染。假手術(shù)組只做刺入動(dòng)作，不穿透硬腦膜，不向腦內(nèi)注血，余同對(duì)照組。

1.5.2 分組及給藥方法 取造模成功大鼠120只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、神經(jīng)節(jié)苷脂組、補(bǔ)腎填精益髓組、DAPT組，另設(shè)空白組6只，作為參照，總共126只。各組均于造模后次日灌胃。補(bǔ)腎填精益髓組：以補(bǔ)腎填精益髓方湯劑按1.54 mL/(kg·d)灌胃，每日2次，連續(xù)給藥28 d；神經(jīng)節(jié)苷脂組：按30 mg/(kg·d)給予神經(jīng)節(jié)苷脂注射液；模型組、假手術(shù)組：給予等體積無菌蒸餾水，自由飲食、活動(dòng)； DAPT組：造模成功后，腹腔注射DAPT 10 mg/(kg·d)。各組分別在第3天、第7天、第14天、第28天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，在處死大鼠前24 h，腹腔注射BrdU 50 mg/(kg·d)，之后處死動(dòng)物取材。

1.5.3 切片制作、尼氏染色、免疫組化檢測(cè) 于造模后第3天、第7天、第14天、第28天將每組BrdU標(biāo)記的6只大鼠進(jìn)行處死，4%多聚甲醛灌注取腦，冰凍切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，切片厚18 μm。取大腦左側(cè)海馬組織平面，胰蛋白酶修復(fù)15 min，2 mol/L的HCl 37 ℃孵育30 min，5%羊血清室溫封閉30 min，加入Rabbi Anti-NeuN antibody(1∶100)，Rabbit Anti-Neun antibody(1∶100)，4 ℃冰箱孵育過夜，復(fù)溫30 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗5 min×3次，免疫組化檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，每張切片隨機(jī)選取海馬區(qū)5個(gè)400倍高倍鏡視野，NeuN共染色雙標(biāo)陽性細(xì)胞，代表了新生NSCs，記錄BrdU/NeuN陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5.4 Bederson神經(jīng)功能評(píng)分及Notch-1蛋白表達(dá) 分別在造模成功后第3天、第7天、第14天、第28天進(jìn)行Bederson神經(jīng)功能評(píng)分[7]，采用Werstern Bcot法測(cè)定Notch-1蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 病理學(xué)改變 模型組細(xì)胞壞死程度最嚴(yán)重，可見大部分細(xì)胞壞死、溶解、核濃縮，壞死細(xì)胞融合，邊界不清；補(bǔ)腎填精益髓組、神經(jīng)節(jié)苷脂組較模型組、DAPT組細(xì)胞壞死程度輕，神經(jīng)節(jié)苷脂組可見部分細(xì)胞核固縮，少量細(xì)胞核溶解，胞質(zhì)液化，邊界較模糊；補(bǔ)腎填精益髓組細(xì)胞核完整，胞質(zhì)淡染，核仁清晰，細(xì)胞與間質(zhì)界限清楚。詳見圖1。

注：①為假手術(shù)組；②為模型組第7天；③為模型組第14天；④為神經(jīng)節(jié)苷脂組第7天；⑤為神經(jīng)節(jié)苷脂組第14天；⑥為補(bǔ)腎填精益髓組第7天；⑦為補(bǔ)腎填精益髓組第14天；⑧為DAPT組第7天；⑨為DAPT組第14天。各用藥組在第7天、第14天最典型，所以切片圖取第7天、第14天結(jié)果。

2.2 BrdU/NeuN雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)比較 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，模型組、假手術(shù)組、DAPT組大鼠海馬區(qū)均可見BrdU/NeuN雙標(biāo)陽性細(xì)胞表達(dá)，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后第7天、第14天、第28天，補(bǔ)腎填精益髓組BrdU/NeuN雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)均高于假手術(shù)組、模型組、神經(jīng)節(jié)苷脂組和DAPT組(P<0.01)；神經(jīng)節(jié)苷脂組BrdU/NeuN雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)均高于模型組和DAPT組(P<0.01)，低于假手術(shù)組(P>0.05)；而在術(shù)后第7天、第14天，補(bǔ)腎填精益髓組BrdU/NeuN 雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)高于神經(jīng)節(jié)苷脂組，且達(dá)到高峰(P<0.01)，隨后均呈下降趨勢(shì)。詳見圖2、表1。

注：①為假手術(shù)組；②為模型組第7天；③為模型組第14天；④為神經(jīng)節(jié)苷脂組第7天；⑤為神經(jīng)節(jié)苷脂組第14天；⑥為補(bǔ)腎填精益髓組第7天；⑦為補(bǔ)腎填精益髓組第14天；⑧為DAPT組第7天；⑨為DAPT組第14天。各用藥組在第7天、第14天最典型，所以切片圖取第7天、第14天結(jié)果。

表1 各組ICH大鼠海馬區(qū)BrdU/Neun表達(dá)(±s)

與假手術(shù)組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01；與DAPT組比較，③P<0.01；與神經(jīng)節(jié)苷脂組比較，④P<0.01；與同組第3天時(shí)比較，⑤P<0.01。

2.3 Bederson神經(jīng)功能評(píng)分 假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)Bederson神經(jīng)功能評(píng)分均為0分；DAPT組各時(shí)間點(diǎn)Bederson神經(jīng)功能評(píng)分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組在第14天、第28天Bederson神經(jīng)功能評(píng)分低于第3天、第7天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；術(shù)后第7天、第14天、第28天，補(bǔ)腎填精益髓組、神經(jīng)節(jié)苷脂組Bederson評(píng)分均低于第3天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。術(shù)后第7天、第14天，補(bǔ)腎填精益髓組大鼠Bederson神經(jīng)功能評(píng)分較模型組、神經(jīng)節(jié)苷脂組、DAPT組改善明顯(P<0.01)，至術(shù)后第28天Bederson神經(jīng)功能評(píng)分基本降至正常。詳見表2。

表2 各組Bederson神經(jīng)功能評(píng)分比較(±s) 單位：分

與模型組比較，①P<0.01；與DAPT組比較，②P<0.01；與神經(jīng)節(jié)苷脂組比較，③P<0.01；與同組第3天時(shí)比較，④P<0.01；與同組第7天時(shí)比較，⑤P<0.01。

2.4 各組大鼠海馬區(qū)出血灶周圍Notch-1蛋白表達(dá) 術(shù)后各時(shí)間，模型組、假手術(shù)組、DAPT組大鼠海馬區(qū)均可見Notch-1蛋白表達(dá)，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后第7天、第14天、第28天，補(bǔ)腎填精益髓組、神經(jīng)節(jié)苷脂組、DAPT組Notch-1蛋白表達(dá)均高于模型組和假手術(shù)組(P<0.01)；而在術(shù)后第7天、第14天，補(bǔ)腎填精益髓組Notch-1蛋白表達(dá)高于神經(jīng)節(jié)苷脂組，且達(dá)到高峰(P<0.01)，隨后均呈下降趨勢(shì)。詳見表3、圖3。

表3 各組大鼠海馬區(qū)出血灶周圍Notch-1蛋白表達(dá)(±s)

與假手術(shù)組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01；與DAPT組比較，③P<0.01；與神經(jīng)節(jié)苷脂組比較，④P<0.01；與同組第3天時(shí)比較，⑤P<0.01。

圖3 ICH大鼠海馬區(qū)Notch-1蛋白表達(dá)

3 討 論

ICH后大量神經(jīng)細(xì)胞受損帶來神經(jīng)功能缺損和病人死亡，給病人家庭及社會(huì)帶來了沉重負(fù)擔(dān)。如何減輕出血后繼發(fā)性腦損害是ICH治療的根本。目前出血性腦卒中主要的病理損害為血腫灶周圍凝血酶原釋放大量的炎性因子引起腦組織腫脹，導(dǎo)致繼發(fā)性神經(jīng)元損傷[8]。因此，ICH的治療重點(diǎn)在于促進(jìn)血腫吸收、降低血腫灶周圍的炎性水平、降低神經(jīng)細(xì)胞損傷、恢復(fù)腦功能。在治療過程中如何恢復(fù)大腦神經(jīng)元和最大限度地挽救腦細(xì)胞，恢復(fù)腦組織功能是目前研究的重點(diǎn)。

Notch信號(hào)通路首次由Ronald從胎鼠中提取出了NSCs，后來被證實(shí)可以調(diào)控NSCs的增殖與分化，Notch主要表達(dá)在胚胎期和成年期小鼠大腦的海馬區(qū)和室管膜區(qū)。研究提示，當(dāng)活化Notch信號(hào)后，可以有效地促進(jìn)小鼠海馬NSCs的增殖。而當(dāng)Notch信號(hào)被外界因素干預(yù)受到抑制后，海馬中的NSCs數(shù)量明顯會(huì)降低[9]。在正常生理狀態(tài)下，Notch信號(hào)通路靶基因Notch蛋白始終恒定在相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)水平，維持NSCs的數(shù)量。在病理環(huán)境下(如衰老、腦卒中、腦損傷)均會(huì)影響Notch的表達(dá)水平，進(jìn)而影響NSCs的數(shù)量和海馬神經(jīng)發(fā)生[10]。Notch主要是通過調(diào)控NSCs的分裂方式來決定NSCs的命運(yùn)。當(dāng)Notch信號(hào)通路下端NICD的靶基因Notch-1蛋白過表達(dá)，NSCs水平分裂的能力也明顯增高，促進(jìn)機(jī)體組織內(nèi)的NSCs數(shù)量保持穩(wěn)定和促進(jìn)新的NSCs產(chǎn)生[11]。DAPT是Notch信號(hào)通路抑制劑，研究證實(shí)當(dāng)DAPT抑制了Notch信號(hào)通路后損傷灶周誘導(dǎo)的Notch1和Hes1表達(dá)以及細(xì)胞增殖顯著下降，ICH灶周圍NSCs增殖明顯減少，神經(jīng)損傷癥狀改善不明顯[12]。

補(bǔ)腎填精益髓方源于地黃飲子，屬于滋補(bǔ)腎陰、補(bǔ)腎助陽開竅化痰之劑，對(duì)中風(fēng)舌強(qiáng)喑痱、肢體偏癱、痰多難咳具有很好的效果。古代醫(yī)家劉完素認(rèn)為中風(fēng)之喑痱證主要是因腎精不足、腎氣虧損之足廢不能用，喑痱不能言。此方從古至今一直是治療中風(fēng)之名方，已取得了較好的臨床效果。前期研究表明，地黃飲子不但可以改善大鼠記憶力、延緩衰老、抑制氧化損傷，保護(hù)神經(jīng)功能，而且可以促進(jìn)NSCs增殖，特別是在治療中風(fēng)、阿爾茨海默病方面具有很好的臨床效果[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，熟地黃、肉蓯蓉、巴戟天等提取物均有抗氧化、延緩衰老、改善記憶力、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用，其作用機(jī)制為通過提高病理組織區(qū)域的BDNF的表達(dá)，抑制Bax的過表達(dá)和降低Bcl-2表達(dá)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，在預(yù)定的時(shí)間段給予補(bǔ)腎填精益髓方灌胃，能提高大鼠ICH灶周圍NSCs的數(shù)量。第7天、第14天時(shí)，NSCs數(shù)量達(dá)到高峰，隨后呈下降趨勢(shì)。其中補(bǔ)腎填精益髓組NSCs數(shù)量增加最明顯；補(bǔ)腎填精益髓組NSCs數(shù)量高于神經(jīng)節(jié)苷脂組。各組各時(shí)間點(diǎn)均可見Notch-1蛋白表達(dá)，補(bǔ)腎填精益髓組和神經(jīng)節(jié)苷脂組Notch-1蛋白表達(dá)增加最顯著；且補(bǔ)腎填精益髓組較神經(jīng)節(jié)苷脂組Notch-1蛋白表達(dá)更顯著。從病理結(jié)果來看，補(bǔ)腎填精益髓組、神經(jīng)節(jié)苷脂組細(xì)胞壞死程度較模型組、DAPT組輕，神經(jīng)節(jié)苷脂組可見部分細(xì)胞核固縮，少量細(xì)胞核溶解，胞質(zhì)液化，邊界較模糊；補(bǔ)腎填精益髓組細(xì)胞核完整，胞質(zhì)淡染，核仁清晰，細(xì)胞與間質(zhì)界限清楚。說明補(bǔ)腎填精益髓法促進(jìn)ICH大鼠內(nèi)源性NSCs增殖并可以改善ICH大鼠神經(jīng)功能，其機(jī)制可能與Notch信號(hào)通路調(diào)控其下游靶基因Notch-1蛋白上調(diào)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過DAPT抑制Notch信號(hào)通路后NSCs及Notch-1蛋白表達(dá)不顯著，且BrdU/Neun陽性細(xì)胞數(shù)增長均不顯著，通過對(duì)比DAPT組及神經(jīng)節(jié)苷脂組進(jìn)一步印證了補(bǔ)腎填精益髓法促進(jìn)ICH大鼠內(nèi)源性NSCs增殖，并且其促進(jìn)NSCs增殖過程中有Notch信號(hào)通路介導(dǎo)。研究證實(shí)神經(jīng)節(jié)苷脂可以促進(jìn)外源性NSCs增殖分化，神經(jīng)節(jié)苷脂可以有效保護(hù)腦神經(jīng)，改善其神經(jīng)功能缺損癥狀[15]。但從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，神經(jīng)節(jié)苷脂在促進(jìn)內(nèi)源性NSCs增殖分化方面并不顯著，但可以在一定程度上改善ICH大鼠神經(jīng)功能，其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，補(bǔ)腎填精益髓法能夠促進(jìn)ICH大鼠神經(jīng)細(xì)胞再生，其作用機(jī)制可能與補(bǔ)腎填精益髓方誘導(dǎo)Notch信號(hào)通路NICD下游靶基因Notch-1蛋白表達(dá)有關(guān)。